Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport limitat per a CSS. Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per assegurar-vos suport continuat, mostrarem el lloc sense estils ni JavaScript.
El canal de protons activat per voltatge Hv1 és un complex dimèric que consisteix en dos dominis sensors de voltatge (VSD), cadascun dels quals conté una via de permeació de protons activada. La dimerització està controlada pel domini de bobina citoplasmàtica. La transició de l'estat tancat a se sap que l'estat obert en ambdós VSD es produeix de manera cooperativa; tanmateix, se sap poc sobre els mecanismes subjacents. Les interfícies intersubunitats juguen un paper clau en els processos al·lostèrics; tanmateix, aquestes interfícies no s'han identificat en canals Hv1 oberts. Aquí demostrem que els derivats de 2-guanidinotiazol bloquegen dos VSD Hv1 de manera cooperativa i utilitzen un d'aquests compostos com a sonda per a l'acoblament al·lostèric entre subunitats obertes. Hem trobat que les interfícies extracel·lulars L'extrem del primer fragment transmembrana de VSD forma una interfície intersubunitat que media l'acoblament entre els llocs d'unió, mentre que el domini de la bobina enrotllada no està directament implicat en aquest procés. També hem trobat una forta evidència que el filtre selectiu de protons del canal controla la cooperació d'unió dels bloquejadors. .
Els canals de protons dependents de voltatge juguen un paper important en una varietat d'organismes, des del fitoplàncton fins als humans1. A la majoria de les cèl·lules, aquests canals medien l'eflux de protons de la membrana de protons i regulen l'activitat de la NADPH oxidasa. L'únic canal de protons dependent de voltatge conegut en humans és Hv1, que és el producte del gen HVCN12,3. S'ha demostrat que Hv1 (també conegut com VSOP) té un paper en la proliferació de cèl·lules B4, la producció d'espècies reactives d'oxigen pel sistema immunitari innat5,6,7,8, espermatozoides. motilitat9 i regulació del pH del líquid superficial de les vies respiratòries10. Aquest canal està implicat en diversos tipus de càncer com ara tumors malignes de cèl·lules B4,11 i càncers de mama i colorectal12,13. Es va trobar que l'activitat Hv1 excessiva augmenta el potencial metastàsic de les cèl·lules canceroses 11, 12. Al cervell, Hv1 s'expressa. per la microglia, i s'ha demostrat que la seva activitat agreuja el dany cerebral en models d'ictus isquèmic.
La proteïna Hv1 conté un domini sensible al voltatge (VSD), que consta de quatre segments transmembrana anomenats S1 a S414. El VSD s'assembla als dominis corresponents dels canals de Na+, K+ i Ca2+ dependents de voltatge i fosfatases sensibles al voltatge, com ara CiVSP de Ciona gutis15.En aquestes altres proteïnes, l'extrem C-terminal de S4 s'uneix a un mòdul efector, el domini del porus o enzim. A Hv1, S4 està enllaçat al domini de bobina en espiral (CCD) situat al costat citoplasmàtic de la membrana. .El canal és un complex dimèric format per dos VSD, cadascun conté una via de permeació de protons tancada16,17,18. Es va trobar que aquestes dues subunitats Hv1 s'obren de manera cooperativa19,20,21,22, cosa que suggereix que l'acoblament al·lostèric i les interaccions entre subunitats juguen un paper important en el procés de gating. La interfície entre les subunitats dins del domini de la bobina enrotllada està ben definida perquè les estructures cristal·lines dels dos dominis aïllats estan disponibles22,23. D'altra banda, la interfície entre els VSD dins de la membrana no és ben entesa. L'estructura cristal·lina de la proteïna quimèrica Hv1-CiVSP no proporciona informació sobre aquesta interfície, ja que l'organització trimèrica del complex del canal cristal·litzat pot resultar de la substitució del CCD natiu Hv1 per la cremallera de leucina de llevat GCN424.
Un estudi recent de l'organització de la subunitat del canal Hv1 va concloure que dues hèlixs S4 transicionen al CCD sense una interrupció severa de l'estructura secundària, donant lloc a hèlixs llargues que parteixen de la membrana i es projecten al citoplasma. Basant-se en l'anàlisi de reticulació de cisteïna, aquest estudi proposa que els VSD Hv1 es contacten entre ells al llarg del segment S4. No obstant això, altres estudis han proposat interfícies alternatives entre els VSD. Aquestes interfícies inclouen els segments S1 17, 21, 26 i els extrems exteriors del segment S2 21. Una possible raó del conflicte Els resultats d'aquests estudis són que l'acoblament al·lostèric entre els VSD es va examinar en relació amb el procés de gating, que depèn dels estats tancat i obert, i la interfície entre els VSD pot variar en diferents canvis d'estat en la conformació.
Aquí, vam trobar que el 2-guanidinotiazol inhibeix els canals Hv1 en unir-se sinèrgicament a dos VSD oberts i vam utilitzar un dels compostos, el 2-guanidinobenzotiazol (GBTA), per investigar la interacció entre subunitats en estat obert. Interfície. Hem trobat que la corba d'unió GBTA es pot descriure bé mitjançant un model quantitatiu en què la unió d'un inhibidor a una subunitat dóna lloc a un augment de l'afinitat d'unió de la subunitat adjacent. També hem trobat que els residus D112, filtres de selectivitat per a la el canal 27, 28 i part del lloc d'unió del derivat de guanidina 29 controlen la cooperativitat d'unió GBTA. Mostrem que la unió cooperativa es manté al dímer Hv1, on el CCD es separa del segment S4, cosa que suggereix que la interfície intersubunitat del CCD no es manté directament. mediar l'acoblament al·lostèric entre els llocs d'unió a GBTA. En canvi, trobem que el fragment S1 forma part de la interfície entre les subunitats i proposem una disposició de VSD adjacents amb l'extrem extracel·lular de l'hèlix S4 allunyat del centre del dímer per permetre el fragment S1 estigui en estat obert.
Els inhibidors de molècules petites de Hv1 són útils com a fàrmacs anticancerígens i agents neuroprotectors. No obstant això, fins ara, pocs compostos han estat capaços d'inhibir el canal30,31,32,33. Entre ells, el 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, compost [1] a la Fig. 1a) i els seus derivats bloquegen la penetració de protons a través del canal VSD29,32. Es creu que la unió d'aquests compostos es produeix de manera independent a les dues subunitats obertes. El 2-guanidinobenzotiazol (GBTA, compost [2] a la figura 1a) va ser anteriorment es va demostrar que inhibeix Hv1 gairebé tan eficaçment com 2GBI quan es va provar a una concentració de 200 μM (figura 1b). Hem examinat altres derivats de tiazol i hem trobat que alguns d'ells inhibien el canal amb una potència similar o més gran que la GBTA (figura 1 i suplementari). text).Vam determinar les corbes de resposta de concentració de quatre derivats de tiazol (GBTA i compostos [3], [6] i [11], Fig. 1c) i vam trobar que eren més pronunciades que les de 2GBI. Els coeficients de Hill (h) dels derivats del tiazol van oscil·lar entre 1,109 ± 0,040 i 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c i figura suplementària 1). En canvi, el coeficient de Hill per a 2GBI va ser de 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a i Fig. 1 suplementària). Un coeficient de Hill per sobre d'1 indica cooperativitat d'enllaç. Perquè cada subunitat Hv1 té el seu propi inhibidor- lloc d'unió,29,32 vam raonar que la unió d'un derivat de tiazol a una subunitat podria millorar la unió d'una segona molècula inhibidora a la subunitat adjacent. GBTA va ser el compost de prova amb el coeficient de Hill més alt. Per tant, vam triar aquest compost per estudiar més el mecanisme de sinergia d'unió i utilitzar 2GBI com a control negatiu de referència.
(a) Compostos de prova: [1] Inhibidor Hv1 de referència 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidina, [4] nafto[1,2-d][1,3] Tiazol-2-il -guanidina, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [7] famotidina, [8] èster etílic de l'àcid 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxílic, [9] 2-guanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-carboxilat, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)acetat d'etil, [11]1-[4-(4-Clorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina .(b) Inhibició de l'activitat Hv1 humana pels guanidinotiazols indicats i el compost de referència 2GBI (barres blau-verdes) Els corrents de protons .Hv1 es van mesurar en plaques interiors d'oòcits de Xenopus en resposta a la despolarització d'un potencial de retenció de -80 mV a +120 mV. Cada inhibidor es va afegir al bany a una concentració de 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Les dades són mitja±SEM (n≥4).(c) Inhibició depenent de la concentració de Hv1 humà per compostos [2], [3], [6] i [11].Cada punt representa la inhibició mitjana ± SD de 3 fins a 15 mesures. La línia és un ajust de Hill utilitzat per obtenir els valors aparents de Kd reportats a la taula suplementària 1. Els coeficients de Hill es van determinar a partir dels ajustaments indicats a la figura suplementària 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vegeu Mètodes).
(a, b) Els compostos 2GBI i GBTA van inhibir Hv1 dimèric i monomèric de manera dependent de la concentració. Cada punt representa la inhibició mitjana ± SD de 3 a 8 mesures i la corba és un ajust de Hill. Els coeficients de Hill (h) es mostren a els histogrames inserits es van determinar a partir dels ajustos reportats a les figures complementàries 3 i 4. La resposta a la concentració de GBTA que es mostra a (a) és la mateixa que a la figura 1c. Vegeu la taula suplementària 1 per obtenir valors aparents de Kd. (c) Modelització de la unió cooperativa de GBTA al dimèric Hv1. La línia negra sòlida representa l'ajust a les dades experimentals mitjançant l'equació (6), que descriu el model d'unió que es mostra a (d). Les línies discontínues marcades Sub 1 i Sub 2 representen l'associació bimolecular -corbes d'equilibri de dissociació del primer i segon esdeveniments d'unió, respectivament (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagrama esquemàtic del mecanisme proposat del bloc Hv1. En el cas de GBTA, la unió a una subunitat oberta augmenta l'afinitat de la subunitat oberta adjacent (Kd2 Els canals Hv1 es poden monomeritzar substituint els seus dominis citoplasmàtics N i C-terminals per les parts corresponents de la fosfatasa sensible al voltatge de Ciona Intestinalis CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34. Hem mesurat la dependència de la concentració de la inhibició de Hv1 monomèric per GBTA i 2GBI. els va comparar amb la inhibició del canal dimèric (tipus salvatge) (Fig. 2a, b). Hem trobat que la diferència en la cooperativitat d'unió entre els dos compostos es va eliminar en Hv1 monomèric, donant suport a l'explicació que la unió de GBTA a una subunitat augmenta la afinitat de l'altra subunitat per l'inhibidor. Vam raonar que la unió de GBTA a una subunitat Hv1 podria provocar una reordenació del lloc d'unió (induint l'ajust 35), que desencadenaria la reordenació del lloc d'unió vacant de la subunitat adjacent, donant lloc a un augment de la unió. afinitat.
Per descriure quantitativament la unió cooperativa de GBTA al canal, hem utilitzat un model en què qualsevol de les subunitats pot unir la primera molècula inhibidora després d'una reacció bimolecular amb una constant de dissociació Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO + B ⇆ BO * ). La unió fa que el canal adopti un estat en què les subunitats buides restants s'uneixen a l'inhibidor després d'una reacció bimolecular única amb una constant de dissociació Kd2, on Kd2 La línia negra sòlida de la figura 2c és l'ajust de l'equació del model a la corba de concentració-resposta experimental, donant un Kd1 de ~ 290 μM i un Kd2 de ~ 29 μM (secció de mètodes, equació (6)). El model també descriu la unió de 2GBI, on Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). En Hv1 monomèric, només hi ha un lloc d'unió i un Kdm (O° + B ⇆ B°). En el cas de GBTA, Kdm és d'uns 54 μM, que és més semblant a Kd1 que a Kd2 (Fig. 2d). En altres paraules, el lloc d'unió del monòmer es troba en una configuració (O°) més semblant a l'estat d'alta afinitat (BO*) que a l'estat de baixa afinitat. estat d'afinitat (OO) del dímer, probablement a causa de l'eliminació de la interfície entre subunitats.
Com es va mostrar anteriorment per a 2GBI32, vam trobar que GBTA va suprimir els corrents Hv1 bloquejant el canal quan estava obert en lloc de fer-lo més difícil d'obrir (figura suplementària 2a, b, d). en resposta a la repolarització de la membrana, però aquest fenomen no es va observar a GBTA (figura suplementària 2c). En presència d'inactivació Hv1 en presència de 2GBI, les portes de cada subunitat no es poden tancar fins que el bloquejador abandona el lloc d'unió (el " foot gate”) i 2GBI es desenllaça més lentament que les portes tancades. Si una subunitat Hv1 es desbloqueja i es tanca, mentre que la subunitat adjacent roman bloquejada, la desenllaç de les molècules de 2GBI restants es fa més lenta (captura de bloquejadors). només una subunitat bloquejada condueix els protons de manera transitòria abans de tancar-se i fa una contribució significativa al corrent de cua que s'estén lentament.
La constatació que la decadència dels corrents de cua Hv1 no es va alentir significativament en presència de GBTA (figura suplementària 2c) és coherent amb un mecanisme d'unió sinèrgica per a aquest bloquejador (Fig. 2d). Una vegada que una molècula GBTA es deslliga de la subunitat Hv1 , l'afinitat del bloquejador amb la subunitat adjacent cau aproximadament 10 vegades, afavorint el procés de desenllaç. Això vol dir que la segona molècula de GBTA té una probabilitat molt més gran de desfer-se abans de quedar atrapada al canal. Espècies de canal de llarga vida que produir només una subunitat de bloqueig s'espera que sigui molt més abundant en presència de GBTA que en presència de 2GBI, donant lloc a una decadència del corrent de cua més ràpida.
Perquè GBTA s'uneixi de manera cooperativa amb les dues subunitats Hv1, els llocs d'unió s'han d'acoblar al·lostèricament. Cada lloc d'unió ha de ser capaç de: 1) desencadenar una cadena d'esdeveniments que es comuniquen amb subunitats adjacents lligades a l'inhibidor i 2) mediar el transició de la unió de baixa afinitat a la d'alta afinitat. Vam raonar que si els residus específics dins del lloc d'unió contribuïen al procés cooperatiu, la seva mutació hauria d'alterar el coeficient de Hill de la corba de concentració-resposta de la inhibició de GBTA de Hv1. Residus D112, F150 , S181 i R211 anteriorment es va demostrar que formaven part de l'entorn d'unió 2GBI29 i vam plantejar la hipòtesi que estarien implicats de manera similar en la unió de GBTA (Fig. 3A). Hem mesurat les corbes de concentració-resposta inhibidores de GBTA per als canals mutants D112E, F150A, S181A. , i R211S (Figura 3) i van comparar els seus coeficients de Hill amb els de tipus salvatge Hv1, utilitzant 2GBI com a referència. El residu V109 es troba a la mateixa cara del segment S1 que D112 i té un gir helicoïdal addicional dins de la cel·la. V109 no va estar implicat en la unió de 2GBI29, vam utilitzar el mutant V109A com a control (Fig. 3b).
(a) Residus Hv1 suggerits implicats en la unió de derivats de guanidina. Les corbes blaves discontínues envolten les cadenes laterals proposades anteriorment que interaccionen amb diferents parts del compost 2GBI29. (bf) Inhibició depenent de la concentració dels mutants Hv1 indicats pels compostos 2GBI (cian) i GBTA ( vermell fosc). Cada punt representa la inhibició mitjana de 3 a 12 mesures ± SD V109 com a control negatiu. Les corbes són ajustos de Hill utilitzats per obtenir valors aparents de Kd (vegeu la taula suplementària 1). Els coeficients de Hill (h) que es mostren a els histogrames inserits es van determinar a partir dels ajustaments indicats a les figures 3 i 4 suplementàries. Els valors h de referència per a Hv1 WT es mostren com a línies discontínues. Els asteriscs indiquen diferències estadísticament significatives entre els passatges mutants i WT (p Vam trobar que la mutació D112E va reduir significativament el coeficient de Hill (p La constatació que el coeficient de Hill per a la unió de GBTA és superior a 1 en el dímer Hv1 i es converteix en ~ 1 en el canal monomèric (Fig. 2b) és coherent amb l'existència d'interaccions al·lostèriques entre els llocs d'unió de les dues subunitats. Si això és En aquest cas, el coeficient de Hill d'unió GBTA al dímer al qual el bloquejador s'ha unit a una subunitat hauria de ser ~ 1. Hem provat aquesta predicció al dímer enllaçat Hv1 F150A-WT (Fig. 4a), on l'afinitat del F150A La subunitat de GBTA era més de 2 ordres de magnitud superior a la de la subunitat WT (Figs. 1c i 3d). A continuació, vam mesurar les corbes concentració-resposta per a la inhibició de la subunitat WT a una concentració basal de 2 μM GBTA. En aquesta concentració , s'espera que el bloquejador s'uneixi aproximadament el 99% de la subunitat F150A i (a) Diagrama esquemàtic del dímer de la unió F150A-WT utilitzat per generar l'hemicanal de bloqueig ({F150A}b-WT/BAO*). Els diamants blancs mostren la ubicació de la mutació. En els estats BAO* i BA*B*, s'espera que l'afinitat de la subunitat F150A sigui més gran que la de la subunitat WT. (b) Corrents de protons dels canals F150A-WT mesurats en resposta als canvis en el potencial de membrana de -80 mV a +120 mV.pHi = pHo = 6,0 .Les traces grises representen corrents mesurades en absència d'inhibidor. La traça negra (control) representa el corrent mesurat després de l'addició de 2 μM de GBTA. En aquesta concentració, la subunitat WT no es va inhibir significativament, mentre que la subunitat F150A es va unir gairebé completament a GBTA. ({F150A}b-WT). Un augment addicional de la concentració de GBTA va provocar un bloqueig de la subunitat WT (traces taronja i vermella). Subunitat F150A). Cada punt representa la inhibició mitjana ± SD de 3 a 7 mesures. Les corbes van ser ajustos de Hill utilitzats per obtenir els valors aparents de Kd reportats a la taula suplementària 1. Els coeficients de Hill que es mostren als histogrames de la inserció es van determinar a partir dels ajustos reportats a les figures 3 i 4 suplementàries. Els valors h de Hv1 WT són es mostra com a línies discontínues. Els asteriscs indiquen diferències estadísticament significatives en comparació amb el dímer WT Hv1 (p Com que la inhibició de GBTA de Hv1 es va mesurar al canal obert, vam raonar que la cooperativitat d'unió GBTA es podria utilitzar per estudiar el mecanisme d'acoblament entre subunitats en estat obert. Anteriorment, es va trobar que aquestes dues subunitats Hv1 estaven cooperatives 19,20,21, 22 i es va proposar que l'acoblament intersubunitat implicat en el gating fos mediat pel domini citoplasmàtic de bobina en espiral (CCD)22,25. Per tant, ens vam preguntar si el CCD també està implicat en l'acoblament entre els llocs d'unió de GBTA en estat obert. Triglicina mutacions a la interfície entre el fragment transmembrana S4 i el domini de la bobina enrotllada es van mostrar en estudis anteriors per desacoblar aquest domini de la resta del canal mantenint la integritat de la dimerització. Per tant, vam provar l'efecte de les mutacions V220G, K221G i T222G (Fig. . 5a, mutant GGG) sobre la cooperativitat d'unió de GBTA. Hem trobat una disminució estadísticament insignificant (p > 0, 05) en el coeficient d'unió de GBTA als canals GGG en comparació amb el tipus salvatge (Fig. 5c), cosa que suggereix que malgrat el seu paper en el manteniment del dues subunitats juntes són importants, però CCD no media directament l'acoblament al·lostèric entre subunitats entre els llocs d'unió GBTA.
( a ) Diagrama esquemàtic del dímer Hv1 amb una mutació de triglicina a l'extrem interior de S4 dissenyat per interrompre l'acoblament intersubunitat mediat pel domini citoplasmàtic de bobina en espiral (fletxes blaves). (b) Representació esquemàtica de dímers Hv1 i dímers de lligament amb mutacions indicades, dissenyades per provar fragments S1 implicats en l'acoblament entre subunitats (fletxes blaves). (c–h) 2GBI (cian) i GBTA (vermell fosc) inhibeixen les construccions indicades de manera dependent de la concentració. Cada punt representa la inhibició mitjana. ± SD de 3 a 10 mesures. La corba va ser un ajust de Hill utilitzat per obtenir valors aparents de Kd (vegeu la taula suplementària 1). Els coeficients de Hill en els histogrames interpolats es van determinar tal com es descriu a la secció Mètodes (vegeu les figures complementàries 3 i 4). Els valors h de referència per a Hv1 WT es mostren com a línies discontínues. Els asteriscs indiquen diferències estadísticament significatives entre els passatges mutants i WT (p Com que vam descartar el CCD com a mediador directe de la unió cooperativa de GBTA, vam preguntar si les interaccions entre els VSD estan implicades en l'acoblament al·lostèric entre els llocs d'unió. Hem trobat que la cooperativitat d'unió a GBTA es va abolir per la mutació conservadora del residu D112 (Fig. 3c) localitzat. al segment transmembrana S1. S1 conté altres dos residus carregats negativament, E119 i D123, situats al mateix costat de l'hèlix que D112, però més a prop de l'extrem exterior 24 del fragment. Les primeres simulacions de dinàmica molecular van indicar que aquests residus estaven enllaçats. a D112 mitjançant línies d'aigua36,37. Per tant, vam provar si E119 i D123 estan implicats en l'acoblament al·lostèric entre els llocs d'unió de GBTA (Fig. 5b). Com a control negatiu, vam provar la posició conservada de càrrega positiva K125, que es troba a prop de D123. però a l'altre costat de l'hèlix S1 (Fig. 5b).
Vam mesurar la inhibició depenent de la concentració dels canals E119A, D123A i K125A per 2GBI i GBTA i vam trobar que les mutacions E119A i K125A no van alterar significativament el coeficient de Hill de cap inhibidor en comparació amb el tipus salvatge (p> 0, 05, Fig. 5d, i). ). D'altra banda, la mutació D123A va reduir significativament el coeficient de Hill de GBTA (p 0,05/14).
Atès que la neutralització de la càrrega a la posició 123 d'ambdues subunitats va donar lloc a un fort canvi en la cooperativitat d'unió GBTA, mentre que invertir la càrrega d'ambdues subunitats només va tenir un petit efecte, vam ampliar l'anàlisi per incloure només una subunitat amb el canal d'inversió de càrrega. va generar dímers enllaçats a Hv1 amb substitució de D123R a la subunitat C-terminal (Fig. 5b) i va mesurar la inhibició de la concentració-resposta per GBTA i 2GBI. Hem trobat que el coeficient de Hill de la unió de GBTA als canals WT-D123R era significativament més gran que això. de Hv1 de tipus salvatge (p També vam trobar que la mutació D112E va abolir l'augment del coeficient Hill d'unió a GBTA produït pel fons WT-D123R (Fig. 5b, h i Fig. 4 suplementària). També es va eliminar l'efecte sobre el coeficient Hill de la unió de 2GBI ( Fig. 5h i figura suplementària 3). Aquestes troballes suggereixen que l'acoblament al·lostèric millorat entre subunitats causat per càrregues oposades a la posició 123 no es tradueix en una cooperació d'unió més forta quan el lloc d'unió a la posició D112 està alterat.
Vam raonar que si els residus de D123 de les subunitats obertes adjacents estiguessin prou a prop per interactuar electrostàticament entre ells, la interacció repulsiva entre les càrregues negatives es convertiria en una combinació de càrregues negatives i positives mitjançant la substitució d'àcid aspártic per arginina. interacció atractiva entre ells. Una subunitat (dímer WT-D123R). Les interaccions atractives poden enfortir la interfície entre els extrems exteriors del fragment S1, donant lloc a un acoblament al·lostèric més fort entre les subunitats i una cooperació d'unió a GBTA augmentada.
Per donar suport a aquesta hipòtesi, vam buscar una manera d'enfortir la interfície entre els extrems exteriors del segment S1, que és diferent de la commutació de càrrega a la posició 123.Lee et al. Anteriorment es va trobar una mutació del residu Hv1 I127 a cisteïna. per donar lloc a una reticulació espontània entre subunitats17. A més, l'estructura cristal·lina del VSD quimèric Hv1-CiVSP va indicar que I127 està separat de l'extrem exterior de l'hèlix S1 per només un residu24. Per tant, ens vam preguntar si la formació d'un enllaç covalent entre les cisteïnes a la posició 127, que s'espera que donin com a resultat una interacció S1-S1 més forta, té un efecte sobre la cooperativitat d'unió GBTA similar a l'observat canviant la càrrega a la posició 123.
Hem mesurat la inhibició de Hv1 I127C depenent de la concentració per GBTA i 2GBI en presència i absència de β-mercaptoetanol (βME) 10 mM (Fig. 6a). Al mateix temps que s'afegeix l'inhibidor a la solució intracel·lular, el reductor s'afegeix un agent a la solució extracel·lular. Es va utilitzar un dímer enllaçat amb substitució de cisteïna en només una subunitat (WT-I127C) com a control negatiu (Fig. 6a). No vam poder mesurar cap efecte de la reticulació espontània entre subunitats. entre les subunitats I127C a la inhibició de 2GBI, perquè el coeficient de Hill per a la unió de I127C a Hv1, amb o sense βME, era significativament diferent del de la unió a dímers substituïts amb monocisteïna. El coeficient de Hill no va poder diferenciar WT-I127C (Fig. 6b i Fig. 3 suplementària). En fort contrast, vam mesurar l'efecte dramàtic de la reticulació espontània entre subunitats sobre la inhibició de GBTA. El coeficient de Hill per unir-se a Hv1 I127C en absència de βME (crosslink on) va ser significativament superior al mesurat en presència de βME (crosslink off) o utilitzant WT-127C per enllaçar el dímer (en absència de crosslink) (Fig. 6c i suplementària Fig. 4), cosa que indica que l'acoblament al·lostèric entre els llocs d'unió es veu molt millorada per la formació d'enllaços disulfur entre els extrems exteriors dels fragments S1. Aquests resultats donen suport a la nostra interpretació que l'atractiu interacció electrostàtica de l'aspartat i l'arginina a la posició 123 del dímer WT-D123R dóna lloc a un augment de l'acoblament al·lostèric entre les subunitats.
L'acoblament en estat obert està mediat per interaccions físiques directes entre els extrems exteriors del segment S1 a les dues subunitats.
(a) Representació esquemàtica de dímers Hv1 mutants i dímers d'enllaç, dissenyats per investigar com els enllaços de cisteïna entre subunitats afecten la cooperativitat d'unió de GBTA. (bd) Inhibició depenent de la concentració de les construccions indicades per 2GBI (b, d) i GBTA (c, e) en presència o absència de βME 10 mM en solució extracel·lular. Cada punt representa la inhibició mitjana ± SD de 3 a 10 mesures. La corba va ser un ajust de Hill utilitzat per obtenir valors de Kd (vegeu la taula suplementària 1). Els coeficients de Hill als histogrames d'inserció es van determinar a partir dels ajustos reportats a les figures 3 i 4 suplementàries. Els asteriscs a (c, e) indiquen diferències estadísticament significatives. entre diferents condicions d'inhibició de GBTA (p 0,05).
També vam trobar que, en absència de βME, el coeficient de Hill de la unió de GBTA al dímer D112E I127C Hv1 era significativament superior al mesurat en presència d'agents reductors (Fig. 6e i Fig. 4 suplementària), cosa que implica que la mutació D112E. no va abolir l'augment de la cooperativitat d'unió GBTA resultant de la reticulació de la cisteïna 127. El coeficient de Hill de la unió de 2GBI als dímers D112E, I127C Hv1 tampoc es va veure afectat significativament per la mutació D112E (figura 1). 6d i suplementari Fig. 3).
En conjunt, aquestes troballes suggereixen que la unió de GBTA es veu millorada per la interacció entre els extrems exteriors dels fragments S1 a les subunitats Hv1 adjacents mitjançant interaccions electrostàtiques atractives o mitjançant la formació d'enllaços covalents entre cisteïnes substituïdes L'acoblament al·lostèric entre llocs augmenta i dóna lloc a cooperació d'unió. Tot i que l'efecte de les interaccions electrostàtiques atractives sobre la cooperativitat es pot abolir per la mutació D112E, l'efecte dels enllaços covalents no.
En la nostra exploració de l'espai químic disponible per unir derivats de guanidina als canals Hv1, vam trobar que els 2-guanidinotiazols com el GBTA tenen una dependència de concentració més forta que els 2-guanidinobenzimidazols (Fig. 1c). i canals monomèrics (Fig. 2a, b) i al canal dimèric en què una subunitat estava prèviament unida a l'inhibidor (Fig. 4) ens va portar a concloure que la inhibició de Hv1 per GBTA L'acció és un procés sinèrgic, i els llocs d'unió dels compostos de les dues subunitats estan acoblats al·lostèrics. El descobriment que GBTA s'uneix al canal obert, com es va mostrar anteriorment per al compost relacionat 2GBI32, suggereix que l'acoblament al·lostèric es pot avaluar específicament en estat obert. El nostre model d'unió cooperativa va poder descriure quantitativament la inhibició de Hv1 per GBTA (Fig. 2c) i explicar els diferents efectes de 2GBI i GBTA sobre la decadència dels corrents de cua del canal després de la repolarització de la membrana, la qual cosa dóna suport a la nostra interpretació del procés d'unió.
El coeficient màxim de Hill que es pot aconseguir en una proteïna al·lostèrica amb dos llocs d'unió (com Hv1) és 2. Hem mesurat GBTA per unir Hv1 de tipus salvatge amb un coeficient d'1,31, que va augmentar a 1,88 en Hv1 I127C. L'energia lliure sinèrgica, la diferència entre les energies lliures d'unió dels llocs d'afinitat més baixa i més alta (vegeu Mètodes), va ser d'1,3 kcal/mol en el cas de Hv1 de tipus salvatge i de 2,7 kcal/mol en el cas de Hv1 I127C. d'oxigen a hemoglobina és l'exemple més famós i ben estudiat del procés col·laboratiu38. Per a l'hemoglobina humana (un tetràmer amb quatre llocs d'unió acoblats al·lostèricament), el coeficient de Hill oscil·la entre 2,5 i 3,0, amb valors que oscil·len entre 1,26 i 3,64. kcal/mol, depenent de les condicions experimentals38. Així, pel que fa a l'energia global, la cooperativitat de la unió de GBTA a Hv1 no és substancialment diferent de la de la unió de l'O2 a l'hemoglobina quan es consideren els diferents nombres de subunitats proteiques dels dos sistemes.
En el nostre model de sinergia, la unió de molècules GBTA a una subunitat dóna lloc a un augment de l'afinitat d'unió de la subunitat adjacent. Ens imaginem un procés en què una reordenació de l'entorn d'unió resultant del primer esdeveniment d'unió (ajust induït) condueix a canvis en les interaccions entre subunitats. En resposta a aquests canvis, les subunitats adjacents canvien els seus llocs d'unió, donant lloc a una unió GBTA més estreta. Durant aquest procés, l'aspartat S1 D112 és responsable de la reordenació del lloc d'unió associat a l'augment de l'afinitat d'unió. D112 anteriorment es va demostrar que formava part de la via de permeació de protons Hv1 i actuava com a filtre de selectivitat27,28. Els nostres resultats mostren que els filtres de selectivitat de les dues subunitats Hv1 estan acoblats al·lostèricament en estat obert. La figura 7a mostra la ubicació aproximada del lloc d'unió GBTA i la ubicació dels residus D112, D123, K125 i I127 en un esquema del VSD Hv1 basat en sobre l'estructura cristal·lina de la quimera Hv1-CiVSP. Les direccions suggerides per a l'acoblament al·lostèric que impliquen l'extrem extracel·lular de S1 es mostren amb fletxes negres.
(a) Esquema del VSD Hv1. Segons l'estructura cristal·lina de la quimera Hv1-CiVSP, els segments helicoïdals es mostren que són cilíndrics. En aquesta configuració, l'extrem interior del segment S4 es fusiona amb el CCD (no mostrat). Les ubicacions previstes del GBTA lligat es mostren com a ovals grisos. Les fletxes negres indiquen vies implicades en l'acoblament al·lostèric entre els llocs d'unió en dues subunitats adjacents. Les posicions dels residus S1 investigats es marquen amb esferes de colors. (b) Il·lustració esquemàtica de les subunitats Hv1 disposades. en dues configuracions de dímers diferents tal com es veu des del costat extracel·lular del pla de la membrana. Al panell esquerre, la interfície del dímer està formada per l'hèlix S4. Rotació dels dos VSD 20 graus en sentit horari al voltant d'un eix perpendicular al pla de la membrana, acompanyada de la separació dels extrems exteriors de les dues hèlixs S4 (fletxes discontínues), produeix la disposició que es mostra a la dreta. En aquesta configuració, es permet que els residus D123 i I127 de les subunitats adjacents s'apropin. (c) Representació esquemàtica del CiVSP VSD en la configuració de dímer que es troba a l'estructura de cristall 4G80. La posició P140 a CiVSP correspon a la posició D123 a Hv1.
Els nostres resultats mostren que la interacció electrostàtica repulsiva entre el residu 123 (123D/123D o 123R/123R) s'associa amb un nivell "normal" de cooperativitat d'unió a GBTA en estat obert i canvia la interacció de la repulsió a Atret (123D/123R) , augment de la cooperació (Fig. 5g). S'espera que l'eliminació de la interacció repulsiva amb la substitució d'alanina també condueixi a un augment de la cooperativitat. No obstant això, es va observar una disminució de la cooperativitat del dímer 123A/123A (Fig. 5e). L'explicació és que l'efecte desestabilitzador de col·locar residus hidròfobs en un entorn hidròfil pot superar l'efecte estabilitzador a causa de l'eliminació de les interaccions repulsives entre els residus de D123, donant lloc a una reducció global de la cooperativitat d'unió. Mony et al. La posició D171 de Ciona gutis Ci-Hv1 (corresponent a D123 en Hv1 humà) augmenta després de l'activació, donant suport a la idea que D123 es troba en un entorn hidròfil en estat obert.
Se sap que el gating dels canals Hv1 es produeix a través de múltiples transicions19,20,26,39,40,41. Qiu et al26 van trobar que després de la despolarització de la membrana, el sensor de voltatge de Ci-Hv1 experimenta un canvi conformacional que deixa el canal activat però encara tancat. , seguida d'una transició diferent que fa que els protons obrin la conducció en el camí de les dues subunitats. El canvi conformacional del sensor de tensió es va controlar mitjançant fluorescència de pinça de tensió i es va trobar que la segona transició estava pertorbada selectivament per la mutació a la posició D171. La pertorbació del senyal fluorescent és coherent amb la presència d'interaccions electrostàtiques entre els residus D171 de subunitats adjacents en algun punt al llarg de les coordenades de reacció del canvi conformacional. Aquesta interpretació és coherent amb la nostra troballa que el residu D123 interacciona electrostàticament en estat obert. i media l'acoblament al·lostèric entre els llocs d'unió GBTA.
Fujiwara et al25 van proposar que la interfície dímer del domini de la bobina citoplasmàtica s'estén a la membrana per contenir dues hèlixs S4 (Fig. 7b, tauler esquerre). Un model d'aquesta interacció entre subunitats es basa en l'anàlisi de reticulació de cisteïna que cobreix tot el VSD i l'anàlisi funcional de la regió que connecta l'hèlix S4 i el CCD. En absència d'un gradient de pH transmembrana, els canals Hv1 requereixen una despolarització considerable de la membrana per obrir-se i la reticulació de la cisteïna es produeix en condicions en què el canal està predominantment tancat. Per tant, la interfície S4-S4 detectada probablement reflecteix la configuració de la subunitat fora de l'estat. Altres estudis han trobat proves de la implicació de S1 i S2 en les interaccions entre subunitats durant el gating17,21,26 que suggereixen que els canals poden adoptar diferents configuracions de subunitats a l'aire lliure i estats tancats, una idea coherent amb les troballes de Mony et al. S1 es mou 39 durant el gating.
Aquí, mostrem que, en estat obert, els extrems extracel·lulars de l'hèlix S1 estan prou a prop per suportar interaccions electrostàtiques directes que medien l'acoblament al·lostèric entre subunitats. En la configuració del dímer amb interaccions S4-S4 esteses, les hèlixs S1 estan massa lluny. No obstant això, una rotació de 20° en el sentit de les agulles del rellotge de les dues subunitats VSD al voltant d'un eix perpendicular al pla de la membrana, combinada amb la separació dels extrems exteriors de les dues hèlixs S4, va donar una configuració S1-S1 consistent. amb les nostres troballes (Fig. 7b, panell dret). Recomanem aquesta configuració per al canal en estat obert.
Tot i que es creu que l'enzim CiVSP funciona com a monòmer, l'estructura cristal·lina del seu VSD aïllat es captura en un estat de dímer. Els extrems exteriors de les hèlixs S1 d'aquest dímer estan espacialment a prop, i la configuració general és similar a la proposada. per a Hv1 (Fig. 7c). Al dímer CiVSP, el residu més proper de la subunitat adjacent era la prolina a la posició 140 (Fig. 7c). Curiosament, P140 a CiVSP correspon a la posició D123 a Hv1. La semblança en la configuració de la subunitat entre Hv1 i els dímers CiVSP suggereixen que els VSD d'aquestes proteïnes tenen una tendència intrínseca a formar una interfície on els extrems extracel·lulars de S1 interactuen.
El paper essencial de Hv1 en l'activació dels espermatozoides fa que aquest canal sigui un objectiu de fàrmac atractiu per al control de la fertilitat masculina. A més, s'ha demostrat que l'activació de Hv1 a la microglia empitjora la recuperació de l'ictus isquèmic. supervivència en pacients amb càncer de mama 12 o càncer colorectal 13 i es creu que contribueixen a les malalties malignes de cèl·lules B 11 . Per tant, els fàrmacs de molècules petites dirigits a Hv1 es poden utilitzar com a agents neuroprotectors o terapèutics anticancerígens. El descobriment que els derivats del guanidinotiazol poden induir reordenaments conformacionals La subunitat Hv1 oberta, que condueix a una major afinitat d'unió, pot conduir al desenvolupament de fàrmacs més potents dirigits als canals Hv1.
La mutagènesi dirigida al lloc de Hv1 humà es va realitzar mitjançant tècniques de PCR estàndard. En el constructe Hv1NCCiVSP, els residus 1-96 i 228-273 de Hv1 es van substituir pels residus 1-113 i 240-576 de CiVSP18. En el dímer enllaçat a Hv1, l'extrem C-terminal d'una subunitat està enllaçat amb l'extrem N-terminal de la segona subunitat a través de l'enllaç GGSGGSGGSGSGGGSGG. Els plasmidis pGEMHE que contenien les diferents construccions es van linealitzar amb enzims de restricció Nhe1 o Sph1 (New England Biolabs) i es va realitzar la síntesi d'ARN amb el T7 mMessage mMachine kit de transcripció (Ambion). 1-3 dies abans de les mesures electrofisiològiques, es va injectar cRNA als oòcits de Xenopus (50 nl per cèl·lula, 0,3-1,5 μg/μl). Es van obtenir oòcits de Xenopus laevis (NASCO) en estadi V i VI. d'Ecocyte Bioscience. Després de la injecció d'ARN, les cèl·lules es van mantenir en medi ND96 que contenia 96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl, 1 mM de MgCl, 10 mM de HEPES, 5 mM de piruvat, 100 μg/ml de gentamicina 8°C. .
2-guanidino-benzimidazol[1], 2-guanidino-benzotiazol[2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -tiazol-2-il)guanidina) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxilat [8], etil 2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol- El 5-carboxilat [9] i l'acetat d'etil (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) [10] eren de Sigma-Aldrich. La famotidina [7] era de MP Biomedicals.1-[4 -(4-Clorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina[11] i 1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina [12] de Matrix Scientific. Aquests compostos són de la puresa més alta disponible comercialment. Es van dissoldre en DMSO sec per generar una solució de reserva de 100 mM, que després es va diluir en la solució d'enregistrament a la concentració final desitjada. Els compostos 3 i 4 es van sintetitzar a continuació amb almenys el 99% de puresa.
A una suspensió de clorhidrat de 2-amino-4-(trifluorometil)benzentiol (1,02 g, 4,5 mmol) en 25 ml d'àcid clorhídric aquós (2,5 N) es va afegir diciandiamida sòlida (380 mg, 4,5 mmol) i la barreja heterogènia resultant Es va refluxar amb agitació vigorosa durant 4 hores. La mescla de reacció es va refredar a temperatura ambient i es va neutralitzar mitjançant l'addició gradual d'hidròxid de potassi 10N. El precipitat blanc format es va filtrar, es va rentar amb aigua freda (3 × 50 ml), es va assecar en un forn ( 65 °C) durant diverses hores, i després es va recristal·litzar a partir d'acetat d'etil/èter de petroli per donar un sòlid blanc (500 mg, 48 %); pf 221–222 °C (llum 225–226 °C) 45; 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (s molt ample, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d) , 1 H, J = 8,1 Hz).13C RMN (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114,2 (d, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J) = 272 Hz), 126,1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.HRMS (ESI): valor calculat m/z. Per a C9H8F3N4S (M + H)+: 26, trobat. : 261.0419.
La nafto[1,2-d]tiazol-2-amina (300 mg, 1,5 mmol), sintetitzada com s'ha descrit anteriorment, es va escalfar a 200 °C en un bany d'oli en un tub d'assaig petit. 300 mg (gran excés) de cianamida i 1,0 ml concentrat. Al compost calent es va afegir ràpidament àcid clorhídric i la mescla es va mantenir al bany d'oli durant uns 2 minuts, temps durant el qual la major part de l'aigua es va evaporar. La mescla de reacció es va refredar a temperatura ambient i el material solidificat resultant. es va trencar en trossos petits i es va rentar amb aigua per proporcionar un sòlid amorf groc pàl·lid. (38 mg, 10%) pf 246-250 °C; 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 H) , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d , 1 H, J = 8,3 Hz).13C RMN (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.HRMS (ESI): m/z valor calculat. Per a H+40:M1N402H (valor calculat). , trobat: 243.0704.
Els corrents de protons es van mesurar en pegats interns i externs d'oòcits que expressen diferents construccions mitjançant un amplificador Axopatch 200B controlat per un Axon Digidata 1440A (Dispositius Moleculars) amb el programari pClamp10. Les solucions intracel·lulars i extracel·lulars tenen la mateixa composició: 100 mM 2-(N-morfolino). àcid etanosulfònic (MES), mesilat de tetraetilamoni (TEA) 30 mM, clorur de TEA 5 mM, àcid etilenglicol-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacètic (EGTA) 5 mM, ajustat a pH 6,0 amb hidròxid de TEA. Totes les mesures es van realitzar a 22 ± 2 °C. La pipeta té una resistència d'accés d'1,5–4 MΩ. Les traces actuals es van filtrar a 1 kHz, es van mostrejar a 5 kHz i es van analitzar amb Clampfit10.2 (Dispositius Moleculars). ) i Origin8.1 (OriginLab).
Les solucions que contenien diverses concentracions d'inhibidor Hv1 i en alguns casos 10 mM βME es van introduir al bany per gravetat a través d'un col·lector connectat a un sistema de vàlvules de perfusió VC-6 (Warner Instr.), que es va passar a través del programari pClamp TTL (Transistor- Transistor Logic). Es van realitzar experiments de perfusió ràpida amb un llapis de perfusió multitub (AutoMate Sci.) amb una punta de lliurament de 360 μm de diàmetre muntada davant d'una pipeta de pegat. La inhibició del canal es va determinar mitjançant mesures amperomètriques isocrones al final de la Pols despolaritzant de +120 mV. Les mesures de GV es van realitzar tal com s'ha descrit anteriorment18,20. Els corrents de cua es van registrar a -40 mV després de passos de despolarització a diferents voltatges de -20 mV a +120 mV tret que s'indiqui el contrari. El pols de referència que precedeix el pols de prova és s'utilitza per corregir la decadència actual 18. El gràfic GV s'ajusta a l'equació de Boltzmann:
Les constants aparents de dissociació (Kd) per a diferents combinacions de canals i inhibidors (taula suplementària 1) es van determinar ajustant la dependència de la concentració de la inhibició (valors mitjans de %inhib) amb l'equació de Hill:
on [I] és la concentració de l'inhibidor I i h és el coeficient de Hill. Per calcular el coeficient de Hill, l'equació (2) es reordena com:
Hora de publicació: Jun-07-2022
