ღია Hv1 პროტონული არხის ქვეგანყოფილების ინტერფეისის დაკითხვა ალოსტერულად დაწყვილებული ზონდით

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა. საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). იმავდროულად, უზრუნველყოთ მხარდაჭერის გაგრძელება, ჩვენ გამოვაჩენთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
Hv1 ძაბვით დახურული პროტონული არხი არის დიმერული კომპლექსი, რომელიც შედგება ორი ძაბვის სენსორული დომენისგან (VSD), რომელთაგან თითოეული შეიცავს პროტონების შეღწევადობის გზას. დიმერიზაციას აკონტროლებს ციტოპლაზმური დახვეული ხვეული დომენი. გადასვლა დახურული მდგომარეობიდან ღია მდგომარეობა ორივე VSD-ში ცნობილია, რომ ხდება კოოპერატიულად; თუმცა, ცოტა რამ არის ცნობილი ფუძემდებლური მექანიზმების შესახებ. ქვედანაყოფის ინტერფეისები მთავარ როლს თამაშობენ ალოსტერულ პროცესებში; თუმცა, ასეთი ინტერფეისები არ არის გამოვლენილი ღია Hv1 არხებში. აქ ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ 2-გუანიდინოთიაზოლის წარმოებულები ბლოკავს ორ Hv1 VSD-ს კოოპერატიულად და იყენებენ ერთ-ერთ ამ ნაერთს, როგორც ზონდს ალოსტერული შეერთებისთვის ღია ქვედანაყოფებს შორის. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ უჯრედგარე VSD-ის პირველი ტრანსმემბრანული ფრაგმენტის ბოლო ქმნის ქვედანაყოფთაშორის ინტერფეისს, რომელიც შუამავლობს დაწყვილებას შებოჭვის ადგილებს შორის, მაშინ როცა დახვეული ხვეულის დომენი უშუალოდ არ არის ჩართული ამ პროცესში. ჩვენ ასევე ვიპოვეთ ძლიერი მტკიცებულება იმისა, რომ არხის პროტონების შერჩევითი ფილტრი აკონტროლებს ბლოკერებთან დამაკავშირებელ თანამშრომლობას. .
ძაბვით დახურული პროტონული არხები მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ სხვადასხვა ორგანიზმებში, ფიტოპლანქტონიდან ადამიანებამდე1. უჯრედების უმეტესობაში ეს არხები შუამავლობენ პროტონის გადინებას პროტონის მემბრანიდან და არეგულირებენ NADPH ოქსიდაზას აქტივობას. ადამიანებში ერთადერთი ცნობილი ძაბვით შემოღობილი პროტონული არხი. არის Hv1, რომელიც არის HVCN1 გენის პროდუქტი 2,3. Hv1 (aka VSOP) ნაჩვენებია, რომ თამაშობს როლს B უჯრედების პროლიფერაციაში4, რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების წარმოებაში თანდაყოლილი იმუნური სისტემის მიერ5,6,7,8, სპერმის უჯრედი. მოძრაობა9 და სასუნთქი გზების ზედაპირის სითხის pH რეგულირება10. ეს არხი მონაწილეობს კიბოს რამდენიმე ტიპში, როგორიცაა B-უჯრედოვანი ავთვისებიანი სიმსივნეები4,11 და სარძევე ჯირკვლის და კოლორექტალური კიბო12,13. Hv1-ის გადაჭარბებული აქტივობა ზრდის კიბოს უჯრედების მეტასტაზურ პოტენციალს 11, 12. თავის ტვინში, Hv1 გამოხატულია მიკროგლიის მიერ და ნაჩვენებია, რომ მისი აქტივობა აძლიერებს ტვინის დაზიანებას იშემიური ინსულტის მოდელებში.
Hv1 ცილა შეიცავს ძაბვის სენსორულ დომენს (VSD), რომელიც შედგება ოთხი ტრანსმემბრანული სეგმენტისგან, სახელწოდებით S1-დან S414-მდე. VSD წააგავს ძაბვით შემოსაზღვრული Na+, K+ და Ca2+ არხების და ძაბვისადმი მგრძნობიარე ფოსფატაზების შესაბამის დომენებს, როგორიცაა CiVSP. Ciona gutis15. ამ სხვა პროტეინებში S4-ის C-ბოლო მიმაგრებულია ეფექტურ მოდულთან, ფორების დომენთან ან ფერმენტთან. Hv1-ში S4 დაკავშირებულია დახვეული ხვეულის დომენთან (CCD), რომელიც მდებარეობს მემბრანის ციტოპლაზმურ მხარეს. არხი არის დიმერული კომპლექსი, რომელიც შედგება ორი VSD-ისგან, თითოეული შეიცავს პროტონების შეღწევადობის დახურულ გზას16,17,18. აღმოჩნდა, რომ ეს ორი Hv1 ქვეერთეული ერთობლივად იხსნება19,20,21,22, რაც ვარაუდობს, რომ ალოსტერული დაწყვილება და ქვედანაყოფთაშორისი ურთიერთქმედება თამაშობს. მნიშვნელოვანი როლი აქვს კარიბჭის პროცესში. ქვედანაყოფებს შორის ინტერფეისი კარგად არის განსაზღვრული, რადგან ორი იზოლირებული დომენის კრისტალური სტრუქტურები ხელმისაწვდომია22,23. მეორეს მხრივ, მემბრანის შიგნით VSD-ებს შორის ინტერფეისი არ არის. კარგად გასაგები. Hv1-CiVSP ქიმერული ცილის კრისტალური სტრუქტურა არ გვაწვდის ინფორმაციას ამ ინტერფეისის შესახებ, რადგან კრისტალიზებული არხის კომპლექსის ტრიმერული ორგანიზაცია შეიძლება გამოწვეული იყოს მშობლიური Hv1 CCD საფუარის ლეიცინის ელვათი GCN424-ით ჩანაცვლებით.
Hv1 არხის ქვედანაყოფის ორგანიზაციის ბოლოდროინდელმა კვლევამ დაასკვნა, რომ ორი S4 სპირალი გადადის CCD-ში მეორადი სტრუქტურის ძლიერი დარღვევის გარეშე, რის შედეგადაც წარმოიქმნება გრძელი სპირალი, რომელიც იწყება მემბრანიდან და გადადის ციტოპლაზმაში. ეს კვლევა გვთავაზობს, რომ Hv1 VSD-ები დაუკავშირდნენ ერთმანეთს S4 სეგმენტის გასწვრივ. თუმცა, სხვა კვლევებმა შესთავაზა ალტერნატიული ინტერფეისები VSD-ებს შორის. ეს ინტერფეისები მოიცავს S1 სეგმენტებს 17, 21, 26 და S2 სეგმენტის გარე ბოლოებს 21. კონფლიქტის შესაძლო მიზეზი. ამ კვლევების შედეგები არის ის, რომ ალოსტერული დაწყვილება VSD-ებს შორის იქნა შესწავლილი კარიბჭის პროცესთან მიმართებაში, რომელიც დამოკიდებულია დახურულ და ღია მდგომარეობებზე და VSD-ებს შორის ინტერფეისი შეიძლება განსხვავდებოდეს კონფორმაციის სხვადასხვა მდგომარეობის ცვლილებებში.
აქ ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 2-გუანიდინოთიაზოლი თრგუნავს Hv1 არხებს ორ ღია VSD-სთან სინერგიულად შებოჭვით და გამოვიყენეთ ერთ-ერთი ნაერთი, 2-გუანიდინობენზოთიაზოლი (GBTA), ღია მდგომარეობაში ქვეერთეულებს შორის ურთიერთქმედების შესამოწმებლად. ინტერფეისი. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ GBTA შებოჭვის მრუდი კარგად შეიძლება იყოს აღწერილი რაოდენობრივი მოდელით, რომელშიც ინჰიბიტორის ერთ ქვედანაყოფთან დაკავშირება იწვევს მიმდებარე ქვედანაყოფის შეკავშირების აფინურობის ზრდას. ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ნარჩენები D112, სელექციურობის ფილტრები არხი 27, 28 და გუანიდინის წარმოებულის დამაკავშირებელი ადგილის ნაწილი 29 აკონტროლებს GBTA შეკავშირების თანამშრომლობას. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ კოოპერატიული კავშირი შენარჩუნებულია Hv1 დიმერში, სადაც CCD გამოყოფილია S4 სეგმენტიდან, რაც ვარაუდობს, რომ CCD ინტერფეისი პირდაპირ არ არის შუამავლობით ალოსტერულ შეერთებას GBTA-ს დამაკავშირებელ ადგილებს შორის. ამის საპირისპიროდ, ჩვენ აღმოვაჩენთ, რომ S1 ფრაგმენტი არის ქვედანაყოფებს შორის ინტერფეისის ნაწილი და გვთავაზობს მიმდებარე VSD-ების განლაგებას S4 სპირალის უჯრედგარე ბოლოთი დიმერის ცენტრიდან მოშორებით, რათა დაუშვას. S1 ფრაგმენტი იყოს ღია მდგომარეობაში.
Hv1-ის მცირე მოლეკულური ინჰიბიტორები სასარგებლოა, როგორც კიბოს საწინააღმდეგო საშუალებები და ნეიროპროტექტორები. თუმცა, დღემდე, რამდენიმე ნაერთმა შეძლო არხის დათრგუნვა30,31,32,33. მათ შორის, 2-გუანიდინობენზიმიდაზოლი (2GBI, ნაერთი [1] ნახ. 1a) და მისი წარმოებულები აფერხებენ პროტონების VSD29,32 შეღწევას არხის მეშვეობით. ითვლება, რომ ასეთი ნაერთების შეერთება დამოუკიდებლად ხდება ორ ღია ქვედანაყოფში. ადრე ნაჩვენები იყო Hv1-ის დათრგუნვა თითქმის ისეთივე ეფექტურად, როგორც 2GBI 200 μM კონცენტრაციაზე ტესტირებისას (სურათი 1b). ჩვენ გამოვიკვლიეთ თიაზოლის სხვა წარმოებულები და აღმოვაჩინეთ, რომ ზოგიერთი მათგანი თრგუნავს არხს მსგავსი ან უფრო დიდი პოტენციალით, ვიდრე GBTA (ნახ. 1 და დამატებითი ტექსტი). ჩვენ დავადგინეთ თიაზოლის ოთხი წარმოებულის კონცენტრაციის პასუხის მრუდები (GBTA და ნაერთები [3], [6] და [11], სურ. 1c) და აღმოვაჩინეთ, რომ ისინი უფრო ციცაბო იყო ვიდრე 2GBI. Hill კოეფიციენტები (h) თიაზოლის წარმოებულები მერყეობდა 1,109 ± 0,040-დან 1,306 ± 0,033-მდე (ნახ. 1c და დამატებითი ნახ. 1). ამის საპირისპიროდ, Hill კოეფიციენტი 2GBI-სთვის იყო 0.975 ± 0.024 29, ნახ. 2a და დამატებითი ნახ. 1). Hill კოეფიციენტი 1-ზე ზემოთ მიუთითებს სავალდებულო თანამშრომლობაზე. რადგან თითოეულ Hv1 ქვეერთეულს აქვს საკუთარი ინჰიბიტორი. შებოჭვის ადგილი,29,32 ჩვენ ვიმსჯელეთ, რომ თიაზოლის წარმოებულის ერთ ქვეერთეულთან შეკავშირებამ შეიძლება გააძლიეროს მეორე ინჰიბიტორის მოლეკულის დაკავშირება მიმდებარე ქვედანაყოფთან. GBTA იყო სატესტო ნაერთი ყველაზე მაღალი Hill კოეფიციენტით. ამიტომ, ჩვენ ავირჩიეთ ეს ნაერთი. შემდგომში შეისწავლეს შემაკავშირებელი სინერგიის მექანიზმი და გამოიყენეს 2GBI, როგორც საცნობარო უარყოფითი კონტროლი.
(ა) ტესტის ნაერთები: [1] საცნობარო Hv1 ინჰიბიტორი 2-გუანიდინო-ბენზიმიდაზოლი (2GBI).[2] 2-გუანიდინო-ბენზოთიაზოლი (GBTA), [3] (5-ტრიფტორმეთილ-1,3-ბენზოთიაზოლ-2-ილ) გუანიდინი, [4] ნაფთო[1,2-d][1, 3] თიაზოლ-2-ილი -გუანიდინი, [5](4-მეთილ-1,3-თიაზოლ-2-ილ)გუანიდინი, [6](5-ბრომო-4-მეთილ-1,3-თიაზოლ-2-ილ)გუანიდინი, [7] ფამოტიდინი, [8] 2-გუანიდინო-5-მეთილ-1,3-თიაზოლ-4-კარბოქსილის მჟავას ეთილის ესტერი, [9] 2-გუანიდინო-4-მეთილ ეთილ-1,3-თიაზოლ-5-კარბოქსილატი, [10 ](2-გუანიდინო-4-მეთილ-1,3-თიაზოლ-5-ილ)ეთილის აცეტატი, [11]1-[4-(4-ქლოროფენილ)-1,3-თიაზოლ-2-ილ]გუანიდინი, [ 12]1-[4-(3,4-დიმეთოქსიფენილ)-1,3-თიაზოლ-2-ილ]გუანიდინი. (ბ) ადამიანის Hv1 აქტივობის დათრგუნვა მითითებული გუანიდინოთიაზოლებით და საცნობარო ნაერთებით 2GBI (ლურჯი-მწვანე ზოლები) .Hv1 პროტონის დინებები გაზომილი იყო Xenopus-ის კვერცხუჯრედების შიგნით-გარე ფილებში დეპოლარიზაციის საპასუხოდ -80 მვ-დან +120 მვ-მდე შემაკავებელი პოტენციალის დეპოლარიზაციის საპასუხოდ. თითოეული ინჰიბიტორი დაემატა აბაზანას 200 μM კონცენტრაციით. pHi = pHo = 6.0. .მონაცემები არის საშუალო±SEM (n≥4). (c) ადამიანის Hv1-ის კონცენტრაციაზე დამოკიდებული დათრგუნვა ნაერთებით [2], [3], [6] და [11]. თითოეული წერტილი წარმოადგენს საშუალო ინჰიბიციას ± SD 3-დან. 15 გაზომვამდე. ხაზი არის Hill მორგება, რომელიც გამოიყენება 1-ში მოხსენებული Kd აშკარა მნიშვნელობების მისაღებად. Hill კოეფიციენტები განისაზღვრა დამატებით ნახ. 1-ში მოხსენებული შერწყმებიდან: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (იხ. მეთოდები).
(a,b) ნაერთები 2GBI და GBTA თრგუნავენ დიმერულ და მონომერულ Hv1-ს კონცენტრაციაზე დამოკიდებული გზით. თითოეული წერტილი წარმოადგენს საშუალო ინჰიბიციას ± SD 3-დან 8 გაზომვამდე და მრუდი არის Hill fit. Hill კოეფიციენტები (h) ნაჩვენებია ჩასმული ჰისტოგრამები განისაზღვრა დამატებით ნახ 3 და 4-ში მოხსენებული შერწყმებიდან. GBTA-ს კონცენტრაციის პასუხი ნაჩვენებია (a)-ში იგივეა, რაც ნახ. 1c-ში. იხილეთ დამატებითი ცხრილი 1 აშკარა Kd მნიშვნელობებისთვის. (c) მოდელირება GBTA-ს კოოპერატიული მიბმა დიმერულ Hv1-თან. მყარი შავი ხაზი წარმოადგენს ექსპერიმენტულ მონაცემებთან შესაბამისობას (6) განტოლებით, რომელიც აღწერს (d)-ში ნაჩვენები შებოჭვის მოდელს. წყვეტილი ხაზები, სახელწოდებით Sub 1 და Sub 2, წარმოადგენს ბიმოლეკულურ ასოციაციას. -პირველი და მეორე დამაკავშირებელი მოვლენების დისოციაციის წონასწორობის მრუდები, შესაბამისად (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(დ) Hv1 ბლოკის შემოთავაზებული მექანიზმის სქემატური დიაგრამა. GBTA-ს შემთხვევაში, ერთ ღია ქვედანაყოფთან დაკავშირება ზრდის მიმდებარე ღია ქვედანაყოფის აფინურობას (Kd2 Hv1 არხების მონომერიზაცია შესაძლებელია მათი N- და C-ტერმინალური ციტოპლაზმური დომენების ჩანაცვლებით Ciona Intestinalis ძაბვისადმი მგრძნობიარე ფოსფატაზას CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34 შესაბამისი ნაწილებით. ჩვენ გავზომეთ მონომერული GBTA და GBTA Hv2 ინჰიბირების კონცენტრაციის დამოკიდებულება. შევადარეთ ისინი დიმერული არხის (ველური ტიპის) ინჰიბიციას (ნახ. 2a,b). ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ განსხვავება ორ ნაერთს შორის შემაკავშირებელ თანამშრომლობაში აღმოიფხვრა მონომერულ Hv1-ში, რაც მხარს უჭერს ახსნას, რომ GBTA-ს შეკავშირება ერთ ქვედანაყოფთან ზრდის სხვა ქვედანაყოფის აფინურობა ინჰიბიტორთან. ჩვენ ვიმსჯელეთ, რომ GBTA ერთ Hv1 ქვედანაყოფთან დაკავშირებამ შეიძლება გამოიწვიოს შემაკავშირებელი ადგილის გადაწყობა (გამომწვევი fit35), რაც გამოიწვევს მიმდებარე ქვედანაყოფის ვაკანტური შეკვრის ადგილის გადაწყობას, რაც გამოიწვევს შეკავშირების გაზრდას. აფინურობა.
არხთან GBTA-ს კოოპერატიული კავშირის რაოდენობრივად აღსაწერად, ჩვენ გამოვიყენეთ მოდელი, რომელშიც რომელიმე ქვეერთეულს შეუძლია დააკავშიროს პირველი ინჰიბიტორი მოლეკულა ბიმოლეკულური რეაქციის შემდეგ Kd1 დისოციაციის მუდმივით (ნახ. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO* ). დაკავშირება იწვევს არხს ისეთი მდგომარეობის მიღებას, რომელშიც დარჩენილი ცარიელი ქვედანაყოფები უკავშირდებიან ინჰიბიტორს უნიკალური ბიმოლეკულური რეაქციის შემდეგ დისოციაციის მუდმივი Kd2, სადაც Kd2 მყარი შავი ხაზი 2c-ზე არის მოდელის განტოლების შესაბამისობა კონცენტრაცია-პასუხის ექსპერიმენტულ მრუდთან, რაც იძლევა Kd1 ~290 μM და Kd2 ~29 μM (მეთოდების განყოფილება, განტოლება (6)). მოდელი ასევე აღწერს 2GBI-ის შეკვრა, სადაც Kd2 ≈ Kd1 = Kd (ნახ. 2d). მონომერულ Hv1-ში არის მხოლოდ ერთი შეკვრის ადგილი და ერთი Kdm (O° + B ⇆ B°). GBTA-ს შემთხვევაში, Kdm არის დაახლოებით 54. μM, რომელიც უფრო ჰგავს Kd1-ს, ვიდრე Kd2-ს (ნახ. 2d). სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, მონომერის შეკვრის ადგილი კონფიგურაციაშია (O°) უფრო ჰგავს მაღალი აფინურობის მდგომარეობას (BO*), ვიდრე დაბალი დიმერის აფინურობის მდგომარეობა (OO), სავარაუდოდ, ქვედანაყოფებს შორის ინტერფეისის აღმოფხვრის გამო.
როგორც ადრე იყო ნაჩვენები 2GBI32-ისთვის, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ GBTA თრგუნავს Hv1 დენებს არხის დაბლოკვით, როცა ის ღია იყო, ვიდრე მისი გახსნის გაძნელებით (დამატებითი ნახ. 2a,b,d). ასევე ცნობილია, რომ 2GBI იწვევს ნელა დაშლილ კუდის დენებს. მემბრანის რეპოლარიზაციის საპასუხოდ, მაგრამ ეს ფენომენი არ შეინიშნებოდა GBTA-ში (დამატებითი ნახ. 2c). Hv1 ინაქტივაციის არსებობისას 2GBI-ს თანდასწრებით, კარიბჭეები თითოეულ ქვედანაყოფში ვერ დაიხურება მანამ, სანამ ბლოკერი არ დატოვებს შეკვრის ადგილს (" ფეხის კარიბჭე” მექანიზმი), და 2GBI იხსნება უფრო ნელა, ვიდრე კარიბჭეები დახურულია. თუ ერთი Hv1 ქვეგანყოფილება განბლოკილია და დახურულია, ხოლო მიმდებარე ქვეგანყოფილება რჩება დაბლოკილი, დარჩენილი 2GBI მოლეკულების გაუქმება უფრო ნელა ხდება (ბლოკატორის დაჭერა). ხანგრძლივი არხის სახეობები მხოლოდ ერთი დაბლოკილი ქვედანაყოფი ატარებს პროტონებს დროებით დახურვამდე და მნიშვნელოვანი წვლილი შეაქვს კუდის ნელ-ნელა რღვევაში.
დასკვნა, რომ Hv1 კუდის დენების დაშლა მნიშვნელოვნად არ შენელებულა GBTA-ს თანდასწრებით (დამატებითი სურ. 2c) შეესაბამება ამ ბლოკერის სინერგიულ შეკავშირების მექანიზმს (ნახ. 2d). მას შემდეგ, რაც GBTA მოლეკულა არ არის შეკრული Hv1 ქვეერთეულიდან. ბლოკატორის მიდრეკილება მეზობელ ქვედანაყოფთან დაახლოებით 10-ჯერ მცირდება, რაც ხელს უწყობს შებოჭვის პროცესს. ეს ნიშნავს, რომ GBTA-ს მეორე მოლეკულას გაცილებით მაღალი შანსი აქვს დაიშალა მანამ, სანამ ის არხში მოხვდება. ხანგრძლივი არხის სახეობები, რომლებიც მოსალოდნელია, რომ წარმოქმნას მხოლოდ ერთი ბლოკირების ქვედანაყოფი, რომელიც ბევრად უფრო უხვი იქნება GBTA-ს არსებობისას, ვიდრე 2 GBI-ის არსებობისას, რაც გამოიწვევს კუდის დენის უფრო სწრაფ დაშლას.
იმისათვის, რომ GBTA დაუკავშირდეს ორივე Hv1 ქვედანაყოფს, დამაკავშირებელი ადგილები უნდა იყოს ალოსტერულად დაწყვილებული. თითოეულ დამაკავშირებელ ადგილს უნდა შეეძლოს: 1) გამოიწვიოს მოვლენების ჯაჭვი, რომელიც დაუკავშირდება ინჰიბიტორთან დაკავშირებულ მეზობელ ქვედანაყოფებს, და 2) შუამავლობა გადასვლა დაბალი აფინურობიდან მაღალი აფინურობის შეკავშირებაზე. ჩვენ ვიმსჯელეთ, რომ თუ სპეციფიურმა ნარჩენებმა შემაკავშირებელ ადგილზე წვლილი შეიტანა კოოპერატიულ პროცესზე, მათმა მუტაციამ უნდა შეცვალოს Hv1-ის GBTA ინჰიბიციის კონცენტრაცია-რეაქციის მრუდის Hill კოეფიციენტი. ნარჩენები D112, F150 , S181 და R211 ადრე ნაჩვენები იყო, რომ იყვნენ 2GBI29 შემაკავშირებელ გარემოში და ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ ისინი ანალოგიურად ჩაერთვებოდნენ GBTA-ს შეკავშირებაში (ნახ. 3A). ჩვენ გავზომეთ GBTA-ს ინჰიბიტორული კონცენტრაცია-რეაქციის მრუდები მუტანტის არხებისთვის D112E, F150A, S181A. , და R211S (სურათი 3) და შეადარეს მათი Hill კოეფიციენტები Hv1 ველური ტიპის კოეფიციენტებს, 2 GBI-ის გამოყენებით, როგორც მინიშნება. ნარჩენი V109 არის S1 სეგმენტის იმავე სახეზე, როგორც D112 და აქვს ერთი დამატებითი ხვეული შემობრუნება უჯრედის შიგნით. V109 არ იყო ჩართული 2GBI29-ის შეკავშირებაში, ჩვენ გამოვიყენეთ V109A მუტანტი, როგორც კონტროლი (ნახ. 3ბ).
(ა) შემოთავაზებული Hv1 ნარჩენები, რომლებიც მონაწილეობენ გუანიდინის წარმოებულთან შეკავშირებაში. დაწყვეტილი ლურჯი მრუდები აკრავს ადრე შემოთავაზებულ გვერდით ჯაჭვებს, რომლებიც ურთიერთქმედებენ 2GBI29 ნაერთის სხვადასხვა ნაწილთან. (bf) მითითებული Hv1 მუტანტების კონცენტრაციაზე დამოკიდებული დათრგუნვა ნაერთებით 2GBI (ციანი) და GBTA ( მუქი წითელი). თითოეული წერტილი წარმოადგენს 3-დან 12 გაზომვის საშუალო დათრგუნვას ± SD V109, როგორც უარყოფითი კონტროლი. მრუდები არის ბორცვის მორგება, რომელიც გამოიყენება აშკარა Kd მნიშვნელობების მისაღებად (იხ. დამატებითი ცხრილი 1). Hill კოეფიციენტები (h) ნაჩვენებია ჩასმული ჰისტოგრამები განისაზღვრა დამატებით ნახ 3 და 4-ში მოხსენებული შერწყმებიდან. საცნობარო h მნიშვნელობები Hv1 WT-სთვის ნაჩვენებია წყვეტილი ხაზების სახით. ვარსკვლავი მიუთითებს სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებს მუტანტსა და WT პასაჟებს შორის (p ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ D112E მუტაციამ მნიშვნელოვნად შეამცირა Hill კოეფიციენტი (p დასკვნა, რომ Hill-ის კოეფიციენტი GBTA დაკავშირებისთვის არის 1-ზე მაღალი Hv1 დიმერში და ხდება ~1 მონომერულ არხში (ნახ. 2b) შეესაბამება ალოსტერული ურთიერთქმედების არსებობას ორ ქვედანაყოფში შემაკავშირებელ ადგილებს შორის. თუ ეს არის ამ შემთხვევაში, GBTA-ს დაკავშირების ჰილის კოეფიციენტი დიმერთან, რომელსაც ბლოკატორი უკავშირდება ერთ ქვეერთეულს, უნდა იყოს ~ 1. ჩვენ გამოვცადეთ ეს პროგნოზი Hv1 F150A-WT დაკავშირებულ დიმერში (ნახ. 4a), სადაც F150A-ის აფინურობაა. GBTA-ს ქვეერთეული იყო 2 ბრძანებით მეტი სიდიდის ვიდრე WT ქვედანაყოფის (ნახ. 1c და 3d). შემდეგ ჩვენ გავზომეთ კონცენტრაცია-პასუხის მრუდები WT ქვედანაყოფის დათრგუნვისთვის ბაზალურ კონცენტრაციაზე 2 μM GBTA. ამ კონცენტრაციაზე მოსალოდნელია, რომ ბლოკერი აკავშირებს F150A ქვედანაყოფის დაახლოებით 99%-ს და WT ქვეგანყოფილების (ა) F150A-WT შეერთების დიმერის სქემატური დიაგრამა, რომელიც გამოიყენება ბლოკირების ნახევარარხის შესაქმნელად ({F150A}b-WT/BAO*). თეთრი ბრილიანტი აჩვენებს მუტაციის ადგილს. BAO* და BA*B* მდგომარეობებში, მოსალოდნელია, რომ F150A ქვეერთეულის აფინურობა უფრო მაღალი იქნება, ვიდრე WT ქვედანაყოფის. (ბ) პროტონული დენები F150A-WT არხებიდან, რომელიც იზომება მემბრანის პოტენციალის ცვლილებების საპასუხოდ -80 mV-დან +120 mV-მდე. pHi = pHo = 6.0 .ნაცრისფერი კვალი წარმოადგენს ინჰიბიტორის არარსებობის პირობებში გაზომილ დენებს. შავი კვალი (კონტროლი) წარმოადგენს დენს, რომელიც გაზომილია 2 μM GBTA-ს დამატების შემდეგ. ამ კონცენტრაციაში WT ქვედანაყოფი არ იყო მნიშვნელოვნად დათრგუნული, ხოლო F150A ქვედანაყოფი თითქმის მთლიანად იყო დაკავშირებული GBTA-სთან. ({F150A}b-WT). GBTA კონცენტრაციის შემდგომმა ზრდამ გამოიწვია WT ქვედანაყოფის ბლოკირება (ნარინჯისფერი და წითელი კვალი). F150A ქვედანაყოფი). თითოეული წერტილი წარმოადგენს 3-დან 7 გაზომვის საშუალო ინჰიბიცია ± SD. მრუდები იყო Hill fits გამოყენებული Kd-ის აშკარა მნიშვნელობების მისაღებად, რომელიც მოხსენებულია დამატებით ცხრილში 1. ჩასმული ჰისტოგრამებში ნაჩვენები Hill კოეფიციენტები განისაზღვრა დამატებით ნახ 3 და 4-ში მოხსენებული შერწყმებიდან. Hv1 WT-ის h მნიშვნელობები არის ნაჩვენებია წყვეტილი ხაზების სახით.ვარსკვლავები მიუთითებს სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებს WT დიმერთან Hv1-თან შედარებით (p ვინაიდან Hv1-ის GBTA დათრგუნვა გაზომილი იყო ღია არხში, ჩვენ ვიმსჯელეთ, რომ GBTA-ს დამაკავშირებელი კოოპერატივობა შეიძლება გამოვიყენოთ ღია მდგომარეობაში დაწყვილების მექანიზმის შესასწავლად. ადრე აღმოჩნდა, რომ ეს ორი Hv1 ქვედანაყოფი იყო კოოპერატიულად 19,20,21. 22 და ქვეგანყოფილებათაშორისი დაწყვილება, რომელიც ჩართული იყო კარიბჭეში, იყო შემოთავაზებული შუამავლად ციტოპლაზმური დახვეული ხვეულის დომენით (CCD)22,25. ამიტომ, ჩვენ ვკითხეთ, არის თუ არა CCD ჩართული დაწყვილებაში GBTA-დაკავშირებულ უბნებს შორის ღია მდგომარეობაში. ტრიგლიცინი მუტაციები S4 ტრანსმემბრანულ ფრაგმენტსა და დახვეული ხვეულის დომენს შორის ინტერფეისზე ნაჩვენები იყო ადრინდელ კვლევებში ამ დომენის გამოყოფა არხიდან დანარჩენი არხიდან დიმერიზაციის მთლიანობის შენარჩუნებით. ამიტომ, ჩვენ გამოვცადეთ V220G, K221G და T222G მუტაციების ეფექტი (ნახ. . ორი ქვედანაყოფი ერთად მნიშვნელოვანია, მაგრამ CCD პირდაპირ არ ახდენს შუამავალს შორის ალოსტერულ დაწყვილებას GBTA-ს შეკვრის ადგილებს შორის.
(ა) Hv1 დიმერის სქემატური დიაგრამა ტრიგლიცინის მუტაციით S4-ის შიდა ბოლოში, რომელიც შექმნილია ციტოპლაზმური დახვეული ხვეულის დომენით შუამავალი ქვეგანყოფილებათაშორისი შეერთების დასარღვევად (ლურჯი ისრები). მითითებული მუტაციები, შექმნილია S1 ფრაგმენტების შესამოწმებლად, რომლებიც მონაწილეობენ ქვეერთეულებს შორის დაწყვილებაში (ცისფერი ისრები). (c–h) 2GBI (ცისფერი) და GBTA (მუქი წითელი) თრგუნავს მითითებულ კონსტრუქტებს კონცენტრაციაზე დამოკიდებული გზით. თითოეული წერტილი წარმოადგენს საშუალო ინჰიბიციას. ± SD 3-დან 10 გაზომვამდე. მრუდი იყო Hill fit, რომელიც გამოიყენებოდა აშკარა Kd მნიშვნელობების მისაღებად (იხ. დამატებითი ცხრილი 1). ჰის კოეფიციენტები ინტერპოლირებულ ჰისტოგრამებში განისაზღვრა, როგორც აღწერილია მეთოდები სექციაში (იხ. დამატებითი სურ. 3 და 4). h მნიშვნელობები Hv1 WT ნაჩვენებია წყვეტილი ხაზების სახით. ვარსკვლავები მიუთითებს სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებს მუტანტისა და WT გადასასვლელებს შორის (p მას შემდეგ, რაც ჩვენ გამოვრიცხეთ CCD, როგორც GBTA კოოპერატივის შეკავშირების პირდაპირი შუამავალი, ჩვენ ვკითხეთ, არის თუ არა ჩართული VSD-ს შორის ურთიერთქმედება დამაკავშირებელ ადგილებს შორის ალოსტერულ დაწყვილებაში. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ GBTA-დაკავშირების კოოპერატივობა გაუქმდა D112 ნარჩენის კონსერვატიული მუტაციით (ნახ. 3c). S1 ტრანსმემბრანულ სეგმენტში.S1 შეიცავს ორ სხვა უარყოფითად დამუხტულ ნარჩენებს, E119 და D123, რომლებიც განლაგებულია სპირალის იმავე მხარეს, როგორც D112, მაგრამ უფრო ახლოს ფრაგმენტის გარე ბოლო 24-თან. ადრეული მოლეკულური დინამიკის სიმულაციები მიუთითებს, რომ ეს ნარჩენები იყო დაკავშირებული. D112-მდე წყლის ხაზებით36,37. ამიტომ, ჩვენ შევამოწმეთ, მონაწილეობენ თუ არა E119 და D123 ალოსტერულ შეერთებაში GBTA-დაკავშირების ადგილებს შორის (ნახ. 5b). როგორც უარყოფითი კონტროლი, ჩვენ გამოვცადეთ დადებითად დამუხტული პოზიცია K125, რომელიც მდებარეობს D123-თან ახლოს. მაგრამ S1 სპირალის მეორე მხარეს (სურ. 5ბ).
ჩვენ გავზომეთ E119A, D123A და K125A არხების კონცენტრაციაზე დამოკიდებული დათრგუნვა 2GBI და GBTA-ით და აღმოვაჩინეთ, რომ E119A და K125A მუტაციები მნიშვნელოვნად არ ცვლის არც ერთი ინჰიბიტორის Hill კოეფიციენტს ველურ ტიპთან შედარებით (p > 0.05, სურ. 5d,i). ). მეორეს მხრივ, მუტაციამ D123A მნიშვნელოვნად შეამცირა GBTA-ს Hill კოეფიციენტი (p 0.05/14).
ვინაიდან ორივე ქვედანაყოფის პოზიციაზე 123-ზე მუხტის ნეიტრალიზაციამ გამოიწვია GBTA-ს შეკვრის კოოპერატიულობის ძლიერი ცვლილება, ხოლო ორივე ქვედანაყოფის დამუხტვის შებრუნებას მხოლოდ მცირე ეფექტი ჰქონდა, ჩვენ გავაფართოვეთ ანალიზი, რომ მოიცავდეს მხოლოდ ერთ ქვედანაყოფს დამუხტვის ინვერსიული არხით. ჩვენ გენერირებული Hv1-თან დაკავშირებული დიმერები D123R ჩანაცვლებით C-ტერმინალურ ქვედანაყოფში (ნახ. 5b) და გავზომეთ კონცენტრაცია-რეაქციის დათრგუნვა GBTA-ით და 2GBI-ით. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ GBTA-ს WT-D123R არხებთან დაკავშირების Hill კოეფიციენტი მნიშვნელოვნად მაღალი იყო ვიდრე ველური ტიპის Hv1 (p ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ D112E მუტაციამ გააუქმა GBTA-დაკავშირების Hill კოეფიციენტის ზრდა, რომელიც წარმოიქმნება WT-D123R ფონით (ნახ. 5b,h და დამატებითი ნახ. 4). სურ. 5სთ და დამატებითი ნახ. 3). ეს დასკვნები ვარაუდობენ, რომ გაძლიერებული ალოსტერული დაწყვილება ქვედანაყოფებს შორის, რომელიც გამოწვეულია საპირისპირო მუხტებით 123 პოზიციაზე, არ ითარგმნება უფრო ძლიერ შებოჭვის თანამშრომლობად, როდესაც შებოჭვის ადგილი D112 პოზიციაზე დარღვეულია.
ჩვენ ვიმსჯელეთ, რომ თუ D123 ნარჩენები მეზობელ ღია ქვედანაყოფებზე საკმარისად ახლოს იქნებოდა ერთმანეთთან ელექტროსტატიკურად ურთიერთქმედებისთვის, უარყოფით მუხტებს შორის უსიამოვნო ურთიერთქმედება გარდაიქმნებოდა უარყოფითი და დადებითი მუხტების კომბინაციაში ასპარტინის მჟავას არგინინით ჩანაცვლებით. მიმზიდველი ურთიერთქმედება მათ შორის.ერთი ქვედანაყოფი (WT-D123R დიმერი). მიმზიდველმა ურთიერთქმედებამ შეიძლება გააძლიეროს ინტერფეისი S1 ფრაგმენტის გარე ბოლოებს შორის, რაც გამოიწვევს ქვედანაყოფებს შორის უფრო ძლიერ ალოსტერულ შეერთებას და გაზრდის GBTA-დაკავშირების თანამშრომლობას.
ამ ჰიპოთეზის მხარდასაჭერად, ჩვენ ვეძებდით გზას S1 სეგმენტის გარე ბოლოებს შორის ინტერფეისის გასაძლიერებლად, რომელიც განსხვავდება მუხტის გადართვისგან 123 პოზიციაზე. Lee et al. ადრე ნაპოვნი იყო Hv1 ნარჩენების I127 მუტაცია ცისტეინამდე. სპონტანური ჯვარედინი ერთეულის სპონტანური კავშირის შედეგად17. გარდა ამისა, Hv1-CiVSP ქიმერული VSD-ის კრისტალური სტრუქტურა მიუთითებს, რომ I127 გამოყოფილია S1 სპირალის გარე ბოლოდან მხოლოდ ერთი ნარჩენით24. ამიტომ ჩვენ ვკითხეთ, იყო თუ არა კოვალენტური კავშირის ფორმირება შორის. ცისტეინები 127 პოზიციაზე, რომელიც მოსალოდნელია უფრო ძლიერ S1-S1 ურთიერთქმედებას, აქვს გავლენა GBTA-ს შეკავშირების თანამშრომლობაზე, რაც დაფიქსირდა მუხტის შეცვლით 123 პოზიციაზე.
ჩვენ გავზომეთ Hv1 I127C-ის კონცენტრაციაზე დამოკიდებული დათრგუნვა GBTA და 2GBI 10 მმ β-მერკაპტოეთანოლის (βME) თანდასწრებით და არარსებობით (ნახ. 6a). იმავდროულად, როდესაც ინჰიბიტორი ემატება უჯრედშიდა ხსნარს, მცირდება აგენტი ემატება უჯრედგარე ხსნარს. დაკავშირებული დიმერი ცისტეინის ჩანაცვლებით მხოლოდ ერთ ქვეერთეულში (WT-I127C) გამოყენებული იყო, როგორც უარყოფითი კონტროლი (ნახ. 6a). I127C ქვედანაყოფებს შორის 2GBI დათრგუნვაზე, რადგან Hill კოეფიციენტი I127C Hv1-თან დაკავშირებისთვის, βME-ით ან მის გარეშე, მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა მონოცისტეინის შემცვლელ დიმერებთან შეკავშირებისგან. Hill კოეფიციენტმა ვერ განასხვავებს WT-I127C (ნახ. 6b და დამატებითი ნახ. 3). მკვეთრად განსხვავებით, ჩვენ გავზომეთ სპონტანური ქვეგანყოფილებათაშორისი ჯვარედინი კავშირის დრამატული ეფექტი GBTA-ს დათრგუნვაზე. Hill კოეფიციენტი Hv1 I127C-თან დაკავშირებისთვის βME-ის არარსებობის შემთხვევაში. (ჯვარედინი კავშირი ჩართულია) მნიშვნელოვნად აღემატებოდა გაზომვას βME-ს თანდასწრებით (ჯვარედინი კავშირი გამორთულია) ან WT-127C-ს გამოყენებით დიმერის დასაკავშირებლად (ჯვარედინი კავშირის არარსებობის შემთხვევაში) (ნახ. 6c და დამატებითი ნახ. 4), რაც მიუთითებს, რომ ალოსტერული შეერთება დამაკავშირებელ ადგილებს შორის მნიშვნელოვნად არის გაძლიერებული დისულფიდური ბმების წარმოქმნით S1 ფრაგმენტების გარე ბოლოებს შორის. ეს შედეგები მხარს უჭერს ჩვენს ინტერპრეტაციას, რომ ასპარტატის და არგინინის მიმზიდველი ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედება 123 პოზიციაზე WT-D123R დიმერში იწვევს ალოსტერულ შეერთებას შორის. ქვედანაყოფები.
ღია მდგომარეობის შეერთება ხდება პირდაპირი ფიზიკური ურთიერთქმედებით S1 სეგმენტის გარე ბოლოებს შორის ორ ქვედანაყოფში.
(ა) მუტანტური Hv1 დიმერების და დამაკავშირებელი დიმერების სქემატური წარმოდგენა, შექმნილია იმის გამოსაკვლევად, თუ როგორ მოქმედებს ცისტეინის ჯვარედინი კავშირები GBTA-ს შეკავშირებაზე. (ბდ) მითითებული კონსტრუქციების კონცენტრაციაზე დამოკიდებული დათრგუნვა 2GBI (b,d) და GBTA (c, ე) უჯრედგარე ხსნარში 10 მმ βME-ს არსებობისას ან არარსებობის შემთხვევაში. თითოეული წერტილი წარმოადგენს საშუალო ინჰიბირებას ± SD 3-დან 10 გაზომვამდე. მრუდი იყო Hill fit, რომელიც გამოიყენებოდა Kd მნიშვნელობების მისაღებად (იხ. დამატებითი ცხრილი 1). ბორცვის კოეფიციენტები ჩასმული ჰისტოგრამებში განისაზღვრა 3 და 4 დამატებით ნახატებში მოხსენებული მორგებიდან. ვარსკვლავი (c,e) მიუთითებს სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებს GBTA ინჰიბიციის სხვადასხვა პირობებს შორის (p 0.05).
ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ βME-ის არარსებობის შემთხვევაში, GBTA-ს დაკავშირების Hill კოეფიციენტი D112E I127C Hv1 დიმერთან იყო მნიშვნელოვნად მაღალი ვიდრე გაზომილი შემცირების აგენტების თანდასწრებით (ნახ. 6e და დამატებითი ნახ. 4), რაც გულისხმობს, რომ D112E მუტაცია არ გააუქმა ცისტეინის 127-ის ჯვარედინი კავშირის შედეგად გამოწვეული GBTA შეკავშირების თანამშრომლობის ზრდა. 2GBI D112E, I127C Hv1 დიმერებთან შეკავშირების კოეფიციენტი ასევე არ იყო მნიშვნელოვანი გავლენა D112E მუტაციით (სურათი 1).6d და დამატებითი. სურ. 3).
ერთად აღებული, ეს დასკვნები ვარაუდობენ, რომ GBTA შეკავშირება გაძლიერებულია S1 ფრაგმენტების გარე ბოლოებს შორის მიმდებარე Hv1 ქვედანაყოფებში მიმზიდველი ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების ან ჩანაცვლებულ ცისტეინებს შორის კოვალენტური ბმების წარმოქმნით. მიუხედავად იმისა, რომ მიმზიდველი ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების ეფექტი კოოპერატიულობაზე შეიძლება გაუქმდეს მუტაციით D112E, კოვალენტური ბმების ეფექტი არ შეიძლება.
გუანიდინის წარმოებულების Hv1 არხებთან დასაკავშირებლად ხელმისაწვდომი ქიმიური სივრცის შესწავლისას ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 2-გუანიდინოთიაზოლებს, როგორიცაა GBTA, აქვთ უფრო მკვეთრი დამოკიდებულება კონცენტრაციაზე, ვიდრე 2-გუანიდინობენზიმიდაზოლები (ნახ. 1c). და მონომერულმა არხებმა (ნახ. 2a,b) და დიმერულ არხთან, რომელშიც ერთი ქვედანაყოფი წინასწარ იყო მიბმული ინჰიბიტორთან (ნახ. 4) მიგვიყვანა დასკვნამდე, რომ Hv1-ის დათრგუნვა GBTA-ით მოქმედება არის სინერგიული პროცესი და ორ ქვეერთეულში ნაერთების შეკავშირების ადგილები ალოსტერიულად არის დაწყვილებული. აღმოჩენა, რომ GBTA აკავშირებს ღია არხს, როგორც ადრე ნაჩვენები იყო დაკავშირებული ნაერთისთვის 2GBI32, ვარაუდობს, რომ ალოსტერული დაწყვილება შეიძლება კონკრეტულად შეფასდეს ღია მდგომარეობაში. ჩვენი კოოპერატიული შებოჭვის მოდელი შეძლო რაოდენობრივად აღეწერა Hv1-ის დათრგუნვა GBTA-ს მიერ (ნახ. 2c) და აეხსნა 2GBI და GBTA-ს სხვადასხვა ეფექტი მემბრანის რეპოლარიზაციის შემდეგ არხის კუდის დენების დაშლაზე, რაც მხარს უჭერს შებოჭვის პროცესის ჩვენს ინტერპრეტაციას.
მაქსიმალური Hill კოეფიციენტი, რომელიც შეიძლება მიღწეული იყოს ალოსტერულ ცილაში ორი შემაკავშირებელი ადგილით (როგორიცაა Hv1) ​​არის 2. ჩვენ გავზომეთ GBTA Hv1 ველური ტიპის დასაკავშირებლად 1.31 კოეფიციენტით, რომელიც გაიზარდა 1.88-მდე Hv1 I127C-ში. სინერგიული თავისუფალი ენერგია, განსხვავება ყველაზე დაბალი და მაღალი აფინურობის ადგილების შეკვრის თავისუფალ ენერგიას შორის (იხ. მეთოდები), იყო 1.3 კკალ/მოლი Hv1 ველური ტიპის შემთხვევაში და 2.7 კკალ/მოლი Hv1 I127C-ის შემთხვევაში. ჟანგბადის ჰემოგლობინთან თანამშრომლობითი პროცესის ყველაზე ცნობილი და კარგად შესწავლილი მაგალითია38.ადამიანის ჰემოგლობინისთვის (ტეტრამერი ოთხი ალოსტერიულად დაწყვილებული დამაკავშირებელი ადგილით), Hill კოეფიციენტი მერყეობს 2,5-3,0-დან, მნიშვნელობებით 1,26-დან 3,64-მდე. კკალ/მოლი, ექსპერიმენტული პირობებიდან გამომდინარე38. ამრიგად, გლობალური ენერგეტიკის თვალსაზრისით, GBTA-ს Hv1-თან შეკავშირების თანამშრომლობა არსებითად არ განსხვავდება ჰემოგლობინთან O2-ის შეკავშირებისგან, როდესაც განიხილება ცილოვანი ქვედანაყოფების განსხვავებული რაოდენობა ორ სისტემაში.
ჩვენს სინერგიულ მოდელში, GBTA მოლეკულების ერთ ქვედანაყოფთან შეკავშირება იწვევს მიმდებარე ქვედანაყოფის შეკავშირების აფინურობის ზრდას. ჩვენ წარმოვიდგენთ პროცესს, რომლის დროსაც პირველი შემაკავშირებელი მოვლენის შედეგად (ინდუცირებული მორგება) შემაკავშირებელი გარემოს გადაკეთება იწვევს ცვლილებები ქვეერთეულებს შორის ურთიერთქმედებებში. ამ ცვლილებების საპასუხოდ, მიმდებარე ქვედანაყოფები ცვლის მათ შეკავშირების ადგილს, რაც იწვევს GBTA-ს უფრო მჭიდრო შეკავშირებას. ამ პროცესის დროს, S1 ასპარტატი D112 პასუხისმგებელია შეკვრის ადგილის გადაკეთებაზე, რომელიც დაკავშირებულია შეკავშირების მატებასთან.D112 ადრე ნაჩვენები იყო, რომ ის არის Hv1 პროტონის შეღწევის გზის ნაწილი და მოქმედებს როგორც სელექციურობის ფილტრი27,28. ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ სელექციურობის ფილტრები ორ Hv1 ქვედანაყოფში ალოსტერიულად არის შეწყვილებული ღია მდგომარეობაში. ნახაზი 7a გვიჩვენებს GBTA შეკვრის ადგილის სავარაუდო მდებარეობას და D112, D123, K125 და I127 ნარჩენების მდებარეობას Hv1 VSD-ის სქემაზე დაფუძნებული. Hv1-CiVSP ქიმერის კრისტალურ სტრუქტურაზე. შემოთავაზებული მიმართულებები ალოსტერული დაწყვილებისთვის, რომელიც მოიცავს S1-ის უჯრედგარე ბოლოს, ნაჩვენებია შავი ისრებით.
(ა) Hv1 VSD-ის სქემა. Hv1-CiVSP ქიმერის კრისტალური სტრუქტურის საფუძველზე, ხვეული სეგმენტები ნაჩვენებია ცილინდრული სახით. ამ კონფიგურაციაში, S4 სეგმენტის შიდა ბოლო ერწყმის CCD-ს (არ არის ნაჩვენები). შეკრული GBTA-ს სავარაუდო მდებარეობები ნაჩვენებია ნაცრისფერი ოვალების სახით. შავი ისრები მიუთითებს ბილიკებზე, რომლებიც ჩართულია ალოსტერულ დაწყვილებაში შემაკავშირებელ ადგილებს შორის ორ მიმდებარე ქვედანაყოფში. გამოკვლეული S1 ნარჩენების პოზიციები მონიშნულია ფერადი სფეროებით. (ბ) Hv1 ქვეერთეულების სქემატური ილუსტრაცია მოწყობილია ორ სხვადასხვა დიმერის კონფიგურაციაში, როგორც ჩანს მემბრანის სიბრტყის უჯრედგარე მხრიდან. მარცხენა პანელზე, დიმერის ინტერფეისი იქმნება S4 სპირალით. ორი VSD-ის ბრუნვა 20 გრადუსით საათის ისრის მიმართულებით მემბრანის სიბრტყის პერპენდიკულარული ღერძის გარშემო, რასაც თან ახლავს ორი S4 ხვეულის გარე ბოლოების გამოყოფა (დატეხილი ისრები), წარმოქმნის განლაგებას, რომელიც ნაჩვენებია მარჯვნივ. ამ კონფიგურაციაში, ნარჩენები D123 და I127 მიმდებარე ქვედანაყოფებიდან დაშვებულია ერთმანეთთან ახლოს. (c) CiVSP VSD-ის სქემატური წარმოდგენა. 4G80 კრისტალურ სტრუქტურაში ნაპოვნი დიმერის კონფიგურაციაში. პოზიცია P140 CiVSP-ში შეესაბამება D123 პოზიციას Hv1-ში.
ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ ამაღელვებელი ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედება ნარჩენებს შორის 123 (123D/123D ან 123R/123R) ასოცირდება GBTA-დაკავშირების „ნორმალურ“ დონესთან ღია მდგომარეობაში და ცვლის ურთიერთქმედებას მოგერიებიდან მიზიდულზე (123D/123R) , გაზრდილი თანამშრომლობა (ნახ. 5გ). მოსალოდნელია, რომ ალანინის ჩანაცვლებასთან საგრებელი ურთიერთქმედების მოხსნა ასევე გამოიწვევს კოოპერატიულობის გაზრდას. თუმცა, დაფიქსირდა 123A/123A დიმერის თანამშრომლობის დაქვეითება (ნახ. 5e). ერთი შესაძლებელია. ახსნა არის ის, რომ ჰიდროფობიური ნარჩენების ჰიდროფილურ გარემოში მოთავსების დესტაბილიზაციის ეფექტი შეიძლება გადაწონოს სტაბილიზირებელ ეფექტს D123 ნარჩენებს შორის მოწინააღმდეგე ურთიერთქმედების აღმოფხვრის გამო, რაც იწვევს შემაკავშირებელ თანამშრომლობის საერთო შემცირებას. Mony et al. Ciona gutis Ci-Hv1-ის პოზიცია D171 (შეესაბამება D123-ს ადამიანის Hv1-ში) გააქტიურებისას იზრდება, რაც მხარს უჭერს მოსაზრებას, რომ D123 მდებარეობს ჰიდროფილურ გარემოში ღია მდგომარეობაში.
ცნობილია, რომ Hv1 არხების გათიშვა ხდება მრავალი გადასვლის გზით19,20,26,39,40,41. Qiu და სხვებმა 26 აღმოაჩინეს, რომ მემბრანის დეპოლარიზაციისას Ci-Hv1 ძაბვის სენსორი განიცდის კონფორმაციულ ცვლილებას, რაც არხს ტოვებს გააქტიურებულ, მაგრამ მაინც დახურულს. , რასაც მოჰყვება მკაფიო გადასვლა, რომელიც იწვევს პროტონების გამტარობის გახსნას ორივე ქვედანაყოფის გზაზე. ძაბვის სენსორის კონფორმაციული ცვლილება მონიტორინგდა ძაბვის დამჭერის ფლუორესცენციით და აღმოჩნდა, რომ მეორე გადასვლა შერჩევით დარღვეული იყო მუტაციით D171 პოზიციაზე. ფლუორესცენტური სიგნალის დარღვევა შეესაბამება ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების არსებობას მეზობელი ქვედანაყოფების D171 ნარჩენებს შორის კონფორმაციული ცვლილების რეაქციის კოორდინატების გასწვრივ რაღაც მომენტში. ეს ინტერპრეტაცია შეესაბამება ჩვენს დასკვნას, რომ D123 ნარჩენი ელექტროსტატიკურად ურთიერთქმედებს ღია მდგომარეობაში. და შუამავლობს ალოსტერულ შეერთებას GBTA-ს შეკვრის ადგილებს შორის.
Fujiwara et al25-მა შესთავაზა, რომ ციტოპლაზმური დახვეული ხვეულის დომენის დიმერის ინტერფეისი ვრცელდება მემბრანაში და შეიცავს ორ S4 სპირალს (ნახ. 7b, მარცხენა პანელი). S4 სპირალისა და CCD-ის დამაკავშირებელი რეგიონის მთელი VSD და ფუნქციური ანალიზი. ტრანსმემბრანული pH გრადიენტის არარსებობის შემთხვევაში, Hv1 არხების გასახსნელად საჭიროა მემბრანის მნიშვნელოვანი დეპოლარიზაცია და ცისტეინის ჯვარედინი კავშირი ხდება პირობებში, როდესაც არხი უპირატესად დახურულია. მაშასადამე, აღმოჩენილი S4-S4 ინტერფეისი, სავარაუდოდ, ასახავს არამდგომარეობის ქვედანაყოფების კონფიგურაციას. სხვა კვლევებმა აღმოაჩინეს მტკიცებულება S1 და S2-ის ჩართულობის შესახებ ქვეგანყოფილების ურთიერთქმედებებში კარიბჭის დროს17,21,26, რაც ვარაუდობს, რომ არხებმა შეიძლება მიიღონ სხვადასხვა ქვედანაყოფის კონფიგურაცია ღია და დახურული მდგომარეობები, იდეა, რომელიც შეესაბამება Mony et al. S1 მოძრაობს 39-ით კარიბჭის დროს.
აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ღია მდგომარეობაში, S1 სპირალის უჯრედგარე ბოლოები საკმარისად ახლოსაა, რათა მხარი დაუჭიროს პირდაპირ ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედებას, რომელიც შუამავლობს ალოსტერულ დაწყვილებას ქვედანაყოფებს შორის. დიმერის კონფიგურაციაში გაფართოებული S4-S4 ურთიერთქმედებით, S1 სპირალი ძალიან შორს არის. ერთმანეთისგან დამოუკიდებლად უშუალოდ ურთიერთქმედების მიზნით. თუმცა, ორი VSD ქვედანაყოფის 20°-იანი ბრუნვა საათის ისრის მიმართულებით მემბრანის სიბრტყის პერპენდიკულარული ღერძის გარშემო, ორი S4 ხვეულის გარე ბოლოების განცალკევებასთან ერთად, იძლევა S1-S1 კონფიგურაციის თანმიმდევრულობას. ჩვენი დასკვნებით (ნახ. 7b, მარჯვენა პანელი). ჩვენ გირჩევთ ამ კონფიგურაციას არხისთვის ღია მდგომარეობაში.
მიუხედავად იმისა, რომ ითვლება, რომ CiVSP ფერმენტი ფუნქციონირებს როგორც მონომერი, მისი იზოლირებული VSD-ის კრისტალური სტრუქტურა დაფიქსირებულია დიმერის მდგომარეობაში. ამ დიმერის S1 ხვეულების გარე ბოლოები სივრცულად ახლოს არის ერთმანეთთან და საერთო კონფიგურაცია მსგავსია შემოთავაზებულის. Hv1-სთვის (ნახ. 7c). CiVSP დიმერში, მიმდებარე ქვედანაყოფის უახლოესი ნარჩენი იყო პროლინი 140 პოზიციაზე (ნახ. 7c). საინტერესოა, რომ P140 CiVSP-ში შეესაბამება D123 პოზიციას Hv1-ში. მსგავსება ქვედანაყოფის კონფიგურაციაში Hv1-ს შორის. და CiVSP დიმერები ვარაუდობენ, რომ ამ ცილების VSD-ებს აქვთ შინაგანი ტენდენცია შექმნან ინტერფეისი, სადაც S1-ის უჯრედგარე ბოლოები ურთიერთქმედებენ.
Hv1-ის არსებითი როლი სპერმის უჯრედების აქტივაციაში ამ არხს აქცევს წამლის მიმზიდველ სამიზნედ მამაკაცის ნაყოფიერების კონტროლისთვის. გარდა ამისა, Hv1-ის გააქტიურება მიკროგლიაში აუარესებს გამოჯანმრთელებას იშემიური ინსულტისგან. აღმოჩნდა, რომ Hv1-ის გაძლიერებული აქტივობა დაკავშირებულია დაბალთან. გადარჩენა პაციენტებში ძუძუს 12 ან კოლორექტალური კიბოთი 13 და ითვლება, რომ ხელს უწყობს B-უჯრედოვანი ავთვისებიანი სიმსივნეების განვითარებას 11 . ამიტომ, მცირე მოლეკულური პრეპარატები, რომლებიც მიზნად ისახავს Hv1-ს, შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც ნეიროპროტექტორული აგენტები ან კიბოს საწინააღმდეგო თერაპიული საშუალებები. ღია Hv1 ქვეგანყოფილება, რაც იწვევს შეკავშირების მატებას, შეიძლება გამოიწვიოს უფრო ძლიერი წამლების შექმნა, რომლებიც მიზნად ისახავს Hv1 არხებს.
ადამიანის Hv1-ის ადგილზე მიმართული მუტაგენეზი ჩატარდა სტანდარტული PCR ტექნიკის გამოყენებით. Hv1NCCiVSP კონსტრუქციაში Hv1-ის 1-96 და 228-273 ნარჩენები შეიცვალა CiVSP18-ის 1-113 და 240-576 ნარჩენებით. Hv1, დაკავშირებული დიმერში. ერთი ქვედანაყოფის C-ბოლო დაკავშირებულია მეორე ქვედანაყოფის N-ბოლოსთან GGSGGSGSGGSGSGGSGG მაკავშირებლის მეშვეობით. სხვადასხვა კონსტრუქციის შემცველი pGEMHE პლაზმიდები იყო ხაზოვანი Nhe1 ან Sph1 შეზღუდვის ფერმენტებით (New England Biolabs) და რნმ-ით სინთეზი განხორციელდა. T7 mMessage mMachine transcription kit (Ambion). ელექტროფიზიოლოგიურ გაზომვებამდე 1-3 დღით ადრე, cRNA შეჰყავდათ Xenopus-ის კვერცხუჯრედებში (50 ნლ უჯრედში, 0.3-1.5 μg/μl). V და VI სტადიის ოოციტები მიიღეს Xenopus laevis-ისგან (NASCO). Ecocyte Bioscience-დან. რნმ-ის ინექციის შემდეგ, უჯრედები შენარჩუნებული იყო ND96 გარემოში, რომელიც შეიცავდა 96 მმ NaCl, 2 მმ KCl, 1.8 მმ CaCl, 1 მმ MgCl, 10 მმ HEPES, 5 მმ პირუვატი, 100 მკგ/მლ 18 მკგ/მლ. .
2-გუანიდინო-ბენზიმიდაზოლი[1], 2-გუანიდინო-ბენზოთიაზოლი[2], (4-მეთილ-1,3-თიაზოლ-2-ილ) გუანიდინი [5], (5-ბრომო-4-მეთილ-1,3 -თიაზოლ-2-ილ) გუანიდინი) [6], ეთილის 2-გუანიდინო-5-მეთილ-1,3-თიაზოლ-4-კარბოქსილატი [8], ეთილის 2-გუანიდინო-4-მეთილ-1,3-თიაზოლი- 5-კარბოქსილატი [9] და (2-გუანიდინო-4-მეთილ-1,3-თიაზოლ-5-ილ)ეთილის აცეტატი [10] იყო Sigma-Aldrich-დან. Famotidine [7] იყო MP Biomedicals-დან.1-[4 -(4-ქლოროფენილ)-1,3-თიაზოლ-2-ილ]გუანიდინი[11] და 1-[4-(3,4-დიმეთოქსიფენილ)-1,3- თიაზოლ-2-ილ]გუანიდინი [12] იყო Matrix Scientific-დან. ეს ნაერთები კომერციულად ხელმისაწვდომი უმაღლესი სისუფთავითაა. ისინი იხსნება მშრალ DMSO-ში 100 მმ მარაგის ხსნარის შესაქმნელად, რომელიც შემდეგ განზავებულია ჩამწერ ხსნარში სასურველი საბოლოო კონცენტრაციით. ნაერთები 3 და 4 სინთეზირებული იყო ქვემოთ მინიმუმ 99% სისუფთავე.
2-ამინო-4-(ტრიფტორმეთილ)ბენზოლეთიოლის ჰიდროქლორიდის სუსპენზიას (1,02 გ, 4,5 მმოლი) 25 მლ წყალწყლიან მარილმჟავას (2,5 N) დაემატა მყარი დიციანდიამიდი (380 მგ, 4,5 მმოლი) და მიღებულ ჰეტეროგენულ ნარევს. რეფლუქსით ენერგიული მორევით 4 საათის განმავლობაში. სარეაქციო ნარევი გაცივდა ოთახის ტემპერატურამდე და განეიტრალდა 10N კალიუმის ჰიდროქსიდის თანდათანობით დამატებით. წარმოქმნილი თეთრი ნალექი გაფილტრული იყო, გარეცხილი ცივი წყლით (3 × 50 მლ), გაშრეს ღუმელში ( 65 °C) რამდენიმე საათის განმავლობაში, შემდეგ კი ხელახლა კრისტალიზდება ეთილის აცეტატიდან/ნავთობის ეთერიდან, რათა მიიღოთ თეთრი მყარი (500 მგ, 48%); mp 221–222 °C (სინათლე 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (ძალიან ფართო s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 Hz), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z გამოთვლილი მნიშვნელობა. C9H8F3N4S-ისთვის (M + H)+: ნაპოვნია 0416, 21. : 261.0419.
ნაფთო[1,2-d]თიაზოლ-2-ამინი (300 მგ, 1.5 მმოლი), სინთეზირებული, როგორც ადრე იყო აღწერილი, გაცხელდა 200 °C-მდე ზეთის აბაზანაში პატარა სინჯარაში. 300 მგ (დიდი ჭარბი) ციანამიდი და ცხელ ნაერთს სწრაფად დაემატა მარილმჟავა და ნარევი ინახებოდა ზეთის აბაზანაში დაახლოებით 2 წუთის განმავლობაში, ამ დროის განმავლობაში წყლის უმეტესი ნაწილი აორთქლდა. შემდეგ სარეაქციო ნარევი გაცივდა ოთახის ტემპერატურამდე და შედეგად მიღებული მასალა გამაგრდა. იყო დატეხილი პატარა ნაჭრებად და გარეცხილი წყლით, რათა მიეღო ღია ყვითელი ამორფული მყარი. (38 მგ, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz). , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d , 1 H, J = 8,3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z12H+291. , ნაპოვნია: 243.0704.
პროტონული დენები გაზომილი იყო კვერცხუჯრედის შიდა და გარე ნაწილებში, რომლებიც გამოხატავენ სხვადასხვა კონსტრუქციებს Axopatch 200B გამაძლიერებლის გამოყენებით, რომელსაც აკონტროლებს Axon Digidata 1440A (მოლეკულური მოწყობილობები) pClamp10 პროგრამული უზრუნველყოფით. უჯრედშიდა და უჯრედგარე ხსნარებს აქვთ იგივე შემადგენლობა: 100-(N-მორფოლი22). )ეთანსულფონის მჟავა (MES), 30 მმ ტეტრაეთილამონიუმის (TEA) მეზილატი, 5 მმ ჩაის ქლორიდი, 5 მმ ეთილენგლიკოლ-ბის(2-ამინოეთილ)-N,N,N',N'-ტეტრაძმარმჟავა (EGTA), მორგებული pH 6.0 TEA ჰიდროქსიდით. ყველა გაზომვა შესრულდა 22 ± 2 °C-ზე. პიპეტს აქვს დაშვების წინააღმდეგობა 1.5–4 MΩ. მიმდინარე კვალი გაფილტრული იყო 1 kHz-ზე, აიღეს ნიმუში 5 kHz-ზე და გაანალიზეს Clampfit10.2 (Molecular Devices) ) და Origin8.1 (OriginLab).
ხსნარები, რომლებიც შეიცავდა Hv1 ინჰიბიტორის სხვადასხვა კონცენტრაციას და ზოგიერთ შემთხვევაში 10 მმ βME-ს შეჰყავდა აბანოში გრავიტაციით მანიფოლდის მეშვეობით, რომელიც დაკავშირებულია VC-6 პერფუზიის სარქველთან (Warner Instr.), რომელიც გადადიოდა pClamp პროგრამული უზრუნველყოფის TTL (Transistor-). ტრანზისტორი ლოგიკის) სიგნალები. სწრაფი პერფუზიის ექსპერიმენტები ჩატარდა მრავალ მილის პერფუზიის ფანქრის გამოყენებით (AutoMate Sci.) 360 მკმ დიამეტრის მიწოდების წვერით, რომელიც დამონტაჟებულია პაჩ პიპეტის წინ. არხის დათრგუნვა განისაზღვრა იზოქრონიული ამპერომეტრიული გაზომვებით ბოლოში. +120 mV დეპოლარიზაციის პულსი. GV გაზომვები შესრულდა, როგორც ადრე იყო აღწერილი18,20. კუდის დენები დაფიქსირდა -40 mV-ზე დეპოლარიზაციის საფეხურების შემდეგ სხვადასხვა ძაბვაზე -20 mV-დან +120 mV-მდე, თუ სხვაგვარად არ არის მითითებული. საცნობარო პულსი, რომელიც წინ უძღვის ტესტის პულსს. გამოიყენება მიმდინარე დაშლის გამოსასწორებლად 18 .GV გრაფიკი შეესაბამება ბოლცმანის განტოლებას:
აშკარა დისოციაციის მუდმივები (Kd) არხებისა და ინჰიბიტორების სხვადასხვა კომბინაციისთვის (დამატებითი ცხრილი 1) განისაზღვრა ინჰიბირების კონცენტრაციის დამოკიდებულების (საშუალო %ინჰიბის მნიშვნელობები) დაყენებით Hill განტოლებასთან:
სადაც [I] არის I ინჰიბიტორის კონცენტრაცია და h არის Hill კოეფიციენტი. Hill კოეფიციენტის გამოსათვლელად, განტოლება (2) გადანაწილებულია როგორც: