کھلے Hv1 پروٹون چینل کے انٹرسوبونٹ انٹرفیس کی تفتیش ایک الوسٹریکل طور پر جوڑے ہوئے تحقیقات کے ساتھ

Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اس میں CSS کے لیے محدود سپورٹ ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کریں)۔ اس دوران، یقینی بنانے کے لیے۔ مسلسل سپورٹ، ہم سائٹ کو اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے بغیر ڈسپلے کریں گے۔
Hv1 وولٹیج گیٹڈ پروٹون چینل ایک ڈائمرک کمپلیکس ہے جو دو وولٹیج سینسنگ ڈومینز (VSDs) پر مشتمل ہے، جن میں سے ہر ایک گیٹڈ پروٹون پرمییشن پاتھ وے پر مشتمل ہے۔ ڈائمرائزیشن کو سائٹوپلاسمک کوائلڈ کوائل ڈومین کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ بند حالت سے منتقلی دونوں VSDs میں کھلی حالت تعاون کے ساتھ واقع ہوتی ہے۔ تاہم، بنیادی میکانزم کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ تاہم، کھلے Hv1 چینلز میں اس طرح کے انٹرفیس کی شناخت نہیں کی گئی ہے۔ یہاں ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ 2-guanidinothiazole مشتق دو Hv1 VSDs کو کوآپریٹو طریقے سے روکتے ہیں اور ان مرکبات میں سے ایک کو کھلے ذیلی یونٹوں کے درمیان اللوسٹرک کپلنگ کے لیے ایک پروب کے طور پر استعمال کرتے ہیں۔ VSD کے پہلے ٹرانس میبرین فریگمنٹ کا اختتام ایک انٹرسوبونٹ انٹرفیس بناتا ہے جو بائنڈنگ سائٹس کے درمیان کپلنگ میں ثالثی کرتا ہے، جبکہ coiled-coil ڈومین اس عمل میں براہ راست شامل نہیں ہوتا ہے۔ ہمیں اس بات کے پختہ ثبوت بھی ملے ہیں کہ چینل کا پروٹون سلیکٹیو فلٹر بلاکر بائنڈنگ کوآپریٹیوٹی کو کنٹرول کرتا ہے۔ .
وولٹیج گیٹڈ پروٹون چینلز فائٹوپلانکٹن سے لے کر انسانوں تک مختلف جانداروں میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ زیادہ تر خلیوں میں، یہ چینلز پروٹون جھلی سے پروٹون کے اخراج میں ثالثی کرتے ہیں اور NADPH آکسیڈیز کی سرگرمی کو منظم کرتے ہیں۔ انسانوں میں واحد معروف وولٹیج گیٹڈ پروٹون چینل ہے۔ Hv1 ہے، جو HVCN1 gene2,3.Hv1 (عرف VSOP) کی پیداوار ہے B سیل کے پھیلاؤ4 میں ایک کردار ادا کرتا ہے، پیدائشی مدافعتی نظام کے ذریعے رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی پیداوار5,6,7,8، سپرم سیل حرکت پذیری9 اور ایئر وے کی سطح کے سیال کا پی ایچ ریگولیشن10۔ یہ چینل کینسر کی متعدد اقسام میں شامل ہے جیسے B-cell malignancies 4,11 اور چھاتی اور کولوریکٹل کینسر 12,13۔ حد سے زیادہ Hv1 سرگرمی کینسر کے خلیوں کی میٹاسٹیٹک صلاحیت کو بڑھاتی ہے 11, 12۔ دماغ میں Hv1 کا اظہار ہوتا ہے۔ مائکروگلیہ کے ذریعہ، اور اسکیمک اسٹروک کے ماڈلز میں اس کی سرگرمی دماغی نقصان کو بڑھاتی دکھائی گئی ہے۔
Hv1 پروٹین ایک وولٹیج سینسنگ ڈومین (VSD) پر مشتمل ہوتا ہے، جو S1 سے S414 کہلانے والے چار ٹرانس میمبرین حصوں پر مشتمل ہوتا ہے۔ VSD وولٹیج گیٹڈ Na+، K+ اور Ca2+ چینلز کے متعلقہ ڈومینز اور وولٹیج سے حساس فاسفیٹس جیسے سی وی ایس پی سے مشابہت رکھتا ہے۔ Ciona gutis15. ان دیگر پروٹینز میں، S4 کا C-ٹرمینس ایک اثر ماڈیول، pore domain یا enzyme سے منسلک ہوتا ہے۔ Hv1 میں، S4 کوائلڈ کوائل ڈومین (CCD) سے جوڑا جاتا ہے جو جھلی کے سائٹوپلاسمک سائیڈ پر واقع ہوتا ہے۔ .چینل ایک ڈائمرک کمپلیکس ہے جو دو VSDs پر مشتمل ہے، ہر ایک گیٹڈ پروٹون پرمییشن پاتھ وے پر مشتمل ہے 16,17,18۔ یہ دو Hv1 ذیلی یونٹس کوآپریٹو طور پر 19,20,21,22 کو کھولتے ہوئے پائے گئے ہیں، جو تجویز کرتے ہیں کہ اللوسٹرک کپلنگ اور انٹر سبونیٹ تعاملات چلتے ہیں۔ گیٹنگ کے عمل میں ایک اہم کردار۔ کوائلڈ کوائل ڈومین کے اندر ذیلی یونٹس کے درمیان انٹرفیس کی اچھی طرح وضاحت کی گئی ہے کیونکہ دو الگ تھلگ ڈومینز کے کرسٹل ڈھانچے دستیاب ہیں 22,23۔ دوسری طرف، جھلی کے اندر VSDs کے درمیان انٹرفیس نہیں ہے۔ اچھی طرح سے سمجھا جاتا ہے۔ Hv1-CiVSP chimeric پروٹین کا کرسٹل ڈھانچہ اس انٹرفیس کے بارے میں معلومات فراہم نہیں کرتا ہے، کیونکہ کرسٹلائزڈ چینل کمپلیکس کی trimeric تنظیم کا نتیجہ مقامی Hv1 CCD کو خمیر لیوسین زپر GCN424 کے ذریعے تبدیل کرنے سے ہو سکتا ہے۔
Hv1 چینل کی ذیلی تنظیم کے ایک حالیہ مطالعے سے یہ نتیجہ اخذ کیا گیا ہے کہ دو S4 ہیلائسز ثانوی ڈھانچے میں شدید خلل کے بغیر CCD میں منتقل ہوتی ہیں، جس کے نتیجے میں لمبی ہیلیکس جھلی سے شروع ہوتی ہیں اور سائٹوپلازم میں پروجیکٹ کرتی ہیں۔ سسٹین کراس لنکنگ تجزیہ کی بنیاد پر، یہ مطالعہ تجویز کرتا ہے کہ Hv1 VSDs S4 طبقہ کے ساتھ ایک دوسرے سے رابطہ کرتے ہیں۔ تاہم، دیگر مطالعات نے VSDs کے درمیان متبادل انٹرفیس تجویز کیے ہیں۔ ان انٹرفیس میں S1 سیگمنٹ 17، 21، 26 اور S2 سیگمنٹ 21 کے بیرونی سرے شامل ہیں۔ متصادم ہونے کی ایک ممکنہ وجہ ان مطالعات کے نتائج یہ ہیں کہ گیٹنگ کے عمل کے سلسلے میں VSDs کے درمیان اللوسٹرک کپلنگ کی جانچ کی گئی، جو بند اور کھلی ریاستوں پر منحصر ہے، اور VSDs کے درمیان انٹرفیس مختلف حالتوں میں تبدیلیوں میں مختلف ہو سکتا ہے۔
یہاں، ہم نے پایا کہ 2-guanidinothiazole Hv1 چینلز کو ہم آہنگی سے دو کھلے VSDs سے منسلک کرکے روکتا ہے، اور کھلی حالت میں ذیلی یونٹس کے درمیان تعامل کی تحقیقات کے لیے مرکبات میں سے ایک، 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) کا استعمال کیا۔ انٹرفیس۔ ہم نے پایا کہ GBTA بائنڈنگ وکر کو ایک مقداری ماڈل کے ذریعے اچھی طرح سے بیان کیا جا سکتا ہے جس میں ایک انحیبیٹر کو ایک ذیلی یونٹ سے باندھنے کے نتیجے میں ملحقہ ذیلی یونٹ کی بائنڈنگ وابستگی میں اضافہ ہوتا ہے۔ ہم نے یہ بھی پایا کہ باقیات D112، سلیکٹیوٹی فلٹرز چینل 27، 28 اور گوانیڈائن ڈیریویٹیو بائنڈنگ سائٹ کا حصہ 29 کنٹرول GBTA بائنڈنگ کوآپریٹوٹی۔ ہم دکھاتے ہیں کہ کوآپریٹو بائنڈنگ کو Hv1 dimer میں برقرار رکھا جاتا ہے، جہاں CCD S4 سیگمنٹ سے الگ ہوتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ CCD میں انٹرسوبونٹ انٹرفیس براہ راست نہیں ہوتا ہے۔ GBTA- بائنڈنگ سائٹس کے درمیان اللوسٹرک کپلنگ میں ثالثی کریں۔ اس کے برعکس، ہم نے پایا کہ S1 کا ٹکڑا ذیلی یونٹس کے درمیان انٹرفیس کا حصہ ہے اور اس کی اجازت دینے کے لیے ڈائمر کے مرکز سے دور S4 ہیلکس کے ایکسٹرا سیلولر سرے کے ساتھ ملحقہ VSDs کا انتظام تجویز کرتا ہے۔ S1 کا ٹکڑا کھلی حالت میں ہونا چاہیے۔
Hv1 کے چھوٹے مالیکیول انحیبیٹرز اینٹی کینسر دوائیوں اور نیورو پروٹیکٹو ایجنٹوں کے طور پر کارآمد ہیں۔ تاہم، آج تک، چند مرکبات چینل30,31,32,33 کو روکنے میں کامیاب ہوئے ہیں۔ ان میں سے، 2-guanidinobenzimidazole (2GBI، مرکب [1] تصویر میں۔ . پہلے Hv1 کو تقریباً 2GBI کی طرح مؤثر طریقے سے روکنے کے لیے دکھایا گیا تھا جب 200 μM (شکل 1b) کے ارتکاز پر ٹیسٹ کیا گیا تھا۔ متن) ہم نے چار تھیازول مشتقات (GBTA اور مرکبات [3]، [6] اور [11]، تصویر 1c) کے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط کا تعین کیا اور پایا کہ وہ 2GBI کے مقابلے میں زیادہ تیز تھے۔ تھیازول مشتقات کی حد 1.109 ± 0.040 سے لے کر 1.306 ± 0.033 (تصویر 2) تک ہے۔ 1c اور ضمنی تصویر۔ 1۔ اس کے برعکس، 2GBI کے لیے ہل کا گتانک 0.975 ± 0.024 29، تصویر 2a اور ضمنی تصویر۔ 1۔ 1 سے اوپر کا پہاڑی گتانک بائنڈنگ کوآپریٹوٹی کی نشاندہی کرتا ہے۔ کیونکہ ہر ایک کی اپنی Hv1 ذیلی یا ذیلی بٹ ہے۔ بائنڈنگ سائٹ،29,32 ہم نے استدلال کیا کہ تھیازول ڈیریویٹیو کو ایک ذیلی یونٹ کے ساتھ بائنڈنگ کرنے سے ملحقہ سبونائٹ سے دوسرے انحیبیٹر مالیکیول کی بائنڈنگ میں اضافہ ہو سکتا ہے۔ جی بی ٹی اے سب سے زیادہ ہل گتانک کے ساتھ ٹیسٹ کمپاؤنڈ تھا۔ اس لیے، ہم نے اس کمپاؤنڈ کا انتخاب کیا بائنڈنگ ہم آہنگی کے طریقہ کار کا مزید مطالعہ کیا اور 2 جی بی آئی کو ایک حوالہ منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا۔
(a) ٹیسٹ مرکبات: [1] حوالہ Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI)۔ 2-guanidino-benzothiazole (GBTA)، [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine، [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -گوانیڈائن، [5](4-میتھائل-1,3-تھیازول-2-ی ایل)گوانیڈائن، [6](5-برومو-4-میتھائل-1,3-تھیازول-2-ایل)گوانیڈائن، [7] famotidine، [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate، [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine، [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine. .Hv1 پروٹون کرنٹ کو -80 mV سے +120 mV تک رکھنے کی صلاحیت سے depolarization کے جواب میں Xenopus oocytes کے اندر سے باہر کی تختیوں میں ماپا گیا تھا۔ ہر روکنے والے کو 200 μM.pHi = pHo = 6.0 کے ارتکاز میں غسل میں شامل کیا گیا تھا۔ ڈیٹا کا مطلب ہے ±SEM (n≥4)۔ (c) مرکبات [2]، [3]، [6] اور [11] کے ذریعہ انسانی Hv1 کی ارتکاز پر منحصر روکنا۔ ہر نقطہ 3 کی اوسط روک تھام ± SD کی نمائندگی کرتا ہے۔ 15 پیمائش تک۔ لائن ایک ہل فٹ ہے جو ضمنی جدول 1 میں بتائی گئی ظاہری Kd اقدار کو حاصل کرنے کے لیے استعمال کی جاتی ہے۔ پہاڑی کوفیشینٹس کا تعین ضمنی شکل 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033، h(3) = 1.25 ± 0.07، h(6) = 1.109 ± 0.040، h (11) = 1.179 ± 0.036 (طریقے دیکھیں)۔
(a,b) مرکبات 2GBI اور GBTA نے dimeric اور monomeric Hv1 کو ارتکاز پر منحصر انداز میں روکا ہے۔ ہر نقطہ 3 سے 8 پیمائشوں کے اوسط روکنا ± SD کی نمائندگی کرتا ہے اور وکر ایک پہاڑی فٹ ہے۔ انسیٹ ہسٹوگرامس کا تعین ضمنی انجیر 3 اور 4 میں بتائے گئے فٹ سے کیا گیا تھا۔ (a) میں دکھایا گیا GBTA کا ارتکاز ردعمل وہی ہے جیسا کہ تصویر 1c میں دکھایا گیا ہے۔ Kd کی ظاہری اقدار کے لیے ضمنی جدول 1 دیکھیں۔ (c) کی ماڈلنگ GBTA کی dimeric Hv1 سے کوآپریٹو بائنڈنگ۔ ٹھوس سیاہ لکیر تجرباتی اعداد و شمار کے مطابق مساوات (6) کی نمائندگی کرتی ہے، جو کہ (d) میں دکھائے گئے بائنڈنگ ماڈل کو بیان کرتی ہے۔ سب 1 اور سب 2 کے لیبل والی ڈیشڈ لائنیں بائیمولیکولر ایسوسی ایشن کی نمائندگی کرتی ہیں۔ بالترتیب پہلے اور دوسرے بائنڈنگ واقعات کے منقطع توازن کے منحنی خطوط (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM؛ ذیلی 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ۔ ہائی وابستگی کی حالت میں نیلے رنگ۔ GBTA کے monomeric Hv1 کے پابند ہونے کے لیے، رد عمل کے لیے انحطاط مستقل: O° + B ⇄ B° Kd1 اور Kd2 کے درمیان ہے، لیکن بعد کے قریب ہے (سرمئی نیلی پٹیاں اعتدال پسند تعلق کی نشاندہی کرتی ہیں)۔
Hv1 چینلز کو ان کے N- اور C-ٹرمینل سائٹوپلاسمک ڈومینز کو Ciona Intestinalis وولٹیج-حساس فاسفیٹیس CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 کے متعلقہ حصوں سے بدل کر مونومرائز کیا جا سکتا ہے۔ ان کا موازنہ dimeric channel (wild-type) inhibition (تصویر 2a,b) سے کیا۔ ہم نے پایا کہ دونوں مرکبات کے درمیان بائنڈنگ تعاون میں فرق کو مونومیرک Hv1 میں ختم کر دیا گیا تھا، اس وضاحت کی حمایت کرتے ہوئے کہ GBTA ایک ذیلی یونٹ کے ساتھ بائنڈنگ کو بڑھاتا ہے۔ روک تھام کرنے والے کے لیے دوسرے ذیلی یونٹ کا تعلق۔ ہم نے استدلال کیا کہ ایک Hv1 ذیلی یونٹ سے GBTA کا پابند ہونا بائنڈنگ سائٹ (fit35 کو شامل کرنے) کی دوبارہ ترتیب کا باعث بن سکتا ہے، جو ملحقہ ذیلی یونٹ کی خالی بائنڈنگ سائٹ کی دوبارہ ترتیب کو متحرک کرے گا، جس سے بائنڈنگ میں اضافہ ہو گا۔ تعلق
چینل پر GBTA کی کوآپریٹو بائنڈنگ کو مقداری طور پر بیان کرنے کے لیے، ہم نے ایک ماڈل استعمال کیا جس میں یا تو subunit پہلے inhibitor molecule کو ایک dissociation constant Kd1 (تصویر 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*) کے ساتھ ایک bmolecular ردعمل کے بعد باندھ سکتا ہے۔ بائنڈنگ چینل کو ایک ایسی حالت کو اپنانے کا سبب بنتی ہے جس میں باقی خالی ذیلی یونٹس انحیبیٹر کے ساتھ جڑ جاتے ہیں ایک انوکھے بائیمولیکولر رد عمل کے بعد انحطاط مستقل Kd2 کے ساتھ، جہاں Kd2 شکل 2c میں ٹھوس سیاہ لکیر ماڈل کی مساوات کے تجرباتی ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط پر فٹ ہے، جس سے ~290 μM کا Kd1 اور ~29 μM کا Kd2 حاصل ہوتا ہے (طریقوں کا سیکشن، مساوات (6))۔ ماڈل بھی بیان کرتا ہے۔ 2GBI کی بائنڈنگ، جہاں Kd2 ≈ Kd1 = Kd (تصویر 2d)۔ مونومیرک Hv1 میں، صرف ایک بائنڈنگ سائٹ اور ایک Kdm (O° + B ⇆ B°) ہے۔ GBTA کے معاملے میں، Kdm تقریباً 54 ہے۔ μM، جو Kd2 (تصویر 2d) سے زیادہ Kd1 سے ملتا جلتا ہے۔ دوسرے لفظوں میں، مونومر کی بائنڈنگ سائٹ ایک کنفیگریشن (O°) میں ہے جو کم سے زیادہ اعلی تعلق والی حالت (BO*) سے ملتی جلتی ہے۔ ڈائمر کی وابستگی کی حالت (OO)، غالباً ذیلی یونٹس کے درمیان انٹرفیس کے خاتمے کی وجہ سے۔
جیسا کہ پہلے 2GBI32 کے لیے دکھایا گیا ہے، ہم نے پایا کہ GBTA نے Hv1 کرنٹ کو دبایا جب چینل کھلا تھا تو اسے کھولنا مشکل بنانے کی بجائے بلاک کر کے (ضمنی شکل 2a,b,d)۔ جھلی کے دوبارہ پولرائزیشن کے جواب میں، لیکن یہ رجحان GBTA (ضمنی شکل 2c) میں نہیں دیکھا گیا۔ 2GBI کی موجودگی میں Hv1 کے غیر فعال ہونے کی صورت میں، ہر ذیلی یونٹ میں دروازے اس وقت تک بند نہیں ہو سکتے جب تک کہ بلاکر بائنڈنگ سائٹ سے باہر نہ نکل جائے۔ foot gate” میکانزم)، اور 2GBI بند گیٹس کے مقابلے میں آہستہ سے انبائنڈ کرتا ہے۔ اگر ایک Hv1 سبونائٹ کو بلاک اور بند کر دیا جاتا ہے، جب کہ ملحقہ سبونائٹ بلاک رہتا ہے، بقیہ 2GBI مالیکیولز کا ان بائنڈنگ سست ہو جاتا ہے (بلاکر کیپچر)۔ طویل عرصے تک چلنے والی چینل کی اقسام۔ صرف ایک بلاک شدہ ذیلی یونٹ بند ہونے سے پہلے عارضی طور پر پروٹون کو چلاتا ہے اور آہستہ آہستہ زوال پذیر دم بہاؤ میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔
یہ پتہ لگانا کہ GBTA (ضمنی شکل 2c) کی موجودگی میں Hv1 ٹیل کرنٹ کی خرابی نمایاں طور پر سست نہیں ہوئی تھی اس بلاکر (تصویر 2d) کے لیے ایک ہم آہنگی بائنڈنگ میکانزم سے مطابقت رکھتی ہے۔ ایک بار جب ایک GBTA مالیکیول Hv1 سبونائٹ سے غیر پابند ہو جاتا ہے۔ ، ملحقہ ذیلی یونٹ سے بلاکر کی وابستگی تقریباً 10 گنا کم ہو جاتی ہے، جو ان بائنڈنگ کے عمل کے حق میں ہے۔ اس کا مطلب ہے کہ GBTA کے دوسرے مالیکیول کے چینل میں پھنس جانے سے پہلے اس کے کھلنے کا بہت زیادہ امکان ہوتا ہے۔ طویل عرصے تک چلنے والی چینل کی انواع صرف ایک بلاکنگ سبونائٹ پیدا کرنے کی توقع ہے کہ GBTA کی موجودگی میں 2GBI کی موجودگی کے مقابلے میں بہت زیادہ ہوں گے، جس کے نتیجے میں دم کا کرنٹ تیزی سے خراب ہو گا۔
GBTA کے لیے دونوں Hv1 ذیلی یونٹس کے ساتھ تعاون کے ساتھ پابند ہونے کے لیے، بائنڈنگ سائٹس کو الوسٹرک طور پر جوڑا جانا چاہیے۔ ہر بائنڈنگ سائٹ کو اس قابل ہونا چاہیے: 1) ایسے واقعات کی ایک زنجیر کو متحرک کرنا جو روکنے والے سے منسلک ملحقہ ذیلی یونٹس کے ساتھ بات چیت کرتے ہیں، اور 2) ثالثی کم وابستگی سے اعلی وابستگی بائنڈنگ کی طرف منتقلی۔ ہم نے استدلال کیا کہ اگر بائنڈنگ سائٹ کے اندر مخصوص باقیات نے کوآپریٹو عمل میں حصہ ڈالا تو ان کے تغیر کو Hv1.Residues D112, F150 کے GBTA کی روک تھام کے ارتکاز ردعمل وکر کے ہل کوفیینٹ کو تبدیل کرنا چاہئے۔ , S181 اور R211 کو پہلے 2GBI29 بائنڈنگ ماحول کا حصہ دکھایا گیا تھا اور ہم نے قیاس کیا کہ وہ اسی طرح GBTA بائنڈنگ میں شامل ہوں گے (تصویر 3A)۔ ہم نے اتپریورتی چینلز D112E, F150A, S1811 کے لیے GBTA کے روکے ہوئے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط کی پیمائش کی۔ , اور R211S (شکل 3) اور اپنے پہاڑی گتانکوں کا موازنہ Hv1 جنگلی قسم کے لوگوں سے کیا، 2GBI کو بطور حوالہ استعمال کرتے ہوئے۔ باقیات V109 S1 حصے کے اسی چہرے پر D112 کی طرح ہے اور سیل کے اندر ایک اضافی ہیلیکل موڑ ہے۔ V109 2GBI29 کے بائنڈنگ میں شامل نہیں تھا، ہم نے V109A اتپریورتی کو بطور کنٹرول استعمال کیا (تصویر 2)۔ 3b)۔
(a) تجویز کردہ Hv1 کی باقیات جو guanidine derivative binding میں شامل ہیں۔ ڈیشڈ نیلے رنگ کے منحنی خطوط پہلے سے مجوزہ سائیڈ چینز سے گھرے ہوئے ہیں جو کمپاؤنڈ 2GBI29 کے مختلف حصوں کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔ گہرا سرخ۔ ہر نقطہ منفی کنٹرول کے طور پر 3 سے 12 پیمائشوں ± SD V109 کی اوسط روک کو ظاہر کرتا ہے۔ منحنی خطوط ہل فٹ ہوتے ہیں جو ظاہری Kd قدروں کو حاصل کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں (ضمنی جدول 1 دیکھیں)۔ پہاڑی عدد (h) میں دکھایا گیا ہے۔ انسیٹ ہسٹوگرامس کا تعین ضمنی انجیر 3 اور 4 میں بتائے گئے فٹ سے کیا گیا تھا۔ Hv1 WT کے لیے حوالہ h اقدار کو ڈیشڈ لائنوں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ ستارے اتپریورتی اور WT حصئوں کے درمیان اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p ہم نے پایا کہ D112E اتپریورتن نے ہل کے قابلیت کو نمایاں طور پر کم کیا (p یہ پتہ لگانا کہ GBTA بائنڈنگ کے لیے ہل کا گتانک Hv1 dimer میں 1 سے زیادہ ہے اور monomeric چینل (تصویر 2b) میں ~1 ہو جاتا ہے دو ذیلی یونٹس میں بائنڈنگ سائٹس کے درمیان اللوسٹرک تعاملات کے وجود سے مطابقت رکھتا ہے۔ اگر یہ ہے کیس میں، GBTA کا ہل کوفیشینٹ ڈائمر کے ساتھ بائنڈنگ جس پر بلاکر ایک ذیلی یونٹ کا پابند ہے ~1 ہونا چاہیے۔ ہم نے اس پیشین گوئی کو Hv1 F150A-WT سے منسلک ڈائمر (تصویر 4a) میں جانچا، جہاں F150A کا تعلق GBTA کے لیے subunit WT subunit (Figs. 1c اور 3d) کے مقابلے میں 2 آرڈرز کی شدت سے زیادہ تھا۔ پھر ہم نے 2 μM GBTA کے بنیادی ارتکاز پر WT سبونائٹ کی روک تھام کے لیے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط کی پیمائش کی۔ ، بلاکر سے F150A سبونائٹ کے تقریباً 99% اور WT سبونِٹ کے (a) F150A-WT جنکشن ڈائمر کا اسکیمیٹک ڈایاگرام جو بلاکنگ ہیمی چینل ({F150A}b-WT/BAO*) پیدا کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ سفید ہیرے اتپریورتن کا مقام ظاہر کرتے ہیں۔ BAO* اور BA*B* ریاستوں میں، توقع ہے کہ F150A سبونائٹ کا تعلق WT سبونائٹ سے زیادہ ہوگا۔ .گرے نشانات روکنے والے کی غیر موجودگی میں ناپے جانے والے کرنٹ کی نمائندگی کرتے ہیں۔ بلیک ٹریس (کنٹرول) 2 μM GBTA کے اضافے کے بعد ماپا جانے والے کرنٹ کی نمائندگی کرتا ہے۔ ({F150A}b-WT)۔ جی بی ٹی اے کے ارتکاز میں مزید اضافے کے نتیجے میں ڈبلیو ٹی سبونائٹ (نارنجی اور سرخ نشانات) میں رکاوٹ پیدا ہوئی۔ F150A ذیلی یونٹ۔ ہر نقطہ 3 سے 7 پیمائشوں کے درمیانی رکاوٹ ± SD کی نمائندگی کرتا ہے۔ منحنی خطوط وہ ہل فٹ تھے جو ضمنی جدول 1 میں بتائی گئی واضح Kd اقدار کو حاصل کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ انسیٹ ہسٹوگرام میں دکھائے گئے ہل کے کوفیشینٹس کا تعین سپلیمنٹری انجیر 3 اور 4 میں درج کردہ فٹ سے کیا گیا تھا۔ Hv1 WT کی h اقدار ہیں ڈیشڈ لائنوں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ ستارے WT dimer Hv1 (p چونکہ Hv1 کے GBTA کی روک تھام کو اوپن چینل میں ماپا گیا تھا، ہم نے استدلال کیا کہ GBTA بائنڈنگ تعاون کو کھلی حالت میں انٹرسوبونٹ کپلنگ کے طریقہ کار کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ دونوں Hv1 ذیلی یونٹس کو پہلے تعاون کے ساتھ 19,20,21، 22 اور گیٹنگ میں شامل انٹرسوبونٹ کپلنگ کو سائٹوپلاسمک کوائلڈ کوائل ڈومین (CCD) 22,25 کے ذریعے ثالثی کرنے کی تجویز پیش کی گئی تھی۔ اس لیے، ہم نے پوچھا کہ کیا کھلی حالت میں GBTA بائنڈنگ سائٹس کے درمیان جوڑے میں CCD بھی شامل ہے۔ ٹرائیگلیسین S4 ٹرانس میبرن فریگمنٹ اور کوائلڈ کوائل ڈومین کے درمیان انٹرفیس میں ہونے والے تغیرات کو پہلے کے مطالعے میں دکھایا گیا تھا تاکہ اس ڈومین کو بقیہ چینل سے ڈیکپل کیا جا سکے اور dimerization کی سالمیت کو برقرار رکھا جا سکے۔ اس لیے، ہم نے تغیرات V220G، K221G اور T222G (تصویر 1) کے اثر کا تجربہ کیا۔ 5a، GGG mutant) GBTA بائنڈنگ کوآپریٹیوٹی پر۔ ہمیں جنگلی قسم (تصویر 5c) کے مقابلے میں GBTA بائنڈنگ کے ہل گتانک میں شماریاتی طور پر معمولی (p > 0.05) کمی محسوس ہوئی۔ دو ذیلی یونٹس ایک ساتھ اہم ہیں، لیکن CCD براہ راست GBTA بائنڈنگ سائٹس کے درمیان انٹرسوبونٹ اللوسٹرک کپلنگ میں ثالثی نہیں کرتا ہے۔
(a) S4 کے اندرونی سرے پر ٹرائیگلائسین اتپریورتن کے ساتھ Hv1 ڈائمر کا اسکیمیٹک خاکہ جو سائٹوپلاسمک کوائلڈ کوائل ڈومین (نیلے تیر) کے ذریعے ثالثی انٹرسوبونٹ کپلنگ میں خلل ڈالنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ اشارے شدہ اتپریورتنوں کو، ذیلی یونٹس (نیلے تیر) کے درمیان جوڑے میں شامل S1 ٹکڑوں کو جانچنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ ± SD 3 سے 10 پیمائش۔ وکر ایک پہاڑی فٹ تھا جو ظاہر Kd قدروں کو حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا (ضمنی جدول 1 دیکھیں)۔ انٹرپولیٹڈ ہسٹوگرامس میں پہاڑی گتانک کا تعین کیا گیا تھا جیسا کہ طریقوں کے سیکشن میں بیان کیا گیا ہے (دیکھیں ضمنی انجیر 3 اور 4)۔ حوالہ h اقدار Hv1 WT کو ڈیشڈ لائنوں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ ستارے اتپریورتی اور WT حصئوں کے درمیان اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p چونکہ ہم نے CCD کو GBTA کوآپریٹو بائنڈنگ کے براہ راست ثالث کے طور پر مسترد کر دیا، ہم نے پوچھا کہ کیا VSDs کے درمیان تعاملات بائنڈنگ سائٹس کے درمیان الوسٹرک کپلنگ میں شامل ہیں۔ S1 transmembrane segment.S1 میں دو دیگر منفی چارج شدہ باقیات شامل ہیں، E119 اور D123، D112 کے طور پر ہیلکس کے اسی طرف واقع ہیں، لیکن ٹکڑے کے بیرونی سرے 24 کے قریب ہیں۔ اس لیے، ہم نے جانچ کی کہ آیا E119 اور D123 GBTA بائنڈنگ سائٹس (تصویر 5b) کے درمیان اللوسٹرک کپلنگ میں ملوث ہیں لیکن S1 ہیلکس کے دوسری طرف (تصویر 5b)۔
ہم نے 2GBI اور GBTA کے ذریعہ E119A، D123A اور K125A چینلز کے ارتکاز پر منحصر پابندی کی پیمائش کی اور پایا کہ E119A اور K125A اتپریورتنوں نے جنگلی قسم (p > 0.05، تصویر 5d) کے مقابلے میں کسی بھی روکنے والے کے ہل گتانک کو نمایاں طور پر تبدیل نہیں کیا۔ )۔ دوسری طرف، اتپریورتن D123A نے GBTA (p 0.05/14)۔
چونکہ دونوں ذیلی یونٹس پر 123 پوزیشن پر چارج کو بے اثر کرنے کے نتیجے میں GBTA بائنڈنگ تعاون میں زبردست تبدیلی آئی، جبکہ دونوں ذیلی یونٹس پر چارج کو ریورس کرنے سے صرف ایک چھوٹا سا اثر ہوا، ہم نے چارج کے الٹ چینل کے ساتھ صرف ایک ذیلی یونٹ کو شامل کرنے کے لیے تجزیہ کو بڑھا دیا۔ C-ٹرمینل ذیلی یونٹ (تصویر 5b) میں D123R متبادل کے ساتھ Hv1 سے منسلک ڈائمرز بنائے اور GBTA اور 2GBI کے ذریعے ارتکاز ردعمل کی روک تھام کی پیمائش کی۔ ہم نے پایا کہ WT-D123R چینلز کے مقابلے میں GBTA کے پابند ہونے کا پہاڑی عدد نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ جنگلی قسم کی Hv1 (p ہم نے یہ بھی پایا کہ D112E اتپریورتن نے WT-D123R پس منظر (تصویر 5b،h اور ضمنی شکل 4) کے ذریعہ تیار کردہ GBTA-بائنڈنگ ہل کوفیسینٹ میں اضافے کو ختم کر دیا ہے۔ 2GBI بائنڈنگ کے ہل گتانک پر اثر بھی ختم ہو گیا تھا ( تصویر 5h اور ضمنی شکل 3)۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ پوزیشن 123 پر مخالف چارجز کی وجہ سے ذیلی یونٹس کے درمیان بہتر اللوسٹرک کپلنگ اس وقت مضبوط بائنڈنگ تعاون میں ترجمہ نہیں کرتا جب D112 پوزیشن پر بائنڈنگ سائٹ پریشان ہوتی ہے۔
ہم نے استدلال کیا کہ اگر ملحقہ کھلے ذیلی یونٹوں پر D123 کی باقیات ایک دوسرے کے ساتھ الیکٹروسٹیٹاٹک طور پر تعامل کرنے کے لئے کافی قریب ہوں تو، منفی چارجز کے درمیان مکروہ تعامل اسپارٹک ایسڈ کو آرجینائن میں تبدیل کرکے منفی اور مثبت چارجز کے مجموعے میں تبدیل ہوجائے گا۔ ان کے درمیان پرکشش تعامل۔ ایک ذیلی یونٹ (WT-D123R dimer)۔ پرکشش تعاملات S1 ٹکڑے کے بیرونی سروں کے درمیان انٹرفیس کو مضبوط بنا سکتے ہیں، جس سے ذیلی یونٹس کے درمیان مضبوط الوسٹرک کپلنگ اور GBTA بائنڈنگ تعاون میں اضافہ ہوتا ہے۔
اس مفروضے کی حمایت کرنے کے لیے، ہم نے S1 طبقہ کے بیرونی سروں کے درمیان انٹرفیس کو مضبوط کرنے کا ایک طریقہ تلاش کیا، جو کہ پوزیشن 123 پر چارج سوئچنگ سے الگ ہے۔ لی ایٹ ال۔ Hv1 کی باقیات I127 سے سسٹین میں تبدیلی پہلے پائی گئی تھی۔ اس کے نتیجے میں خود بخود انٹرسوبونٹ کراس لنکنگ17۔ مزید برآں، Hv1-CiVSP chimeric VSD کے کرسٹل ڈھانچے نے اشارہ کیا کہ I127 S1 ہیلکس کے بیرونی سرے سے صرف ایک باقیات سے الگ ہوا ہے۔ پوزیشن 127 پر سسٹینز، جس کے نتیجے میں S1-S1 کے مضبوط تعامل کی توقع ہے، GBTA بائنڈنگ کوآپریٹیوٹی پر اسی طرح کا اثر پڑتا ہے جیسا کہ پوزیشن 123 پر چارج کو تبدیل کرنے سے دیکھا جاتا ہے۔
ہم نے GBTA اور 2GBI کے ذریعہ Hv1 I127C کے ارتکاز پر منحصر روکنا کو 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (تصویر 6a) کی موجودگی اور غیر موجودگی میں ماپا۔ اسی وقت جب روکنے والے کو انٹرا سیلولر محلول میں شامل کیا جاتا ہے، یہ کم ہوتا ہے۔ ایجنٹ کو ایکسٹرا سیلولر حل میں شامل کیا جاتا ہے۔ صرف ایک ذیلی یونٹ (WT-I127C) میں سیسٹین کے متبادل کے ساتھ ایک منسلک ڈائمر کو منفی کنٹرول (تصویر 6a) کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ I127C ذیلی یونٹس کے درمیان 2GBI روکنا، کیونکہ βME کے ساتھ یا اس کے بغیر، Hv1 کے ساتھ I127C بائنڈنگ کے لیے ہل گتانک، monocysteine ​​کے متبادل dimers کے پابند ہونے کے لیے اس سے نمایاں طور پر مختلف تھا۔ ہل کا گتانک WT-I127C (تصویر 6b اور ضمنی شکل 3) میں فرق نہیں کر سکا۔ اس کے بالکل برعکس، ہم نے GBTA روکنا پر اچانک انٹرسوبونٹ کراس لنکنگ کے ڈرامائی اثر کو ناپا۔ βME کے Hv1 I127C کے پابند ہونے کے لیے ہل کا گتانک (کراس لنک آن) βME (کراس لنک آف) کی موجودگی میں یا ڈائمر کو لنک کرنے کے لیے WT-127C کا استعمال کرتے ہوئے (کراس لنک کی عدم موجودگی میں) (تصویر 6c اور سپلیمنٹری تصویر 4) سے نمایاں طور پر زیادہ تھا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ایلوسٹرک کپلنگ بائنڈنگ سائٹس کے درمیان S1 کے ٹکڑوں کے بیرونی سروں کے درمیان ڈسلفائیڈ بانڈز کی تشکیل سے بہت زیادہ اضافہ ہوتا ہے۔ یہ نتائج ہماری اس تشریح کی تائید کرتے ہیں کہ WT-D123R ڈائمر میں 123 پوزیشن پر aspartate اور arginine کے پرکشش الیکٹرو سٹیٹک تعامل کے نتیجے میں الوسٹرک کپلنگ میں اضافہ ہوتا ہے۔ ذیلی یونٹس
اوپن اسٹیٹ کپلنگ دو ذیلی یونٹوں میں S1 طبقہ کے بیرونی سروں کے درمیان براہ راست جسمانی تعامل کے ذریعہ ثالثی کی جاتی ہے۔
(a) اتپریورتی Hv1 dimers اور linker dimers کی منصوبہ بندی کی نمائندگی، یہ جانچنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے کہ کس طرح انٹرسوبونٹ سسٹین کراس لنکس GBTA بائنڈنگ تعاون کو متاثر کرتے ہیں۔ (bd) 2GBI (b,d) اور GBTA (c، e) ایکسٹرا سیلولر محلول میں 10 mM βME کی موجودگی یا غیر موجودگی میں۔ ہر پوائنٹ 3 سے 10 پیمائشوں کے درمیانی رکاوٹ ± SD کی نمائندگی کرتا ہے۔ وکر ایک پہاڑی فٹ تھا جسے Kd اقدار حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا (ضمنی جدول 1 دیکھیں)۔ انسیٹ ہسٹوگرام میں پہاڑی کوفیشینٹس کا تعین سپلیمنٹری انجیر 3 اور 4 میں بتائے گئے فٹ سے کیا گیا تھا۔ (c,e) میں ستارے شماریاتی لحاظ سے اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔ مختلف جی بی ٹی اے کی روک تھام کے حالات کے درمیان (پی 0.05)۔
ہم نے یہ بھی پایا کہ βME کی غیر موجودگی میں، D112E I127C Hv1 dimer کے ساتھ GBTA بائنڈنگ کا ہل گتانک اس سے نمایاں طور پر زیادہ تھا جس کی پیمائش کم کرنے والے ایجنٹوں کی موجودگی میں کی گئی تھی (تصویر 6e اور ضمنی شکل 4)، جس کا مطلب یہ ہے کہ D112E اتپریورتن نے سسٹین 127 کے کراس لنکنگ کے نتیجے میں GBTA بائنڈنگ تعاون میں اضافے کو ختم نہیں کیا۔ D112E، I127C Hv1 dimers کے ساتھ 2GBI بائنڈنگ کا ہل گتانک بھی D112E اتپریورتن (شکل 1) سے متاثر نہیں ہوا تھا۔ تصویر 3)۔
ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ GBTA بائنڈنگ کو S1 کے ٹکڑوں کے بیرونی سروں کے درمیان پرکشش الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات کے ذریعے یا متبادل cysteines کے درمیان covalent بانڈز کی تشکیل کے ذریعے بڑھایا جاتا ہے اور سائٹس کے درمیان الوسٹرک کپلنگ بڑھتا ہے اور اس کے نتیجے میں بائنڈنگ تعاون میں اضافہ ہوتا ہے۔ جب کہ تعاون پر پرکشش الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات کا اثر اتپریورتن D112E کے ذریعے ختم کیا جا سکتا ہے، ہم آہنگی بانڈز کا اثر نہیں ہو سکتا۔
Hv1 چینلز کے لیے guanidine مشتقات کو بائنڈنگ کرنے کے لیے دستیاب کیمیائی جگہ کی ہماری تلاش میں، ہم نے پایا کہ 2-guanidinothiazoles جیسے GBTA میں 2-guanidinobenzimidazoles (تصویر 1c) کے مقابلے میں زیادہ ارتکاز انحصار ہوتا ہے۔ اور monomeric چینلز (تصویر 2a,b) اور dimeric چینل کے لیے جس میں ایک ذیلی یونٹ کو روکنے والے کے ساتھ پہلے سے پابند تھا (تصویر 4) نے ہمیں اس نتیجے پر پہنچایا کہ GBTA کے ذریعے Hv1 کی روک تھام ایک ہم آہنگی کا عمل ہے، اور دو ذیلی یونٹوں میں مرکبات کی بائنڈنگ سائٹس اللوسٹرک طور پر جوڑے گئے ہیں۔ یہ دریافت کہ GBTA کھلے چینل سے منسلک ہے، جیسا کہ پہلے متعلقہ کمپاؤنڈ 2GBI32 کے لیے دکھایا گیا ہے، یہ بتاتا ہے کہ ایلوسٹرک کپلنگ کا خاص طور پر کھلی حالت میں اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔ ہمارا کوآپریٹو بائنڈنگ ماڈل GBTA (تصویر 2c) کے ذریعہ Hv1 کی روک تھام کو مقداری طور پر بیان کرنے کے قابل تھا اور جھلی کے ریپولرائزیشن کے بعد چینل ٹیل کرنٹ کے زوال پر 2GBI اور GBTA کے مختلف اثرات کی وضاحت کرتا ہے، جو بائنڈنگ کے عمل کی ہماری تشریح کی حمایت کرتا ہے۔
زیادہ سے زیادہ ہل گتانک جو دو بائنڈنگ سائٹس (جیسے Hv1) ​​کے ساتھ اللوسٹرک پروٹین میں حاصل کیا جا سکتا ہے 2 ہے۔ ہم نے 1.31 کے گتانک کے ساتھ Hv1 جنگلی قسم کو باندھنے کے لیے GBTA کی پیمائش کی، جو Hv1 I127C میں بڑھ کر 1.88 ہو گئی۔ ہم آہنگی سے پاک توانائی، سب سے کم اور سب سے زیادہ وابستگی والی جگہوں کی پابند مفت توانائیوں کے درمیان فرق (طریقہ دیکھیں)، Hv1 جنگلی قسم کے معاملے میں 1.3 kcal/mole اور Hv1 I127C کے معاملے میں 2.7 kcal/mole تھا۔ بائنڈنگ آکسیجن سے ہیموگلوبن تعاون کے عمل کی سب سے مشہور اور اچھی طرح سے مطالعہ کی جانے والی مثال ہے 38۔ انسانی ہیموگلوبن کے لیے (ایک ٹیٹرمر جس میں چار الوسٹرک طور پر جوڑے ہوئے بائنڈنگ سائٹس ہیں)، ہل گتانک 2.5-3.0 کے درمیان ہے، جس کی قدریں 1.26 سے 3.64 تک ہیں۔ kcal/mol، تجرباتی حالات پر منحصر ہے38۔ اس طرح، عالمی توانائی کے لحاظ سے، Hv1 کے ساتھ GBTA کے بائنڈنگ کی کوآپریٹیوٹی O2 سے ہیموگلوبن کے پابند ہونے سے کافی مختلف نہیں ہے جب دو نظاموں میں پروٹین کے ذیلی یونٹس کی مختلف تعداد پر غور کیا جاتا ہے۔
ہمارے ہم آہنگی کے ماڈل میں، GBTA مالیکیولز کو ایک ذیلی یونٹ سے منسلک کرنے کے نتیجے میں ملحقہ ذیلی یونٹ کی بائنڈنگ وابستگی میں اضافہ ہوتا ہے۔ ہم ایک ایسے عمل کا تصور کرتے ہیں جس میں بائنڈنگ ماحول کی از سر نو ترتیب پہلی بائنڈنگ ایونٹ (حوصلہ افزائی فٹ) کے نتیجے میں ہوتی ہے۔ ذیلی یونٹس کے درمیان تعاملات میں تبدیلیاں۔ ان تبدیلیوں کے جواب میں، ملحقہ ذیلی یونٹس اپنی بائنڈنگ سائٹس کو تبدیل کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں سخت GBTA بائنڈنگ ہوتی ہے۔ اس عمل کے دوران، S1 aspartate D112 بڑھتی ہوئی بائنڈنگ وابستگی کے ساتھ منسلک بائنڈنگ سائٹ کی دوبارہ ترتیب کے لیے ذمہ دار ہے۔ D112 اس سے پہلے Hv1 پروٹون پارمیشن پاتھ وے کا حصہ اور سلیکٹیوٹی فلٹر 27,28 کے طور پر کام کرتے دکھایا گیا تھا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ دو Hv1 ذیلی یونٹس میں سلیکٹیوٹی فلٹرز کھلی حالت میں اللوسٹرک طور پر جوڑے گئے ہیں۔ شکل 7a GBTA بائنڈنگ سائٹ کا تخمینی مقام اور Hv1 VSD کی اسکیمیٹ پر D112، D123، K125 اور I127 کی باقیات کا مقام دکھاتا ہے۔ Hv1-CiVSP chimera کے کرسٹل ڈھانچے پر۔ S1 کے ایکسٹرا سیلولر سرے پر مشتمل اللوسٹرک کپلنگ کے لیے تجویز کردہ ہدایات سیاہ تیروں کے ساتھ دکھائی گئی ہیں۔
(a) Hv1 VSD کا منصوبہ۔ Hv1-CiVSP chimera کے کرسٹل ڈھانچے کی بنیاد پر، ہیلیکل سیگمنٹس کو بیلناکار دکھایا گیا ہے۔ اس کنفیگریشن میں، S4 سیگمنٹ کا اندرونی سرا CCD کے ساتھ مل جاتا ہے (نہیں دکھایا گیا)۔ پابند GBTA کے پیش گوئی شدہ مقامات سرمئی بیضوی شکل کے طور پر دکھائے گئے ہیں۔ سیاہ تیر دو ملحقہ ذیلی یونٹس میں بائنڈنگ سائٹس کے درمیان اللوسٹرک کپلنگ میں شامل راستوں کی نشاندہی کرتے ہیں۔ تفتیش شدہ S1 باقیات کی پوزیشنوں کو رنگین دائروں سے نشان زد کیا گیا ہے۔ (b) Hv1 subunits کی منصوبہ بندی کی مثال دو مختلف ڈائمر کنفیگریشنز میں جیسا کہ جھلی کے جہاز کے ایکسٹرا سیلولر سائیڈ سے دیکھا گیا ہے۔ بائیں پینل پر، ڈائمر انٹرفیس S4 ہیلکس کے ذریعے تشکیل دیا جاتا ہے۔ دو S4 ہیلیکس (ڈیشڈ ایرو) کے بیرونی سروں کی علیحدگی، دائیں طرف دکھائے گئے انتظام کو پیدا کرتی ہے۔ اس ترتیب میں، ملحقہ ذیلی یونٹوں سے باقیات D123 اور I127 کو ایک دوسرے کے قریب آنے کی اجازت ہے۔ (c) CiVSP VSD کی منصوبہ بندی کی نمائندگی 4G80 کرسٹل ڈھانچے میں پائی جانے والی ڈائمر کنفیگریشن میں۔ CiVSP میں پوزیشن P140 Hv1 میں D123 کی پوزیشن سے مساوی ہے۔
ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ریزیڈیو 123 (123D/123D یا 123R/123R) کے درمیان ریپلسیو الیکٹرو اسٹاٹک تعامل کھلی حالت میں GBTA بائنڈنگ کوآپریٹیویٹی کی "نارمل" سطح سے وابستہ ہے اور تعامل کو Repulsion سے Attracted (123D/123R) میں منتقل کرتا ہے۔ ، تعاون میں اضافہ (تصویر 5 جی)۔ یہ توقع کی جاتی ہے کہ الانائن کے متبادل کے ساتھ مکروہ تعامل کو ہٹانے سے بھی تعاون میں اضافہ ہوگا۔ تاہم، 123A/123A ڈائمر کی تعاون میں کمی دیکھی گئی (تصویر 5e)۔ ایک ممکن ہے۔ وضاحت یہ ہے کہ ہائیڈروفوبک اوشیشوں کو ہائیڈرو فیلک ماحول میں رکھنے کا غیر مستحکم اثر D123 اوشیشوں کے درمیان مکروہ تعاملات کے خاتمے کی وجہ سے مستحکم اثر سے زیادہ ہو سکتا ہے، جس کے نتیجے میں بائنڈنگ تعاون میں مجموعی طور پر کمی واقع ہو سکتی ہے۔ Ciona gutis Ci-Hv1 کی پوزیشن D171 (انسانی Hv1 میں D123 کے مساوی) کو چالو کرنے پر بڑھایا جاتا ہے، اس تصور کی تائید کرتا ہے کہ D123 کھلی حالت میں ہائیڈرو فیلک ماحول میں واقع ہے۔
Hv1 چینلز کی گیٹنگ ایک سے زیادہ ٹرانزیشنز کے ذریعے ہوتی ہے 19,20,26,39,40,41. Qiu et al26 نے پایا کہ جھلی کے ڈیپولرائزیشن پر، Ci-Hv1 کے وولٹیج سینسر میں تبدیلی آتی ہے جس سے چینل فعال ہو جاتا ہے لیکن پھر بھی بند ہو جاتا ہے۔ ، اس کے بعد ایک الگ منتقلی ہوتی ہے جس کی وجہ سے پروٹون دونوں ذیلی یونٹوں کے راستے میں ترسیل کو کھولتے ہیں۔ وولٹیج سینسر کی تعمیری تبدیلی کو وولٹیج-کلیمپ فلوروسینس کے ذریعے مانیٹر کیا گیا تھا، اور یہ پایا گیا کہ دوسری منتقلی کو D171 پوزیشن پر ہونے والے تغیرات سے منتخب طور پر پریشان کیا گیا تھا۔ فلوروسینٹ سگنل کی گڑبڑ کنفورمیشنل تبدیلی کے رد عمل کوآرڈینیٹ کے ساتھ ملحقہ ذیلی یونٹوں کے D171 اوشیشوں کے درمیان الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات کی موجودگی کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے۔ یہ تشریح ہمارے اس کھوج سے مطابقت رکھتی ہے کہ D123 باقیات الیکٹرو سٹیٹک طور پر کھلی حالت میں تعامل کرتے ہیں۔ اور GBTA بائنڈنگ سائٹس کے درمیان الوسٹرک کپلنگ میں ثالثی کرتا ہے۔
Fujiwara et al25 نے تجویز کیا کہ سائٹوپلاسمک کوائلڈ کوائل ڈومین کا ڈائمر انٹرفیس جھلی تک پھیلا ہوا ہے جس میں دو S4 ہیلیکس (تصویر 7b، بائیں پینل) شامل ہیں۔ S4 ہیلکس اور CCD کو جوڑنے والے علاقے کا پورا VSD اور فنکشنل تجزیہ۔ ٹرانس میبرن پی ایچ گریڈینٹ کی عدم موجودگی میں، Hv1 چینلز کو کھلنے کے لیے کافی جھلی ڈیپولرائزیشن کی ضرورت ہوتی ہے، اور سسٹین کراس لنکنگ ان حالات میں ہوتی ہے جہاں چینل بنیادی طور پر بند ہوتا ہے۔ لہذا، پتہ چلا S4-S4 انٹرفیس ممکنہ طور پر آف اسٹیٹ سبونائٹ کنفیگریشن کی عکاسی کرتا ہے۔ دیگر مطالعات میں گیٹنگ 17,21,26 کے دوران انٹرسوبونٹ تعاملات میں S1 اور S2 کے ملوث ہونے کے شواہد ملے ہیں جو تجویز کرتے ہیں کہ چینلز کھلے میں مختلف ذیلی یونٹ تشکیلات کو اپنا سکتے ہیں۔ بند ریاستیں، ایک خیال Mony et al کے نتائج سے مطابقت رکھتا ہے۔ S1 گیٹنگ کے دوران 39 حرکت کرتا ہے۔
یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ، کھلی حالت میں، S1 ہیلکس کے ایکسٹرا سیلولر سرے براہ راست الیکٹرو سٹیٹک تعاملات کو سپورٹ کرنے کے لیے کافی قریب ہیں جو ذیلی یونٹوں کے درمیان اللوسٹرک کپلنگ میں ثالثی کرتے ہیں۔ براہ راست بات چیت کرنے کے لیے ایک دوسرے کے علاوہ۔ تاہم، جھلی کے طیارہ پر کھڑے محور کے گرد دو VSD ذیلی یونٹس کی 20° گھڑی کی سمت میں گردش، دو S4 ہیلائسز کے بیرونی سروں کی علیحدگی کے ساتھ مل کر، ایک S1-S1 ترتیب ملتی ہے۔ ہمارے نتائج (تصویر 7b، دائیں پینل) کے ساتھ۔ ہم اس کنفیگریشن کو کھلی حالت میں چینل کے لیے تجویز کرتے ہیں۔
اگرچہ CiVSP انزائم کو ایک مونومر کے طور پر کام کرنے کے بارے میں سوچا جاتا ہے، لیکن اس کے الگ تھلگ VSD کا کرسٹل ڈھانچہ ایک ڈائمر حالت میں پکڑا جاتا ہے۔ اس ڈائمر میں S1 ہیلیکس کے بیرونی سرے مقامی طور پر ایک دوسرے کے قریب ہوتے ہیں، اور مجموعی ترتیب مجوزہ سے ملتی جلتی ہے۔ Hv1 (تصویر 7c) کے لیے۔ CiVSP ڈائمر میں، ملحقہ سبونائٹ سے قریب ترین باقیات 140 پوزیشن پر پرولین تھیں (تصویر 7c)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ CiVSP میں P140 Hv1 میں D123 کی پوزیشن سے مساوی ہے۔ Hv1 کے درمیان ذیلی یونٹ کی ترتیب میں مماثلت۔ اور CiVSP dimers سے پتہ چلتا ہے کہ ان پروٹینوں کے VSDs میں ایک انٹرفیس بنانے کا ایک اندرونی رجحان ہوتا ہے جہاں S1 کے ایکسٹرا سیلولر سرے آپس میں ملتے ہیں۔
سپرم سیل ایکٹیویشن میں Hv1 کا لازمی کردار اس چینل کو مردانہ زرخیزی کو کنٹرول کرنے کے لیے ایک پرکشش دوا کا ہدف بناتا ہے۔ مزید برآں، مائکروگلیہ میں Hv1 کی ایکٹیویشن اسکیمک اسٹروک سے صحت یابی کو خراب کرتی دکھائی گئی ہے۔ چھاتی کے 12 یا کولوریکٹل کینسر 13 کے مریضوں میں بقا اور یہ خیال کیا جاتا ہے کہ یہ بی سیل کی خرابی 11 میں حصہ ڈالتی ہے۔ اس لیے، Hv1 کو نشانہ بنانے والی چھوٹی مالیکیول ادویات کو نیورو پروٹیکٹو ایجنٹوں یا اینٹی کینسر علاج کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اوپن Hv1 subunit، جو کہ پابند وابستگی کو بڑھاتا ہے، Hv1 چینلز کو نشانہ بنانے والی زیادہ طاقتور دوائیوں کی نشوونما کا باعث بن سکتا ہے۔
انسانی Hv1 کی سائٹ سے ہدایت شدہ mutagenesis معیاری PCR تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ Hv1NCCiVSP کی تعمیر میں، Hv1 کی باقیات 1-96 اور 228-273 کو CiVSP18 کی باقیات 1-113 اور 240-576 سے تبدیل کر دیا گیا تھا۔ Hv1 سے منسلک ایک ذیلی یونٹ کا C-ٹرمینس GGSGGSGGSGSGSGGSGG لنکر کے ذریعے دوسرے سبونائٹ کے N-ٹرمینس سے منسلک ہوتا ہے۔ pGEMHE پلازمیڈز جن میں مختلف تعمیرات ہیں Nhe1 یا Sph1 پابندی والے خامروں (نیو انگلینڈ بائولابس) کے ساتھ لکیریائز کیے گئے تھے اور RNA کی ترکیب کے ساتھ انجام دیا گیا تھا۔ T7 mMessage mMachine ٹرانسکرپشن کٹ (Ambion)۔ الیکٹرو فزیولوجیکل پیمائش سے 1-3 دن پہلے، cRNA کو Xenopus oocytes میں داخل کیا گیا تھا (50 nl فی سیل، 0.3-1.5 μg/μl)۔ Xenopus laevis (NASCO) سے اسٹیج V اور VI oocytes حاصل کیے گئے تھے۔ Ecocyte Bioscience سے۔ RNA انجیکشن کے بعد، خلیات کو ND96 میڈیم میں برقرار رکھا گیا تھا جس میں 96 mM NaCl، 2 mM KCl، 1.8 mM CaCl، 1 mM MgCl، 10 mM HEPES، 5 mM پائروویٹ، 100 μH °7 amig/100 μH °C/8mc .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole[2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -تھیازول-2-ایل)گوانیڈائن) [6]، ایتھائل 2-گوانیڈینو-5-میتھائل-1،3-تھیازول-4-کاربو آکسیلیٹ [8]، ایتھائل 2-گوانیڈینو-4- میتھائل-1،3-تھیازول- 5-carboxylate [9] اور (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate [10] Sigma-Aldrich سے تھے۔ Famotidine [7] MP Biomedicals سے تھا۔1-[4 -(4-Chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] اور 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-yl]guanidine [12] تھا میٹرکس سائنٹیفک سے۔ یہ مرکبات تجارتی طور پر دستیاب اعلی ترین پاکیزگی کے حامل ہیں۔ انہیں خشک DMSO میں تحلیل کر کے 100 ایم ایم سٹاک محلول بنایا گیا، جسے پھر مطلوبہ حتمی ارتکاز پر ریکارڈنگ محلول میں پتلا کر دیا گیا۔ مرکبات 3 اور 4 کو ذیل میں ترکیب کیا گیا۔ کم از کم 99٪ پاکیزگی.
2-امائنو-4- (ٹرائی فلوورومیتھائل) بینزینیتھول ہائیڈروکلورائیڈ (1.02 جی، 4.5 ملی میٹر) کو 25 ملی لیٹر آبی ہائیڈروکلورک ایسڈ (2.5 این) میں ٹھوس ڈیسیانڈیامائڈ (380 ملی گرام، 4.5 ملی میٹر) شامل کیا گیا، اور اس کے نتیجے میں مائیکلز ہیٹرولوگ 4 گھنٹے تک زوردار ہلچل کے ساتھ ریفلکس کیا گیا۔ رد عمل کے آمیزے کو کمرے کے درجہ حرارت پر ٹھنڈا کیا گیا اور 10N پوٹاشیم ہائیڈرو آکسائیڈ کو بتدریج شامل کر کے بے اثر کر دیا گیا۔ بننے والے سفید رنگ کو فلٹر کیا گیا، ٹھنڈے پانی (3 × 50 ملی لیٹر) سے دھویا گیا، تندور میں خشک کیا گیا۔ 65 °C) کئی گھنٹوں کے لیے، اور پھر سفید ٹھوس (500 ملی گرام، 48 %) دینے کے لیے ایتھائل ایسیٹیٹ/پیٹرولیم ایتھر سے دوبارہ تیار کیا جاتا ہے۔ mp 221–222 °C (روشنی 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (انتہائی وسیع s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d) , 1 H, J = 8.1 Hz۔ 13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J) = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z حسابی قدر : 261.0419۔
Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol)، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، کو ایک چھوٹی سی ٹیسٹ ٹیوب میں تیل کے غسل میں 200 °C پر گرم کیا گیا تھا۔ 1.0 ملی لیٹر کونک۔ گرم کمپاؤنڈ میں تیزی سے ہائیڈروکلورک ایسڈ شامل کیا گیا اور اس مرکب کو تقریباً 2 منٹ تک تیل کے غسل میں رکھا گیا، اس دوران زیادہ تر پانی بخارات بن گیا۔ اسے چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں توڑ کر پانی سے دھویا جاتا ہے تاکہ ہلکے پیلے رنگ کے بے ساختہ ٹھوس (38 ملی گرام، 10%) mp 246-250 °C؛ 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz) , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz) 13C NMR (150) MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z 0699 ، ملا: 243.0704۔
پروٹون کرنٹ کو آوسیٹس کے اندرونی اور بیرونی پیچوں میں ماپا گیا تھا جو ایک Axopatch 200B ایمپلیفائر کا استعمال کرتے ہوئے مختلف تعمیرات کا اظہار کرتے ہیں جو ایک Axon Digidata 1440A (مالیکیولر ڈیوائسز) کے ذریعے pClamp10 سافٹ ویئر کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ ایتھین سلفونک ایسڈ (MES)، 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate، 5 mM TEA کلورائیڈ، 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic ایسڈ (EGTA)، ایڈجسٹ ٹی ای اے ہائیڈرو آکسائیڈ کے ساتھ پی ایچ 6.0۔ تمام پیمائشیں 22 ± 2 °C پر کی گئیں۔ پائپیٹ میں 1.5–4 MΩ کی رسائی مزاحمت ہے۔ موجودہ نشانات کو 1 kHz پر فلٹر کیا گیا، 5 kHz پر نمونہ لیا گیا اور Clampfit10.2 Device Molecular کے ساتھ تجزیہ کیا گیا۔ ) اور Origin8.1 (OriginLab)۔
Hv1 inhibitor کے مختلف ارتکاز پر مشتمل حل اور بعض صورتوں میں 10 mM βME غسل میں کشش ثقل کے ذریعے VC-6 پرفیوژن والو سسٹم (Warner Instr.) سے منسلک کئی گنا کے ذریعے داخل کیے گئے، جو pClamp سافٹ ویئر TTL (Transistor-Transistor-) سے گزرے تھے۔ ٹرانزسٹر لاجک) سگنلز۔ تیز پرفیوژن کے تجربات ملٹی ٹیوب پرفیوژن پنسل (آٹو میٹ سائنس) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے جس میں 360 μm قطر کی ڈیلیوری ٹپ ایک پیچ پائپیٹ کے سامنے نصب تھی۔ چینل کی روک تھام کا تعین isochronal amperometric پیمائش کے ذریعے کیا گیا تھا۔ +120 mV depolarizing pulse.GV پیمائشیں کی گئیں جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا 18,20۔ دم کے کرنٹ کو -20 mV سے +120 mV تک مختلف وولٹیجز پر ڈیپولرائزیشن کے مراحل کے بعد -40 mV پر ریکارڈ کیا گیا جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو۔ ٹیسٹ پلس سے پہلے کا حوالہ نبض ہے موجودہ کشی 18 کے لیے درست کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ جی وی گراف بولٹزمین کی مساوات پر فٹ بیٹھتا ہے:
چینلز اور انحیبیٹرز (ضمنی جدول 1) کے مختلف امتزاج کے لیے ظاہری انحطاط مستقل (Kd) کا تعین پہاڑی مساوات کے ساتھ ممانعت کے ارتکاز انحصار (مطلب % inhib اقدار) کو فٹ کر کے کیا گیا تھا:
جہاں [I] inhibitor I کا ارتکاز ہے اور h ہل کا عدد ہے۔