Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). қолдауды жалғастыра отырып, біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Hv1 кернеуі бар протон арнасы екі кернеуді сезгіш доменнен (VSD) тұратын димерлі кешен болып табылады, олардың әрқайсысында протонның өту жолы бар. Димеризация цитоплазмалық катушкалар доменімен бақыланады. Жабық күйден өту екі VSD-де ашық күй бірлескен түрде болатыны белгілі; дегенмен, негізгі механизмдер туралы аз мәлімет бар. Бірлікаралық интерфейстер аллостериялық процестерде шешуші рөл атқарады; дегенмен, мұндай интерфейстер ашық Hv1 арналарында анықталған жоқ. Бұл жерде біз 2-гуанидинотиазол туындылары екі Hv1 VSD-ны бірлескен түрде блоктайтынын және осы қосылыстардың бірін ашық суббірліктер арасындағы аллостериялық байланыс үшін зонд ретінде пайдаланатынын көрсетеміз. Біз жасушадан тыс VSD бірінші трансмембраналық фрагментінің соңы байланыстырушы тораптар арасындағы байланысқа делдалдық жасайтын суббірлікаралық интерфейсті құрайды, ал орамды домен бұл процеске тікелей қатыспайды. Сондай-ақ біз арнаның протонды-селективті сүзгісі блокаторды байланыстыру ынтымақтастығын басқаратын күшті дәлелдер таптық. .
Кернеуге байланысты протон арналары фитопланктоннан адамға дейін әр түрлі организмдерде маңызды рөл атқарады1. Көптеген жасушаларда бұл арналар протон мембранасынан протонның ағуына делдалдық етеді және NADPH оксидазасының белсенділігін реттейді. Адамдардағы жалғыз белгілі кернеуге байланысты протондық арна. HVCN1 генінің өнімі болып табылатын Hv1 болып табылады2,3.Hv1 (aka VSOP) В жасушаларының пролиферациясында4, туа біткен иммундық жүйемен реактивті оттегі түрлерін өндіруде5,6,7,8, сперматозоид жасушаларында рөл атқаратыны көрсетілген. қозғалғыштығы9 және тыныс жолдарының беткі сұйықтығының рН реттелуі10. Бұл арна В-жасушалық қатерлі ісіктердің 4,11 және сүт безі мен тік ішектің қатерлі ісігі сияқты бірнеше шамадан тыс экспрессияға қатысады. Hv1 шамадан тыс белсенділігі қатерлі ісік жасушаларының метастатикалық әлеуетін арттыру үшін табылды 11, 12 . Мида Hv1 көрсетіледі. микроглия арқылы және оның белсенділігі ишемиялық инсульт үлгілерінде мидың зақымдануын күшейтетіні көрсетілген.
Hv1 протеинінде S1-S414 деп аталатын төрт трансмембраналық сегменттерден тұратын кернеуді сезгіш домен (VSD) бар. VSD кернеуі бар Na+, K+ және Ca2+ арналарының сәйкес домендеріне және CiVSP сияқты кернеуге сезімтал фосфатазаларға ұқсайды. Ciona gutis15.Осы басқа белоктарда S4-тің C-терминусы эффекторлық модульге, кеуек доменіне немесе ферментке бекітілген. Hv1-де S4 мембрананың цитоплазмалық жағында орналасқан ширатылған катушкалар доменімен (CCD) байланысты. .Арна екі VSD-ден тұратын димерлі кешен болып табылады, олардың әрқайсысында протонды өткізу жолы бар16,17,18. Бұл екі Hv1 суббірлігінің бірлескен түрде ашылатыны анықталды19,20,21,22, бұл аллостериялық байланыс пен суббірлік аралық әрекеттесулердің ойнайтынын көрсетеді. ысырма процесінде маңызды рөл атқарады. Шиыршықталған катушкалар доменіндегі қосалқы блоктар арасындағы интерфейс жақсы анықталған, себебі екі оқшауланған доменнің кристалдық құрылымдары қол жетімді22,23. Екінші жағынан, мембрана ішіндегі VSD арасындағы интерфейс жоқ. жақсы түсінілген. Hv1-CiVSP химерлі протеинінің кристалдық құрылымы бұл интерфейс туралы ақпаратты бермейді, өйткені кристалданған арналар кешенінің тримерлік ұйымдасуы жергілікті Hv1 CCD-ны GCN424 ашытқы лейцин сыдырмасымен ауыстыру нәтижесінде болуы мүмкін.
Жақында Hv1 арнасының суббірлік ұйымын зерттеу екі S4 спиралының екінші реттік құрылымның қатты бұзылуынсыз ПЗС-қа ауысады, нәтижесінде мембранадан басталып, цитоплазмаға түсетін ұзын спиральдар пайда болады. Цистеиннің қиылысу талдауына негізделген, бұл зерттеу Hv1 VSD құрылғыларының S4 сегменті бойымен бір-бірімен байланысуын ұсынады. Дегенмен, басқа зерттеулер VSD арасындағы балама интерфейстерді ұсынды. Бұл интерфейстерге S1 сегменттері 17, 21, 26 және S2 сегментінің 21 сыртқы ұштары кіреді. Қайшылықтың ықтимал себебі. Бұл зерттеулердің нәтижелері VSD арасындағы аллостериялық байланыс жабық және ашық күйлерге байланысты вентильдік процеске қатысты зерттелді және VSD арасындағы интерфейс конформациядағы әртүрлі күй өзгерістерінде өзгеруі мүмкін.
Мұнда біз 2-гуанидинотиазол екі ашық VSD-ге синергетикалық байланысу арқылы Hv1 арналарын тежейтінін анықтадық және қосылыстардың бірін, 2-гуанидинобинзотиазолды (ГБТА) ашық күйдегі суббірліктер арасындағы өзара әрекеттесуді зерттеу үшін қолдандық. интерфейс. Біз GBTA байланыстыру қисығын сандық модель арқылы жақсы сипаттауға болатынын анықтадық, онда ингибитордың бір суббірлікпен байланысуы іргелес суббірліктің байланысу жақындығы артады. Сондай-ақ D112 қалдықтары, селективті сүзгілер арна 27, 28 және гуанидин туындысын байланыстыратын тораптың 29 бөлігі GBTA байланыстыру кооперациясын бақылайды. Біз кооперативтік байланыстыру Hv1 димерінде сақталатынын көрсетеміз, мұнда CCD S4 сегментінен бөлінеді, бұл ПЗС-дағы суббірлікаралық интерфейстің тікелей емес екенін көрсетеді. GBTA-байланыстыратын тораптар арасындағы аллостериялық байланысқа делдалдық етеді. Керісінше, біз S1 фрагменті суббірліктер арасындағы интерфейстің бір бөлігі екенін анықтаймыз және S4 спиралының жасушадан тыс ұшы димердің ортасынан алыс орналасқан іргелес VSD-лердің орналасуын ұсынамыз. S1 фрагменті ашық күйде болуы керек.
Hv1 шағын молекулалы ингибиторлары ісікке қарсы препараттар және нейропротекторлық агенттер ретінде пайдалы. Дегенмен, бүгінгі күнге дейін бірнеше қосылыстар 30,31,32,33 арнаны тежей алды. Олардың ішінде 2-гуанидинобензимидазол (2ГБИ, қосылыс [1] суретте). 1a) және оның туындылары протондардың VSD29,32 канал арқылы өтуін блоктайтыны анықталды. Мұндай қосылыстардың байланысы екі ашық суббірліктерде тәуелсіз жүреді деп саналады. бұрын 200 мкМ концентрацияда сыналған кезде Hv1-ді 2GBI сияқты тиімді тежейтіні көрсетілген (1б-сурет). Біз басқа тиазол туындыларын зерттедік және олардың кейбіреулері GBTA-ға қарағанда ұқсас немесе жоғары потенциалмен арнаны тежейтінін анықтадық (1-сурет және қосымша). мәтін).Біз төрт тиазол туындысының (ГБТА және қосылыстар [3], [6] және [11], 1c-сурет) концентрацияға жауап беру қисықтарын анықтадық және олардың 2GBI. The Hill коэффициенттерінен (h) тік екенін анықтадық. тиазол туындыларының саны 1,109 ± 0,040-тан 1,306 ± 0,033-ке дейін ауытқиды (сур. 1c және Қосымша 1-сурет). Керісінше, 2GBI үшін Hill коэффициенті 0,975 ± 0,024 болды 29, 2а-сурет және Қосымша 1-сурет). байланысу орны,29,32 біз тиазол туындысының бір суббірлікпен байланысуы екінші ингибитор молекуласының іргелес суббірлікпен байланысуын күшейтуі мүмкін деп ойладық. ГБТА ең жоғары Hill коэффициенті бар сынақ қосылысы болды. Сондықтан біз бұл қосылысты таңдау үшін таңдадық. одан әрі байланыстыру синергиясы механизмін зерттеп, 2GBI-ді анықтамалық теріс бақылау ретінде пайдаланды.
(a) Сынақ қосылыстары: [1] Анықтамалық Hv1 ингибиторы 2-гуанидино-бензимидазол (2ГБИ).[2] 2-гуанидино-бензотиазол (ГБТА), [3] (5-трифторметил-1,3-бензотиазол-2-ил)гуанидин, [4] нафто[1,2-д][1, 3] Тиазол-2-ил -гуанидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [6](5-бром-4-метил-1,3-тиазол- 2-ил)гуанидин, [7] фамотидин, [8] 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбон қышқылы этил эфирі, [9] 2-гуанидино-4-метил Этил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10] ](2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)этилацетат, [11]1-[4-(4-хлорофенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин .(b) Көрсетілген гуанидинотиазолдар мен 2GBI сілтеме қосылысы арқылы адамның Hv1 белсенділігін тежеу (көк-жасыл жолақтар) .Hv1 протон токтары -80 мВ-тан +120 мВ-қа дейінгі ұстау потенциалынан деполяризацияға жауап ретінде Xenopus ооциттерінің ішкі-сыртқы тақталарында өлшенді. Әрбір ингибитор ваннаға 200 мкМ.pHi = pHo = 6,0 концентрациясында қосылды. .Деректер орташа±SEM (n≥4).(c) [2], [3], [6] және [11] қосылыстары арқылы адам Hv1 концентрациясына тәуелді тежелуі. Әрбір нүкте ± SD 3 орташа тежелуді білдіреді. 15 өлшемге дейін. Сызық 1-қосымша кестеде келтірілген айқын Kd мәндерін алу үшін пайдаланылатын төбеге сәйкестік болып табылады. Төбелік коэффициенттер 1-қосымша суретте келтірілген сәйкестіктерден анықталды: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (Әдістерді қараңыз).
(a,b) 2GBI және GBTA қосылыстары димерлі және мономерлі Hv1-ді концентрацияға тәуелді түрде тежеді. Әрбір нүкте 3-8 өлшемнің орташа тежелу ± SD мәнін көрсетеді және қисық Hill сәйкестігін көрсетеді. Хилл коэффициенттері (h) бөлімінде көрсетілген. кірістірілген гистограммалар қосымша 3 және 4-суреттерде келтірілген сәйкестіктерден анықталды. (a) тармағында көрсетілген GBTA концентрациясының реакциясы 1c-суреттегімен бірдей. Кд көрінетін мәндері үшін Қосымша 1 кестені қараңыз.(c) Модельдеу GBTA-ның димерикалық Hv1-мен бірлескен байланысы. Тұтас қара сызық (d) тармағында көрсетілген байланыстыру моделін сипаттайтын (6) теңдеу бойынша эксперименттік деректерге сәйкестікті көрсетеді. 1-ші және 2-ші тармақшамен белгіленген үзік сызықтар бимолекулалық байланысты білдіреді. -сәйкесінше бірінші және екінші байланыс оқиғаларының диссоциациясының тепе-теңдік қисықтары (1-ші ішкі: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 мкМ; 2-тармақша: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 мкМ ).(d) Hv1 блогының ұсынылатын механизмінің схемалық диаграммасы. ГБТА жағдайында бір ашық суббірлікке қосылу көршілес ашық суббірліктің (Kd2 Hv1 арналарын олардың N- және С-терминал цитоплазмалық домендерін Ciona Intestinalis кернеуге сезімтал фосфатаза CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 сәйкес бөліктерімен ауыстыру арқылы мономеризациялауға болады. оларды димерлік арнаның (жабайы типті) тежелуімен салыстырдық (2а,б-сурет). Біз екі қосылыс арасындағы байланыстыру кооперациясының айырмашылығы мономерлі Hv1-де жойылғанын анықтадық, бұл GBTA-ның бір суббірлікпен байланысуы әсерді арттырады деген түсініктемені қолдайды. басқа суббірліктің ингибиторға жақындығы. Біз GBTA-ның бір Hv1 суббірлігімен байланысуы байланыстыру орнының қайта реттелуіне (фит35 индукциясы) әкелуі мүмкін деп ойладық, бұл іргелес суббірліктің бос байланысу орнының қайта реттелуін қоздырып, байланыстырудың жоғарылауына әкеледі. жақындық.
ГБТА-ның арнамен бірлескен байланысуын сандық сипаттау үшін біз кез келген суббірлік Kd1 диссоциациялану тұрақтысымен бимолекулалық реакциядан кейін бірінші ингибитор молекуласын байланыстыра алатын модельді қолдандық (сурет 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO* ). Байланыстыру арнаның Kd2 диссоциация константасы бар бірегей бимолекулярлық реакциядан кейін қалған бос суббірліктер ингибитормен байланысатын күйді қабылдауына әкеледі, мұнда Kd2 2c-суреттегі тұтас қара сызық модель теңдеуінің эксперименталды концентрация-жауап қисығына сәйкестігі болып табылады, ол Kd1 мәні ~290 мкм және Kd2 ~29 мкм (Әдістемелер бөлімі, теңдеу (6)) береді. Модель сонымен бірге сипаттайды. 2GBI байланысуы, мұнда Kd2 ≈ Kd1 = Kd (2d-сурет). Мономерлі Hv1-де тек бір байланыс орны және бір Kdm (O° + B ⇆ B°) бар. GBTA жағдайында Kdm шамамен 54 құрайды. μM, ол Kd2-ге қарағанда Kd1-ге көбірек ұқсайды (2d-сурет). Басқаша айтқанда, мономердің байланысу орны төменге қарағанда жоғары жақындық күйіне (BO*) ұқсас конфигурацияда (O°) болады. димердің жақындық күйі (OO), ең алдымен, суббірліктер арасындағы интерфейстің жойылуына байланысты.
Бұрын 2GBI32 үшін көрсетілгендей, GBTA Hv1 токтарын ашуды қиындату арқылы емес, оны ашық болған кезде блоктау арқылы басатынын анықтадық (Қосымша 2a,b,d сурет). мембрананың реполяризациясына жауап ретінде, бірақ бұл құбылыс GBTA-да байқалған жоқ (Қосымша 2c-сурет). 2GBI қатысуымен Hv1 инактивациясы болған кезде, блокатор байланыстырушы жерден кеткенше әр суббірліктегі қақпалар жабыла алмайды (" foot gate” механизмі) және 2GBI жабылатын қақпаларға қарағанда баяу ажыратылады. Егер бір Hv1 қосалқы бірлігі бұғатталмаған және жабылған болса, іргелес қосалқы бөлімше бітеліп қалса, қалған 2GBI молекулаларының байланыстырылуы баяулайды (блокаторды ұстау). Ұзақ өмір сүретін арна түрлері бар тек бір ғана блокталған суббірлік жабылар алдында протондарды өтпелі түрде өткізеді және баяу ыдырайтын құйрықты токқа айтарлықтай үлес қосады.
GBTA (Қосымша 2c-сурет) қатысуымен Hv1 құйрық токтарының ыдырауы айтарлықтай бәсеңдетілмегенін анықтау осы блокатордың синергетикалық байланыстыру механизміне сәйкес келеді (2d-сурет). GBTA молекуласы Hv1 суббірлігімен байланысқаннан кейін. , блокатордың іргелес суббірлікке жақындығы 10 есеге дейін төмендейді, бұл байланыстыру процесіне оң әсер етеді. Бұл ГБТА-ның екінші молекуласының арнаға түсіп қалмай тұрып, оның ажырау мүмкіндігінің әлдеқайда жоғары екенін білдіреді. Ұзақ өмір сүретін арна түрлері, олар тек бір блоктаушы суббірлікті шығарады деп күтілуде, GBTA бар кезде 2 ГБИ бар болғанға қарағанда әлдеқайда көп болады, нәтижесінде құйрық тоқының жылдам ыдырауы болады.
GBTA екі Hv1 суббірлігімен ынтымақтаса байланысуы үшін байланыстыру орындары аллостериялық байланыста болуы керек. Әрбір байланыстыру орны: 1) ингибитормен байланысқан іргелес суббірліктермен байланысатын оқиғалар тізбегін іске қосу және 2) делдал болу мүмкіндігі болуы керек. төмен аффинділіктен жоғары аффинді байланыстыруға көшу. Біз байланыстыру орнындағы спецификалық қалдықтар бірлескен процеске ықпал етсе, олардың мутациясы Hv1 GBTA тежелуінің концентрация-жауап қисығының Hill коэффициентін өзгертуі керек деп ойладық. D112, F150 қалдықтары. , S181 және R211 бұрын 2GBI29 байланыстыру ортасының бөлігі екендігі көрсетілді және біз олардың GBTA байланысуына бірдей қатысатынын болжадық (3A-сурет). Біз D112E, F150A, S181A мутанттық арналары үшін GBTA-ның тежегіш концентрация-жауап қисықтарын өлшедік. , және R211S (3-сурет) және олардың Hill коэффициенттерін Hv1 жабайы түрінің коэффициенттерімен салыстырып, сілтеме ретінде 2GBI пайдаланады. V109 қалдығы D112 сияқты S1 сегментінің бір бетінде және ұяшық ішінде бір қосымша бұрандалы бұрылысы бар. V109 2GBI29 байланыстыруға қатыспады, біз V109A мутантын бақылау ретінде қолдандық (Cурет 1). 3b).
(a) Гуанидин туындысының байланысуына қатысатын ұсынылған Hv1 қалдықтары. Үзіктелген көк қисықтар 2GBI29 қосылысының әртүрлі бөліктерімен әрекеттесетін бұрын ұсынылған бүйірлік тізбектерді қоршайды.(bf) 2GBI (көгілдір) және GBTA (қосылыстарымен көрсетілген Hv1 мутанттарының концентрацияға тәуелді тежелуі. қою қызыл). Әрбір нүкте теріс бақылау ретінде 3-12 өлшемнің ± SD V109 орташа тежелуін білдіреді. Қисықтар айқын Kd мәндерін алу үшін пайдаланылатын Hill сәйкестіктері болып табылады (Қосымша 1-кестені қараңыз). Hill коэффициенттері (h) бөлімде көрсетілген. кірістірілген гистограммалар қосымша 3 және 4-суреттерде келтірілген сәйкестіктерден анықталды. Hv1 WT үшін сілтеме h мәндері үзік сызықтар түрінде көрсетілген. Жұлдызшалар мутантты және WT үзінділері арасындағы статистикалық маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (p GBTA жабайы түрімен салыстырғанда D112E мутациясының Hill коэффициентін айтарлықтай төмендеткенін анықтадық (p GBTA байланысы үшін Hill коэффициенті Hv1 димерінде 1-ден жоғары және мономерлі арнада ~1 болады деген тұжырым (2б-сурет) екі суббірліктердегі байланыстыратын тораптар арасындағы аллостериялық әрекеттесулердің болуымен сәйкес келеді.Егер бұл Бұл жағдайда блокатор бір суббірлікпен байланысқан димерге GBTA байланысуының Hill коэффициенті ~1 болуы керек. Біз бұл болжамды Hv1 F150A-WT байланысты димерде сынадық (4а-сурет), мұнда F150A жақындығы GBTA үшін қосалқы бірлік WT қосалқы бірлігінен 2 рет жоғары болды (1c және 3d-суреттер). Содан кейін біз 2 мкм GBTA базальды концентрациясында WT суббірлігін тежеу үшін концентрация-жауап қисықтарын өлшедік. Осы концентрацияда , блокатор F150A қосалқы бөлігінің шамамен 99% және WT қосалқы бөлігінің (a) блоктаушы жартылай арнаны ({F150A}b-WT/BAO*) генерациялау үшін пайдаланылатын F150A-WT түйіспе димерінің схемалық диаграммасы. Ақ гауһар мутацияның орнын көрсетеді. BAO* және BA*B* күйінде, F150A қосалқы бірлігінің жақындығы WT қосалқы бірлігінен жоғары болады деп күтілуде.(b) F150A-WT арналарынан келетін протондық токтар мембраналық потенциалдың -80 мВ-тан +120 мВ-қа дейінгі өзгерістеріне жауап ретінде өлшенеді. pHi = pHo = 6,0 .Сұр іздер ингибитор болмаған кезде өлшенген токтарды білдіреді. Қара із (бақылау) 2 мкм GBTA қосқаннан кейін өлшенген токты білдіреді. Бұл концентрацияда WT қосалқы бірлігі айтарлықтай тежелген жоқ, ал F150A қосалқы бірлігі толығымен дерлік GBTA-мен байланысқан. ({F150A}b-WT). GBTA концентрациясының одан әрі жоғарылауы WT суббірлігінің бітелуіне әкелді (қызғылт сары және қызыл іздер).(c) {F150A}b-WT димерінің концентрацияға тәуелді тежелуі (ингибитормен алдын ала байланысқан) F150A қосалқы бірлігі).Әр нүкте 3-7 өлшемдегі орташа тежелуді ± SD көрсетеді. Қисықтар 1-қосымша кестеде көрсетілген айқын Kd мәндерін алу үшін пайдаланылған Hill сәйкестіктері болды. Кірістірілген гистограммаларда көрсетілген Hill коэффициенттері 3 және 4-ші қосымша суреттерде келтірілген сәйкестіктерден анықталды. Hv1 WT мәндері үзік сызықтар түрінде көрсетілген. Жұлдызшалар WT dimer Hv1 салыстырғанда статистикалық маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (p GBTA Hv1 тежелуі ашық арнада өлшенгендіктен, біз GBTA байланыстырушы кооперативтілікті ашық күйде бөлімшеаралық байланыс механизмін зерттеу үшін пайдалануға болады деп ойладық. Бұл екі Hv1 суббірлігі бұрын 19,20,21, бірлескен түрде жабылатыны анықталды, 22 және вентиляцияға қатысатын суббірлік аралық қосылыс цитоплазмалық ширатылған катушкалар (CCD) 22,25 доменімен делдалды болу ұсынылды. Сондықтан біз CCD ашық күйдегі GBTA байланыстыратын тораптар арасындағы байланысқа қатыса ма деп сұрадық. Триглицин S4 трансмембраналық фрагменті мен ширатылған катушкалар домені арасындағы интерфейстегі мутациялар димеризация тұтастығын сақтай отырып, бұл доменді арнаның қалған бөлігінен ажырату үшін алдыңғы зерттеулерде көрсетілген. Сондықтан біз V220G, K221G және T222G мутацияларының әсерін сынадық (Cурет 1). .5a, GGG мутант) GBTA байланыстырушы кооперация. Біз жабайы типпен салыстырғанда GBTA арналарымен байланысуының Hill коэффициентінің статистикалық маңызды емес (p > 0,05) төмендеуін таптық, бұл оның сақтаудағы рөліне қарамастан деп болжайды. екі суббірлік бірге маңызды, бірақ ПЗС GBTA байланыстыру орындары арасындағы суббірлікаралық аллостериялық байланысқа тікелей делдал болмайды.
(a) S4 ішкі ұшында триглицин мутациясы бар Hv1 димерінің схемалық диаграммасы, цитоплазмалық орамды домен арқылы (көк көрсеткілер) делдалдық суббірліктер аралық байланысын бұзуға арналған. (b) Hv1 димерлерінің схемалық көрінісі көрсетілген мутациялар, суббірліктер (көк көрсеткілер) арасындағы байланысқа қатысатын S1 фрагменттерін сынауға арналған.(c–h) 2GBI (көгілдір) және GBTA (қара қызыл) көрсетілген құрылымдарды концентрацияға тәуелді түрде тежейді. Әрбір нүкте орташа тежелуді білдіреді. ± SD 3-10 өлшем. Қисық айқын Kd мәндерін алу үшін пайдаланылатын Hill сәйкестігі болды (Қосымша 1 кестені қараңыз). Интерполяцияланған гистограммалардағы төбелік коэффициенттер Әдістер бөлімінде сипатталғандай анықталды (Қосымша 3 және 4-суреттерді қараңыз). Анықтамалық h мәндері Hv1 WT үзік сызықтар түрінде көрсетілген. Жұлдызшалар мутант және WT үзінділері арасындағы статистикалық маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (p Біз GBTA кооперативтік байланысуының тікелей медиаторы ретінде CCD-ны жоққа шығарғандықтан, біз VSD-лер арасындағы өзара әрекеттесулер байланыстыратын тораптар арасындағы аллостериялық байланысқа қатыса ма деп сұрадық. Біз GBTA-байланыстырушы кооперативтік D112 қалдығының консервативті мутациясымен жойылғанын анықтадық (3c-сурет) орналасқан. S1 трансмембраналық сегментінде.S1 құрамында D112 сияқты спиралдың бір жағында орналасқан, бірақ фрагменттің 24 сыртқы ұшына жақынырақ орналасқан, басқа екі теріс зарядталған қалдық, E119 және D123 бар. Молекулярлық динамиканың алғашқы модельдеулері бұл қалдықтардың байланысқандығын көрсетті. су желілері арқылы D112-ге36,37.Сондықтан біз E119 және D123 GBTA-байланыстыратын учаскелер арасындағы аллостериялық байланысқа қатысы бар-жоғын тексердік (5б-сурет). Теріс бақылау ретінде біз D123 жанында орналасқан K125 сақталған оң зарядталған позицияны сынадық. бірақ S1 спиралының екінші жағында (5б-сурет).
Біз E119A, D123A және K125A арналарының концентрацияға тәуелді тежелуін 2GBI және GBTA арқылы өлшедік және E119A және K125A мутациялары жабайы түрмен салыстырғанда кез келген ингибитордың Hill коэффициентін айтарлықтай өзгертпейтінін анықтадық (p > 0,05, 5d, i сурет) ). Екінші жағынан, D123A мутациясы GBTA Hill коэффициентін айтарлықтай төмендетті (p 0,05/14).
Екі бөлімшедегі зарядты 123-позицияда бейтараптандыру GBTA байланыстырушы ынтымақтастығында күшті өзгеріске әкелгендіктен, ал екі бөлімшедегі зарядты кері қайтару шамалы ғана әсер еткендіктен, біз талдауды зарядтың инверсиялық арнасы бар тек бір қосалқы бірлікті қамту үшін кеңейттік. C-терминал бөлімшесінде D123R алмастыруымен Hv1-байланысты димерлерді түзді (5б-сурет) және GBTA және 2GBI арқылы концентрация-жауап тежелуін өлшеді. Біз GBTA WT-D123R арналарымен байланысуының Hill коэффициенті одан айтарлықтай жоғары екенін анықтадық. жабайы типті Hv1 (p Сондай-ақ, D112E мутациясының WT-D123R фоны арқылы өндірілген GBTA-байланыстырушы Hill коэффициентінің ұлғаюын жойғанын анықтадық (5b,h-сурет және қосымша 4-сурет). 2GBI байланыстырудың Hill коэффициентіне әсері де жойылды ( 5h-сурет және қосымша 3-сурет).Бұл тұжырымдар 123-позициядағы қарама-қарсы зарядтардан туындаған суббірліктер арасындағы күшейтілген аллостериялық байланыс D112 позициясындағы байланыстыру орны бұзылған кезде күшті байланыстыру кооперациясына айналмайтынын көрсетеді.
Егер іргелес ашық суббірліктердегі D123 қалдықтары бір-бірімен электростатикалық әрекеттесу үшін жеткілікті жақын болса, теріс зарядтар арасындағы кері әсерлесу аспарагин қышқылын аргининге ауыстыру арқылы теріс және оң зарядтардың қосындысына айналады деп ойладық. олардың арасындағы тартымды өзара әрекеттесу.Бір суббірлік (WT-D123R dimer). Тартымды өзара әрекеттесулер S1 фрагментінің сыртқы ұштары арасындағы интерфейсті нығайта алады, бұл суббірліктер арасындағы күшті аллостериялық байланысқа және GBTA-байланыстырушы кооперацияның жоғарылауына әкеледі.
Бұл гипотезаны қолдау үшін біз S1 сегментінің сыртқы ұштары арасындағы интерфейсті күшейтудің жолын іздедік, ол 123 позициядағы зарядтың ауысуынан ерекшеленеді. Ли және т.б. I127 Hv1 қалдығының цистеинге мутациясы бұрын табылған. спонтанды суббірлікаралық кросс-байланысқа әкеледі17.Сонымен қатар, Hv1-CiVSP химерикалық VSD кристалдық құрылымы I127 S1 спиральының сыртқы ұшынан тек бір қалдықпен бөлінгенін көрсетті24. Сондықтан біз арасында коваленттік байланыстың түзілуін сұрадық. Күшті S1-S1 өзара әрекеттесуіне әкеледі деп күтілетін 127-позициядағы цистеиндер 123-позициядағы зарядты өзгерту арқылы байқалғанға ұқсас GBTA байланыстыру кооперациясына әсер етеді.
Біз Hv1 I127C концентрациясына байланысты GBTA және 2GBI арқылы 10 мМ β-меркаптоэтанол (βME) бар және жоқ тежелуін өлшедік (6а-сурет). Жасуша ішілік ерітіндіге ингибиторды қосумен бір уақытта төмендететін агент жасушадан тыс ерітіндіге қосылады. Теріс бақылау ретінде тек бір суббірлікте цистеинді алмастыратын байланысқан димер (WT-I127C) пайдаланылды (6а-сурет). Біз суббірлік аралық байланыстың спонтандық әсерін өлшей алмадық. 2GBI тежеу бойынша I127C суббірліктер арасында, өйткені βME бар немесе онсыз Hv1-ге I127C байланысуы үшін Hill коэффициенті моноцистеинмен алмастырылған димерлермен байланысудан айтарлықтай ерекшеленді. Hill коэффициенті WT-I127C-ті ажырата алмады (6b-сурет және қосымша сурет. 3). Керісінше, біз GBTA тежелуіне спонтанды суббірлік аралық байланыстың күрт әсерін өлшедік. βME болмаған кезде Hv1 I127C байланысуға арналған Hill коэффициенті (crosslink on) βME (кросслинка өшірулі) болған кезде немесе димерді байланыстыру үшін WT-127C көмегімен (крест байланыс болмаған кезде) өлшенгеннен айтарлықтай жоғары болды (6c-сурет және қосымша 4-сурет), бұл аллостериялық байланыстың екенін көрсетеді. байланыстыру орындары арасындағы S1 фрагменттерінің сыртқы ұштары арасындағы дисульфидті байланыстардың түзілуімен айтарлықтай күшейеді. Бұл нәтижелер WT-D123R димеріндегі 123 позициядағы аспартат пен аргининнің тартымды электростатикалық әрекеттесуінің нәтижесінде аллостериялық байланыстардың жоғарылауына әкелетінін түсіндіруді қолдайды. суббірліктер.
Ашық күйдегі байланыс екі бөлімшедегі S1 сегментінің сыртқы ұштары арасындағы тікелей физикалық өзара әрекеттесу арқылы жүзеге асады.
(a) суббірлікаралық цистеиннің көлденең байланыстарының GBTA байланыстыру ынтымақтастығына қалай әсер ететінін зерттеуге арналған мутантты Hv1 димерлерінің және линкер димерлерінің схемалық көрінісі. (bd) 2GBI (b,d) және GBTA (c, e) жасушадан тыс ерітіндіде 10 мМ βМЭ бар немесе жоқ болғанда. Әрбір нүкте 3-тен 10-ға дейінгі өлшеулердің орташа тежелу ± SD деңгейін білдіреді. Қисық Kd мәндерін алу үшін пайдаланылған Hill сәйкестігі болды (Қосымша 1 кестені қараңыз). Кірістірілген гистограммалардағы төбелік коэффициенттер 3 және 4 қосымша суретте көрсетілген сәйкестіктерден анықталды. (c,e) жұлдызшалар статистикалық маңызды айырмашылықтарды көрсетеді. GBTA тежелуінің әртүрлі шарттары арасында (p 0,05).
Біз сондай-ақ βME болмаған кезде GBTA D112E I127C Hv1 димерімен байланысуының Hill коэффициенті қалпына келтіретін агенттердің қатысуымен өлшенгеннен айтарлықтай жоғары екенін анықтадық (6e-сурет және қосымша сурет. 4), бұл D112E мутациясын білдіреді. цистеиннің 127 кросс-байланысуының нәтижесінде GBTA байланыстыру кооперациясының жоғарылауын жойған жоқ. D112E, I127C Hv1 димерлерімен байланысуының 2GBI Hill коэффициенті де D112E мутациясына айтарлықтай әсер еткен жоқ (1-сурет).6d және қосымша. 3-сурет).
Біріктірілген бұл нәтижелер GBTA байланысуы іргелес Hv1 суббірліктеріндегі S1 фрагменттерінің сыртқы ұштары арасындағы өзара әрекеттесу арқылы тартымды электростатикалық өзара әрекеттесу арқылы немесе алмастырылған цистеиндер арасындағы коваленттік байланыстарды қалыптастыру арқылы күшейтілетінін көрсетеді. Ынтымақтастыққа тартымды электростатикалық әрекеттесулердің әсерін D112E мутациясымен жоюға болатынымен, коваленттік байланыстардың әсері мүмкін емес.
Гуанидин туындыларын Hv1 арналарымен байланыстыруға арналған химиялық кеңістікті зерттеу барысында біз GBTA сияқты 2-гуанидинотиазолдардың 2-гуанидинобензимидазолдарға қарағанда концентрацияға тәуелділігі жоғары екенін анықтадық (1c-сурет). және мономерлі арналар (2а,б-сурет) және бір суббірлігі ингибиторға алдын ала байланысқан димерлі арнаға (4-сурет) GBTA арқылы Hv1 тежелуі Әрекет синергетикалық процесс және екі суббірліктердегі қосылыстардың байланысу орындары аллостериялық байланысқан. ГБТА-ның ашық арнамен байланысатыны туралы жаңалық, бұрын тиісті қосылыс 2GBI32 үшін көрсетілгендей, аллостериялық қосылыстарды ашық күйде арнайы бағалауға болатынын көрсетеді. Біздің кооперативтік байланыстыру моделі ГБТА арқылы Hv1 тежелуін сандық сипаттай алды (2c-сурет) және мембраналық реполяризациядан кейін арнаның құйрық ағындарының ыдырауына 2GBI және GBTA әртүрлі әсерлерін түсіндіре алды, бұл біздің байланысу процесін түсіндіруді қолдайды.
Екі байланыс орны (Hv1 сияқты) бар аллостериялық ақуызда қол жеткізуге болатын ең жоғары Hill коэффициенті 2. Біз GBTA-ны Hv1 жабайы түрін 1,31 коэффициентімен байланыстыру үшін өлшедік, ол Hv1 I127C-де 1,88-ге дейін өсті. синергетикалық бос энергия, ең төменгі және ең жоғары жақындық учаскелерінің байланыс бос энергиялары арасындағы айырмашылық (Әдістерді қараңыз) Hv1 жабайы типі жағдайында 1,3 ккал/моль және Hv1 I127C жағдайында 2,7 ккал/моль болды. Оттегінің гемоглобинге дейінгі мөлшері бірлескен процестің ең танымал және жақсы зерттелген мысалы болып табылады38. Адам гемоглобині үшін (төрт аллостериялық байланысқан тетрамер) Хилл коэффициенті 2,5-3,0 аралығында, мәндері 1,26-дан 3,64-ке дейін ауытқиды. ккал/моль, тәжірибелік жағдайларға байланысты38. Осылайша, ғаламдық энергетика тұрғысынан GBTA-ның Hv1-мен байланысуының кооперативтілігі екі жүйедегі ақуыз суббірліктерінің әртүрлі сандарын қарастырғанда, O2-нің гемоглобинмен байланысуынан айтарлықтай ерекшеленбейді.
Біздің синергиялық модельде GBTA молекулаларының бір суббірлікпен байланысуы іргелес суббірліктің байланысу аффинділігінің жоғарылауына әкеледі. Біз бірінші байланыстыру оқиғасы (индукцияланған сәйкестік) нәтижесінде туындайтын байланыстыру ортасының қайта реттелуі келесі процесті елестетеміз. Суббірліктер арасындағы өзара әрекеттесудегі өзгерістер. Осы өзгерістерге жауап ретінде іргелес суббірліктер өздерінің байланысу орындарын өзгертеді, нәтижесінде ГБТА тығыз байланысы пайда болады. Бұл процесс барысында S1 аспартаты D112 байланыстыру аффинділігінің жоғарылауымен байланысты байланыс орнының қайта реттелуіне жауап береді. D112 бұрын Hv1 протонды өткізу жолының бөлігі және селективті сүзгі ретінде әрекет ететіні көрсетілген27,28. Біздің нәтижелер Hv1 екі бөлімшелеріндегі селективті сүзгілердің ашық күйде аллостериялық байланысқандығын көрсетеді. 7а-суретте GBTA байланыстыру орнының шамамен орналасуы және D112, D123, K125 және I127 қалдықтарының орналасуы Hv1 VSD негізіндегі схемада көрсетілген. Hv1-CiVSP химерасының кристалдық құрылымы туралы. S1 жасушадан тыс ұшын қамтитын аллостериялық байланыс үшін ұсынылған бағыттар қара көрсеткілермен көрсетілген.
(a) Hv1 VSD схемасы. Hv1-CiVSP химерасының кристалдық құрылымы негізінде бұрандалы сегменттер цилиндрлік болып көрсетілген. Бұл конфигурацияда S4 сегментінің ішкі ұшы CCD-мен біріктіріледі (көрсетілмеген). Байланысқан GBTA-ның болжамды орындары сұр сопақшалар түрінде көрсетілген. Қара көрсеткілер екі іргелес суббірліктердегі байланыс орындары арасындағы аллостериялық байланысқа қатысатын жолдарды көрсетеді. Зерттелетін S1 қалдықтарының позициялары түрлі-түсті шарлармен белгіленген.(b) Hv1 қосалқы бірліктерінің схемалық суреті реттелген. мембраналық жазықтықтың жасушадан тыс жағынан көрінетін екі түрлі димер конфигурациясында. Сол жақ панельде димер интерфейсі S4 спиралімен қалыптасады. Екі VSD-тің мембрана жазықтығына перпендикуляр ось айналасында сағат тілімен 20 градусқа айналуы, сүйемелдеуімен екі S4 бұрандасының сыртқы ұштарын бөлу (үзік көрсеткілер) оң жақта көрсетілген орналасуды жасайды. Бұл конфигурацияда іргелес қосалқы блоктардағы D123 және I127 қалдықтары бір-біріне жақындауға рұқсат етіледі.(c) CiVSP VSD схемалық көрінісі 4G80 кристалдық құрылымында табылған димер конфигурациясында. CiVSP-дегі P140 позициясы Hv1-дегі D123 позициясына сәйкес келеді.
Біздің нәтижелеріміз 123 қалдығы (123D/123D немесе 123R/123R) арасындағы итеруші электростатикалық әрекеттесу ашық күйдегі GBTA-байланыстыратын кооперацияның «қалыпты» деңгейімен байланысты және өзара әрекеттесуді итерілуден тартылғанға ауыстыратынын көрсетеді (123D/123R) , кооперацияның артуы (сурет 5g). Аланинді алмастырумен итермелейтін өзара әрекеттесулерді жою да кооперацияның жоғарылауына әкеледі деп күтілуде. Дегенмен, 123A/123A димерінің кооперативтілігінің төмендеуі байқалды (сурет 5e). Бір мүмкін. Түсініктеме: гидрофобты қалдықтарды гидрофильді ортада орналастырудың тұрақсыздандырғыш әсері D123 қалдықтары арасындағы итеруші әрекеттесулердің жойылуына байланысты тұрақтандырушы әсерден басым болуы мүмкін, бұл байланыстыру кооперациясының жалпы төмендеуіне әкеледі. Мони және т.б.39 жақында еріткіштің қолжетімділігі Ciona gutis Ci-Hv1 D171 позициясы (адам Hv1-дегі D123-ке сәйкес) белсендіру кезінде жоғарылайды, бұл D123 ашық күйдегі гидрофильді ортада орналасқан деген түсінікті қолдайды.
Hv1 арналарының жабылуы бірнеше ауысулар арқылы жүзеге асатыны белгілі19,20,26,39,40,41.Qiu және т.б. , одан кейін протондардың екі суббірлік жолында ашық өткізгіштігін тудыратын айқын ауысу. Кернеу датчигінің конформациялық өзгеруі кернеу қысқышының флуоресценциясымен бақыланды және екінші ауысу D171 позициясындағы мутациямен селективті түрде бұзылғаны анықталды. Флуоресцентті сигналдың бұзылуы конформациялық өзгерістің реакция координаталары бойында қандай да бір нүктеде іргелес суббірліктердің D171 қалдықтары арасындағы электростатикалық әрекеттесулердің болуына сәйкес келеді. Бұл интерпретация D123 қалдығының ашық күйде электростатикалық әрекеттесетіні туралы тұжырымымызға сәйкес келеді. және GBTA байланыстыру орындары арасындағы аллостериялық байланысқа делдалдық жасайды.
Fujiwara және т.б. 25 цитоплазмалық орамды доменнің димер интерфейсі екі S4 спиральдан тұратын мембранаға созылуын ұсынды (7б-сурет, сол жақ панель). Бұл суббірлік аралық әрекеттесу моделі цистеинді кросс-байланыстыру талдауына негізделген. бүкіл VSD және S4 спиралі мен CCD-ны байланыстыратын аймақтың функционалдық талдауы. Трансмембраналық рН градиенті болмаған жағдайда, Hv1 арналары ашылуы үшін айтарлықтай мембраналық деполяризацияны қажет етеді, ал цистеиннің айқаспалы байланысы арна басым түрде жабылған жағдайда жүреді. Демек, анықталған S4-S4 интерфейсі күйден тыс ішкі бірлік конфигурациясын көрсетуі мүмкін. Басқа зерттеулерде S1 және S2-нің шлюз кезінде бөлімше аралық өзара әрекеттесуіне қатысты дәлелдер табылды17,21,26, бұл арналар ашық және ішкі бөлімшелерде әртүрлі суббірлік конфигурацияларын қабылдауы мүмкін деген болжам жасады. жабық күйлер, бұл идея Mony және т.б. S1 шлюз кезінде 39 жылжытады.
Мұнда біз ашық күйде S1 спиральының жасушадан тыс ұштары суббірліктер арасындағы аллостериялық байланысқа делдалдық жасайтын тікелей электростатикалық әрекеттесулерді қолдау үшін жеткілікті жақын екенін көрсетеміз. Кеңейтілген S4-S4 өзара әрекеттесулері бар димер конфигурациясында S1 спиральдары тым алыс. тікелей өзара әрекеттесу үшін бір-бірінен бөлек. Дегенмен, мембрана жазықтығына перпендикуляр осьтің айналасында екі VSD бөлімшесінің сағат тілімен 20° айналуы екі S4 спиралының сыртқы ұштарының бөлінуімен үйлеседі, сәйкес S1-S1 конфигурациясын берді. нәтижелерімізбен (сурет 7b, оң жақ панель). Біз бұл конфигурацияны ашық күйдегі арна үшін ұсынамыз.
CiVSP ферменті мономер ретінде жұмыс істейді деп есептелсе де, оның оқшауланған VSD кристалдық құрылымы димер күйінде ұсталады. Бұл димердегі S1 спиралдарының сыртқы ұштары кеңістікте бір-біріне жақын және жалпы конфигурация ұсынылғанға ұқсас. Hv1 үшін (7c-сурет). CiVSP димерінде іргелес суббірліктен ең жақын қалдық 140-позицияда пролин болды (7c-сурет). Бір қызығы, CiVSP-дегі P140 Hv1-дегі D123 позициясына сәйкес келеді. Hv1 арасындағы суббірлік конфигурациясындағы ұқсастық. және CiVSP димерлері бұл белоктардың VSD-лерінің S1 жасушадан тыс ұштары өзара әрекеттесетін интерфейсті қалыптастыруға тән тенденциясы бар екенін көрсетеді.
Шәует жасушаларын белсендірудегі Hv1 маңызды рөлі бұл арнаны ерлердің құнарлылығын бақылау үшін тартымды дәрілік мақсатқа айналдырады.Сонымен қатар, микроглиядағы Hv1 белсендіруі ишемиялық инсульттан қалпына келтіруді нашарлататыны көрсетілген. сүт безі 12 немесе тік ішек обыры бар науқастарда өмір сүру 13 және В-жасушалық қатерлі ісіктерге ықпал етеді деп есептеледі 11 .Сондықтан, Hv1-ге бағытталған шағын молекулалы препараттар нейропротекторлық агенттер немесе ісікке қарсы терапия ретінде пайдаланылуы мүмкін. Гуанидинотиазол туындыларының сәйкес диапазонды қайта тудыруы мүмкін екендігінің ашылуы Ашық Hv1 суббірлігі, байланыстыру аффинділігінің жоғарылауына алып келеді, Hv1 арналарына бағытталған анағұрлым күшті препараттардың дамуына әкелуі мүмкін.
Адамның Hv1 сайтына бағытталған мутагенезі стандартты ПТР әдістерін қолдану арқылы орындалды. Hv1NCCiVSP құрылымында Hv1 1-96 және 228-273 қалдықтары CiVSP18 1-113 және 240-576 қалдықтарымен ауыстырылды. Hv1-сілтемеде, бір суббірліктің C-соңы GGSGGSGGSGSGGSGG сілтемесі арқылы екінші бөлімшенің N-соңысымен байланысқан. Түрлі құрылымдары бар pGEMHE плазмидалары Nhe1 немесе Sph1 шектеу ферменттерімен (New England Biolabs) сызықтандырылды және РНҚ синтезімен орындалды. T7 mMessage mMachine транскрипция жинағы (Ambion). Электрофизиологиялық өлшеулерден 1-3 күн бұрын cRNA Xenopus ооциттеріне енгізілді (әр жасушаға 50 нл, 0,3-1,5 мкг/мкл). Xenopus laevis-тен V және VI сатыдағы ооциттер алынды (SCO) Ecocyte Bioscience. .
2-гуанидино-бензимидазол[1], 2-гуанидино-бензотиазол[2], (4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин [5], (5-бромо-4-метил-1,3) -тиазол-2-ил)гуанидин) [6], этил 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилат [8], этил 2-гуанидино-4- метил-1,3-тиазол- 5-карбоксилат [9] және (2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)этилацетат [10] Sigma-Oldrich компаниясынан алынды. Фамотидин [7] MP Biomedicals компаниясынан алынды.1-[4 -(4-Хлорфенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин[11] және 1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин [12] болды Matrix Scientific компаниясынан. Бұл қосылыстар коммерциялық қол жетімді ең жоғары тазалыққа ие. Олар 100 мМ қор ерітіндісін жасау үшін құрғақ DMSO-да ерітілді, содан кейін ол жазу ерітіндісінде қажетті соңғы концентрацияда сұйылтылды. 3 және 4 қосылыстар төменде синтезделді. кем дегенде 99% тазалық.
2-амино-4-(трифторметил)бензенетиол гидрохлоридінің (1,02 г, 4,5 ммоль) 25 мл сулы тұз қышқылының (2,5 Н) суспензиясына қатты дициандиамид (380 мг, 4,5 ммоль) және алынған гетероген қосылды. 4 сағат бойы қатты араластыру арқылы кері тоңазытқышта болды. Реакция қоспасы бөлме температурасына дейін салқындатылды және 10Н калий гидроксидін біртіндеп қосу арқылы бейтараптандырылды. Түзілген ақ тұнба сүзілді, суық сумен (3 × 50 мл) жуылды, пеште кептірілді ( 65 °C) бірнеше сағат бойы, содан кейін ақ түсті қатты зат алу үшін этилацетат/мұнай эфирінен қайта кристалданады (500 мг, 48 %); mp 221–222 °C (жарық 225–226 °C) 45; 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (өте кең с, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Гц), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d) , 1 H, J = 8,1 Гц).13C ЯМР (200 МГц, DMSO-d6): δ = 114,2 (d, J = 3,5 Гц), 117,5 (d, J = 3,5 Гц), 121,7, 124,6 (q, J) = 272 Гц), 126,1 (q, J = 272 Гц) = 31,6 Гц), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.HRMS (ESI): m/z есептелген мән. C9H8F3N4S (M + H)+ үшін: 046, табылды. : 261.0419.
Бұрын сипатталғандай синтезделген нафто[1,2-д]тиазол-2-амин (300 мг, 1,5 ммоль), кішкене пробиркадағы май ваннасында 200 °C дейін қыздырылды.300 мг (көп артық) цианамид және 1,0 мл конс. Ыстық қосылысқа тез тұз қышқылы қосылды және қоспаны май ваннасында шамамен 2 минут ұстады, осы уақыт ішінде судың көп бөлігі буланып кетті. Содан кейін реакциялық қоспаны бөлме температурасына дейін салқындатып, нәтижесінде қатайған материал алынды. ақшыл сары түсті аморфты қатты затты алу үшін кішкене бөліктерге бөлініп, сумен жуылды. (38 мг, 10%) мп 246-250 °C; 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Гц), 7,66 (t, 1 H, J = 8,3 Гц), 7,77 (d, 1 H) , J = 8,6 Гц), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Гц), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Гц), 8,35 (d , 1 H, J = 8,3 Гц).13C NMR (150) МГц, DMSO-d6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.HRMS (ESI): есептелген m/z4M2.0 99 , табылған: 243.0704.
Протон токтары pClamp10 бағдарламалық құралы бар Axon Digidata 1440A (молекулярлық құрылғылар) басқаратын Axopatch 200B күшейткіші арқылы әртүрлі құрылымдарды білдіретін ооциттердің ішкі және сыртқы патчтарында өлшенді. Жасушаішілік және жасушадан тыс ерітінділердің құрамы бірдей: 100 мМ 2-(N-N-морфолино). )этансульфон қышқылы (МЭС), 30 мМ тетраэтиламмоний (ТЭА) мезилаты, 5 мМ ШАЙ хлориді, 5 мМ этиленгликол-бис(2-аминоэтил)-N,N,N',N'-тетрасірке қышқылы (EGTA), теңшелген TEA гидроксидімен рН 6,0. Барлық өлшеулер 22 ± 2 °C температурада орындалды. Тамшуырдың кіру кедергісі 1,5–4 МΩ. Ток іздері 1 кГц жиілікте сүзіліп, 5 кГц жиілікте сынама алынды және Clampfit10.2 (Молекулалық құрылғылар) көмегімен талданды. ) және Origin8.1 (OriginLab).
Hv1 ингибиторының әртүрлі концентрациясы және кейбір жағдайларда 10 мМ βМЭ бар ерітінділер ваннаға VC-6 перфузиялық клапан жүйесіне (Warner Instr.) қосылған коллектор арқылы гравитация арқылы енгізілді, ол pClamp бағдарламалық құралы TTL (Transistor-) арқылы өтті. Transistor Logic) сигналдары. Жылдам перфузия эксперименттері патч тамшуырының алдына орнатылған диаметрі 360 мкм жеткізу ұшы бар көп түтікті перфузиялық қарындашты (AutoMate Sci.) пайдалану арқылы орындалды. Арнаның тежелуі изохрональды амперометриялық өлшемдер соңында анықталды. +120 мВ деполяризациялық импульс. GV өлшемдері бұрын сипатталғандай орындалды18,20. Артық токтар деполяризация қадамдарынан кейін -20 мВ-тан +120 мВ-қа дейінгі әртүрлі кернеулерде, егер басқаша көрсетілмесе, -40 мВ-та тіркелді. Сынақ импульсінің алдындағы анықтамалық импульс ағымдағы ыдырауды түзету үшін пайдаланылады 18 . GV графигі Больцман теңдеуіне сәйкес келеді:
Арналар мен ингибиторлардың әртүрлі комбинациялары үшін айқын диссоциация константалары (Kd) (Қосымша 1-кесте) ингибирлеудің концентрацияға тәуелділігін (орташа %inhib мәндері) Hill теңдеуімен сәйкестендіру арқылы анықталды:
Мұндағы [I] – I ингибиторының концентрациясы және h – Hill коэффициенті. Hill коэффициентін есептеу үшін (2) теңдеу келесі түрде қайта реттеледі:
Жіберу уақыты: 07 маусым 2022 ж
