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Le canal protonique voltage-dépendant Hv1 est un complexe dimère constitué de deux domaines de détection de tension (VSD), dont chacun contient une voie de perméation des protons déclenchée. La dimérisation est contrôlée par le domaine cytoplasmique de la bobine enroulée. La transition de l'état fermé à l'état fermé. on sait que l'état ouvert dans les deux VSD se produit de manière coopérative ; cependant, on sait peu de choses sur les mécanismes sous-jacents. Les interfaces inter-sous-unités jouent un rôle clé dans les processus allostériques ; cependant, de telles interfaces n'ont pas été identifiées dans les canaux Hv1 ouverts. Nous démontrons ici que les dérivés du 2-guanidinothiazole bloquent deux VSD Hv1 de manière coopérative et utilisent l'un de ces composés comme sonde pour le couplage allostérique entre sous-unités ouvertes. L'extrémité du premier fragment transmembranaire du VSD forme une interface inter-sous-unités qui assure le couplage entre les sites de liaison, alors que le domaine de la bobine enroulée n'est pas directement impliqué dans ce processus. Nous avons également trouvé des preuves solides que le filtre sélectif des protons du canal contrôle la coopérativité de liaison du bloqueur. .
Les canaux protoniques dépendants du potentiel jouent un rôle important dans une variété d'organismes, du phytoplancton aux humains1. Dans la plupart des cellules, ces canaux assurent la médiation de l'efflux de protons depuis la membrane protonique et régulent l'activité de la NADPH oxydase. Le seul canal protonique dépendant du potentiel connu chez l'homme est Hv1, qui est le produit du gène HVCN12,3. Il a été démontré que Hv1 (alias VSOP) joue un rôle dans la prolifération des cellules B4, la production d'espèces réactives de l'oxygène par le système immunitaire inné5,6,7,8, les spermatozoïdes motilité9 et régulation du pH du liquide de surface des voies respiratoires10. Ce canal est impliqué dans plusieurs types de cancer surexprimés tels que les tumeurs malignes à cellules B4,11 et les cancers du sein et colorectal12,13. Il a été constaté qu'une activité excessive de Hv1 augmente le potentiel métastatique des cellules cancéreuses11, 12. Dans le cerveau, Hv1 est exprimé par les microglies, et il a été démontré que son activité exacerbe les lésions cérébrales dans les modèles d'accident vasculaire cérébral ischémique.
La protéine Hv1 contient un domaine sensible au potentiel (VSD), composé de quatre segments transmembranaires appelés S1 à S414. Le VSD ressemble aux domaines correspondants des canaux Na+, K+ et Ca2+ dépendants du potentiel et des phosphatases sensibles au potentiel, telles que CiVSP de Ciona gutis15. Dans ces autres protéines, l'extrémité C-terminale de S4 est attachée à un module effecteur, le domaine des pores ou une enzyme. Dans Hv1, S4 est lié au domaine en spirale (CCD) situé du côté cytoplasmique de la membrane. .Le canal est un complexe dimère composé de deux VSD, chacun contenant une voie de perméation de protons fermée16,17,18. Ces deux sous-unités Hv1 se sont ouvertes de manière coopérative19,20,21,22, suggérant que le couplage allostérique et les interactions inter-sous-unités jouent un rôle important dans le processus de déclenchement. L'interface entre les sous-unités au sein du domaine de la bobine enroulée est bien définie car les structures cristallines des deux domaines isolés sont disponibles 22,23. D'autre part, l'interface entre les VSD au sein de la membrane n'est pas bien compris. La structure cristalline de la protéine chimérique Hv1-CiVSP ne fournit pas d'informations sur cette interface, car l'organisation trimérique du complexe de canaux cristallisés peut résulter du remplacement du CCD Hv1 natif par la fermeture à glissière de leucine de levure GCN424.
Une étude récente de l'organisation des sous-unités du canal Hv1 a conclu que deux hélices S4 passent dans le CCD sans perturbation grave de la structure secondaire, ce qui entraîne de longues hélices qui partent de la membrane et se projettent dans le cytoplasme. Sur la base de l'analyse de réticulation de la cystéine, cette étude propose que les VSD Hv1 se contactent le long du segment S4. Cependant, d'autres études ont proposé des interfaces alternatives entre les VSD. Ces interfaces incluent les segments S1 17, 21, 26 et les extrémités extérieures du segment S2 21. Une raison possible du conflit Les résultats de ces études sont que le couplage allostérique entre les VSD a été examiné en relation avec le processus de déclenchement, qui dépend des états fermé et ouvert, et que l'interface entre les VSD peut varier selon les changements d'état de conformation.
Ici, nous avons découvert que le 2-guanidinothiazole inhibe les canaux Hv1 en se liant de manière synergique à deux VSD ouverts, et avons utilisé l'un des composés, le 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), pour sonder l'interaction entre les sous-unités à l'état ouvert. Nous avons constaté que la courbe de liaison du GBTA peut être bien décrite par un modèle quantitatif dans lequel la liaison d'un inhibiteur à une sous-unité entraîne une augmentation de l'affinité de liaison de la sous-unité adjacente. Nous avons également constaté que les résidus D112, filtres de sélectivité pour le les canaux 27, 28 et une partie du site de liaison du dérivé guanidine 29 contrôlent la coopérativité de liaison du GBTA. Nous montrons que la liaison coopérative est maintenue dans le dimère Hv1, où le CCD se sépare du segment S4, ce qui suggère que l'interface intersous-unités dans le CCD ne le fait pas directement. médient le couplage allostérique entre les sites de liaison au GBTA. En revanche, nous constatons que le fragment S1 fait partie de l'interface entre les sous-unités et proposons un arrangement de VSD adjacents avec l'extrémité extracellulaire de l'hélice S4 éloignée du centre du dimère pour permettre le fragment S1 soit à l’état ouvert.
Les inhibiteurs de petites molécules de Hv1 sont utiles comme médicaments anticancéreux et agents neuroprotecteurs. Cependant, à ce jour, peu de composés ont été capables d'inhiber le canal 30, 31, 32, 33. Parmi eux, le 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, composé [1] sur la Fig. 1a) et ses dérivés bloquent la perméation des protons par le VSD29,32 à travers le canal. On pense que la liaison de ces composés se produit indépendamment dans les deux sous-unités ouvertes. Le 2-guanidinobenzothiazole (GBTA, composé [2] sur la figure 1a) a été détecté. Il a déjà été démontré qu'il inhibait le Hv1 presque aussi efficacement que le 2GBI lorsqu'il était testé à une concentration de 200 μM (Figure 1b). Nous avons examiné d'autres dérivés du thiazole et avons constaté que certains d'entre eux inhibaient le canal avec une puissance similaire ou supérieure à celle du GBTA (Fig. 1 et Supplémentaire). texte).Nous avons déterminé les courbes concentration-réponse de quatre dérivés du thiazole (GBTA et composés [3], [6] et [11], Fig. 1c) et avons constaté qu'elles étaient plus raides que celles du 2GBI. Les coefficients de Hill (h) des dérivés thiazole variait de 1,109 ± 0,040 à 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c et Fig. 1 supplémentaire). En revanche, le coefficient de Hill pour 2GBI était de 0,975 ± 0,024·29, Fig. 2a et Fig. 1 supplémentaire). Un coefficient de Hill supérieur à 1 indique une coopérativité de liaison. Parce que chaque sous-unité Hv1 possède son propre inhibiteur. site de liaison,29,32 nous avons estimé que la liaison d'un dérivé du thiazole à une sous-unité pourrait améliorer la liaison d'une deuxième molécule inhibitrice à la sous-unité adjacente. Le GBTA était le composé testé avec le coefficient de Hill le plus élevé. Par conséquent, nous avons choisi ce composé pour étudier plus en détail le mécanisme de synergie de liaison et utiliser le 2GBI comme contrôle négatif de référence.
(a) Composés testés : [1] Inhibiteur de référence du Hv1, 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluorométhyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphto[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-méthyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-méthyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] ester éthylique de l'acide 2-guanidino-5-méthyl-1,3-thiazole-4-carboxylique, [9] 2-guanidino-4-méthyl éthyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-méthyl-1,3-thiazol-5-yl)acétate d'éthyle, [11]1-[4-(4 -Chlorophényl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-diméthoxyphényl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine. (b) Inhibition de l'activité du Hv1 humain par les guanidinothiazoles indiqués et le composé de référence 2GBI (barres bleu-vert) Les courants protoniques .Hv1 ont été mesurés dans des plaques inversées d'ovocytes de Xenopus en réponse à une dépolarisation d'un potentiel de maintien de -80 mV à +120 mV. Chaque inhibiteur a été ajouté au bain à une concentration de 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Les données sont moyennes ± SEM (n≥4). (c) Inhibition dépendante de la concentration du Hv1 humain par les composés [2], [3], [6] et [11]. Chaque point représente l'inhibition moyenne ± SD de 3 à 15 mesures. La ligne est un ajustement de Hill utilisé pour obtenir les valeurs apparentes de Kd rapportées dans le tableau supplémentaire 1. Les coefficients de Hill ont été déterminés à partir des ajustements rapportés dans la figure supplémentaire 1 : h (1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (voir Méthodes).
(a, b) Les composés 2GBI et GBTA ont inhibé le Hv1 dimère et monomère de manière dépendante de la concentration. Chaque point représente l'inhibition moyenne ± écart-type de 3 à 8 mesures et la courbe est un ajustement de Hill. Les coefficients de Hill (h) indiqués dans les histogrammes en médaillon ont été déterminés à partir des ajustements rapportés dans les figures supplémentaires 3 et 4. La réponse en concentration du GBTA illustrée en (a) est la même que celle de la figure 1c. Voir le tableau supplémentaire 1 pour les valeurs apparentes de Kd. (c) Modélisation de la liaison coopérative de GBTA au dimère Hv1. La ligne noire continue représente l'ajustement aux données expérimentales par l'équation (6), qui décrit le modèle de liaison présenté en (d). Les lignes pointillées étiquetées Sub 1 et Sub 2 représentent l'association bimoléculaire -courbes d'équilibre de dissociation des premier et deuxième événements de liaison, respectivement (Sub 1 : OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM ; Sub 2 : BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagramme schématique du mécanisme proposé du bloc Hv1. Dans le cas de GBTA, la liaison à une sous-unité ouverte augmente l'affinité de la sous-unité ouverte adjacente (Kd2
Pour décrire quantitativement la liaison coopérative de GBTA au canal, nous avons utilisé un modèle dans lequel l'une ou l'autre sous-unité peut se lier à la première molécule inhibitrice suite à une réaction bimoléculaire avec une constante de dissociation Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO* ). La liaison amène le canal à adopter un état dans lequel les sous-unités vides restantes se lient à l'inhibiteur suite à une réaction bimoléculaire unique avec une constante de dissociation Kd2, où Kd2 La ligne noire continue sur la figure 2c représente l'ajustement de l'équation du modèle à la courbe concentration-réponse expérimentale, donnant un Kd1 d'environ 290 μM et un Kd2 d'environ 29 μM (section Méthodes, équation (6)). Le modèle décrit également la liaison du 2GBI, où Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). Dans le Hv1 monomère, il n'y a qu'un seul site de liaison et un seul Kdm (O° + B ⇆ B°). Dans le cas du GBTA, le Kdm est d'environ 54 μM, qui ressemble plus à Kd1 qu'à Kd2 (Fig. 2d). En d'autres termes, le site de liaison du monomère est dans une configuration (O°) plus proche de l'état de haute affinité (BO*) que de l'état de faible affinité. état d'affinité (OO) du dimère, probablement dû à l'élimination de l'interface entre les sous-unités.
Comme indiqué précédemment pour 2GBI32, nous avons constaté que le GBTA supprimait les courants Hv1 en bloquant le canal lorsqu'il était ouvert plutôt qu'en le rendant plus difficile à ouvrir (Fig. 2a, b, d supplémentaires). 2GBI est également connu pour induire des courants de queue à décroissance lente. en réponse à la repolarisation membranaire, mais ce phénomène n'a pas été observé dans GBTA (Fig. 2c supplémentaire). En présence d'inactivation de Hv1 en présence de 2GBI, les portes de chaque sous-unité ne peuvent pas se fermer jusqu'à ce que le bloqueur quitte le site de liaison (le " mécanisme de porte de pied"), et 2GBI se délie plus lentement que les portes ne se ferment. Si une sous-unité Hv1 est débloquée et fermée, tandis que la sous-unité adjacente reste bloquée, la déliaison des molécules 2GBI restantes devient plus lente (capture du bloqueur). Espèce de canal à longue durée de vie avec une seule sous-unité bloquée conduit les protons de manière transitoire avant de se fermer et apporte une contribution significative au courant de queue en décroissance lente.
La découverte selon laquelle la désintégration des courants de queue de Hv1 n'a pas été significativement ralentie en présence de GBTA (Fig. 2c supplémentaire) est cohérente avec un mécanisme de liaison synergique pour ce bloqueur (Fig. 2d). Une fois qu'une molécule de GBTA n'est plus liée à la sous-unité Hv1 , l'affinité du bloqueur pour la sous-unité adjacente diminue d'environ 10 fois, favorisant le processus de déliaison. Cela signifie que la deuxième molécule de GBTA a beaucoup plus de chances de se défaire avant d'être piégée dans le canal. Espèce de canal à longue durée de vie qui produire une seule sous-unité bloquante devrait être beaucoup plus abondante en présence de GBTA qu'en présence de 2GBI, ce qui entraînerait une décroissance plus rapide du courant de queue.
Pour que GBTA se lie de manière coopérative aux deux sous-unités Hv1, les sites de liaison doivent être couplés de manière allostérique. Chaque site de liaison doit être capable de : 1) déclencher une chaîne d'événements qui communiquent avec les sous-unités adjacentes liées à l'inhibiteur, et 2) médier la transition d'une liaison de faible affinité à une liaison de haute affinité.Nous avons estimé que si des résidus spécifiques dans le site de liaison contribuaient au processus coopératif, leur mutation devrait modifier le coefficient de Hill de la courbe concentration-réponse de l'inhibition GBTA de Hv1.Résidus D112, F150 , S181 et R211 se sont révélés précédemment faire partie de l'environnement de liaison de 2GBI29 et nous avons émis l'hypothèse qu'ils seraient également impliqués dans la liaison de GBTA (Fig. 3A). Nous avons mesuré les courbes concentration-réponse inhibitrices de GBTA pour les canaux mutants D112E, F150A, S181A. , et R211S (Figure 3) et ont comparé leurs coefficients de Hill à ceux du type sauvage Hv1, en utilisant 2GBI comme référence. Le résidu V109 se trouve sur la même face du segment S1 que D112 et présente un tour hélicoïdal supplémentaire à l'intérieur de la cellule. V109 n'étant pas impliqué dans la liaison de 2GBI29, nous avons utilisé le mutant V109A comme contrôle (Fig. 3b).
(a) Résidus Hv1 suggérés impliqués dans la liaison du dérivé de la guanidine. Des courbes bleues en pointillés entourent les chaînes latérales proposées précédemment qui interagissent avec différentes parties du composé 2GBI29. (bf) Inhibition dépendante de la concentration des mutants Hv1 indiqués par les composés 2GBI (cyan) et GBTA ( rouge foncé).Chaque point représente l'inhibition moyenne de 3 à 12 mesures ± SD V109 comme contrôle négatif.Les courbes sont des ajustements de Hill utilisés pour obtenir les valeurs apparentes de Kd (voir le tableau supplémentaire 1).Les coefficients de Hill (h) indiqués dans les histogrammes en médaillon ont été déterminés à partir des ajustements rapportés dans les figures supplémentaires 3 et 4. Les valeurs h de référence pour Hv1 WT sont présentées sous forme de lignes pointillées. Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives entre les passages mutants et WT (p Nous avons constaté que la mutation D112E réduisait de manière significative le coefficient de Hill (p La découverte selon laquelle le coefficient de Hill pour la liaison au GBTA est supérieur à 1 dans le dimère Hv1 et devient ~ 1 dans le canal monomère (Fig. 2b) est cohérente avec l'existence d'interactions allostériques entre les sites de liaison dans les deux sous-unités. Dans ce cas, le coefficient de Hill de la liaison du GBTA au dimère auquel le bloqueur s'est lié à une sous-unité devrait être d'environ 1. Nous avons testé cette prédiction dans le dimère lié Hv1 F150A-WT (Fig. 4a), où l'affinité du F150A La sous-unité pour GBTA était supérieure de plus de 2 ordres de grandeur à celle de la sous-unité WT (Fig. 1c et 3d). Nous avons ensuite mesuré les courbes concentration-réponse pour l'inhibition de la sous-unité WT à une concentration basale de 2 μM de GBTA. À cette concentration , le bloqueur devrait lier environ 99 % de la sous-unité F150A et (a) Diagramme schématique du dimère de jonction F150A-WT utilisé pour générer l'hémicanal bloquant ({F150A} b-WT/BAO*). Les losanges blancs montrent l'emplacement de la mutation. Dans les états BAO* et BA*B*, l'affinité de la sous-unité F150A devrait être supérieure à celle de la sous-unité WT. (b) Courants protoniques des canaux F150A-WT mesurés en réponse à des changements de potentiel membranaire de -80 mV à +120 mV.pHi = pHo = 6,0 .Les traces grises représentent les courants mesurés en l'absence d'inhibiteur. La trace noire (contrôle) représente le courant mesuré après ajout de 2 μM de GBTA. À cette concentration, la sous-unité WT n'a pas été inhibée de manière significative, alors que la sous-unité F150A s'est liée presque complètement au GBTA. ({F150A}b-WT).Une nouvelle augmentation de la concentration de GBTA a entraîné un blocage de la sous-unité WT (traces orange et rouge).(c) Inhibition dépendante de la concentration du dimère {F150A}b-WT (inhibiteur pré-lié à Sous-unité F150A). Chaque point représente l'inhibition moyenne ± SD de 3 à 7 mesures. Les courbes étaient des ajustements de Hill utilisés pour obtenir les valeurs apparentes de Kd rapportées dans le tableau supplémentaire 1. Les coefficients de Hill indiqués dans les histogrammes en médaillon ont été déterminés à partir des ajustements rapportés dans les figures 3 et 4 supplémentaires. Les valeurs h de Hv1 WT sont représentés sous forme de lignes pointillées. Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives par rapport au dimère WT Hv1 (p Puisque l'inhibition de Hv1 par la GBTA a été mesurée dans le canal ouvert, nous avons estimé que la coopérativité de liaison de la GBTA pourrait être utilisée pour étudier le mécanisme de couplage inter-sous-unités à l'état ouvert. Ces deux sous-unités Hv1 s'étaient précédemment révélées être fermées de manière coopérative 19,20,21, 22 et il a été proposé que le couplage intersous-unités impliqué dans le déclenchement soit médié par le domaine cytoplasmique en spirale enroulée (CCD) 22,25. Par conséquent, nous avons demandé si le CCD était également impliqué dans le couplage entre les sites de liaison au GBTA à l'état ouvert. Triglycine Des mutations à l'interface entre le fragment transmembranaire S4 et le domaine en spirale ont été montrées dans des études antérieures pour découpler ce domaine du reste du canal tout en maintenant l'intégrité de la dimérisation. Par conséquent, nous avons testé l'effet des mutations V220G, K221G et T222G (Fig. . 5a, mutant GGG) sur la coopérativité de liaison au GBTA. Nous avons constaté une diminution statistiquement insignifiante (p > 0,05) du coefficient de Hill de liaison du GBTA aux canaux GGG par rapport au type sauvage (Fig. 5c), suggérant que malgré son rôle dans le maintien du mutant GGG). deux sous-unités ensemble sont importantes, mais le CCD n'intervient pas directement dans le couplage allostérique inter-sous-unités entre les sites de liaison du GBTA.
(a) Diagramme schématique du dimère Hv1 avec une mutation triglycine à l'extrémité interne de S4 conçue pour perturber le couplage inter-sous-unités médié par le domaine cytoplasmique en spirale enroulée (flèches bleues). (b) Représentation schématique des dimères Hv1 et des dimères de ligature avec mutations indiquées, conçues pour tester les fragments S1 impliqués dans le couplage entre les sous-unités (flèches bleues). (c – h) 2GBI (cyan) et GBTA (rouge foncé) inhibent les constructions indiquées de manière dépendante de la concentration. Chaque point représente l'inhibition moyenne ± SD de 3 à 10 mesures. La courbe était un ajustement de Hill utilisé pour obtenir les valeurs apparentes de Kd (voir le tableau supplémentaire 1). Les coefficients de Hill dans les histogrammes interpolés ont été déterminés comme décrit dans la section Méthodes (voir les figures supplémentaires 3 et 4). Valeurs h de référence pour Hv1 WT sont représentés sous forme de lignes pointillées. Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives entre les passages mutants et WT (p Puisque nous avons exclu le CCD en tant que médiateur direct de la liaison coopérative du GBTA, nous avons demandé si les interactions entre les VSD étaient impliquées dans le couplage allostérique entre les sites de liaison. Nous avons constaté que la coopérativité de liaison au GBTA était abolie par une mutation conservatrice du résidu D112 (Fig. 3c) localisé dans le segment transmembranaire S1. S1 contient deux autres résidus chargés négativement, E119 et D123, situés du même côté de l'hélice que D112, mais plus près de l'extrémité externe 24 du fragment. Les premières simulations de dynamique moléculaire ont indiqué que ces résidus étaient liés à D112 via les conduites d'eau 36, 37. Par conséquent, nous avons testé si E119 et D123 étaient impliqués dans le couplage allostérique entre les sites de liaison au GBTA (Fig. 5b). En tant que contrôle négatif, nous avons testé la position conservée chargée positivement K125, située près de D123. mais de l'autre côté de l'hélice S1 (Fig. 5b).
Nous avons mesuré l'inhibition dépendante de la concentration des canaux E119A, D123A et K125A par 2GBI et GBTA et avons constaté que les mutations E119A et K125A ne modifiaient pas de manière significative le coefficient de Hill de l'un ou l'autre inhibiteur par rapport au type sauvage (p > 0,05, Fig. 5d, i). ). D'autre part, la mutation D123A a réduit de manière significative le coefficient de Hill de GBTA (p 0,05/14).
Étant donné que la neutralisation de la charge en position 123 sur les deux sous-unités a entraîné un changement important dans la coopérativité de liaison du GBTA, alors que l'inversion de la charge sur les deux sous-unités n'a eu qu'un faible effet, nous avons étendu l'analyse pour inclure une seule sous-unité avec le canal d'inversion de charge. généré des dimères liés à Hv1 avec substitution D123R dans la sous-unité C-terminale (Fig. 5b) et mesuré l'inhibition concentration-réponse par GBTA et 2GBI. Nous avons constaté que le coefficient de Hill de la liaison de GBTA aux canaux WT-D123R était significativement plus élevé que celui du Hv1 de type sauvage (p Nous avons également constaté que la mutation D112E supprimait l'augmentation du coefficient de Hill de liaison au GBTA produite par le fond WT-D123R (Fig. 5b, h et Fig. 4 supplémentaire). L'effet sur le coefficient de Hill de la liaison au 2GBI a également été éliminé ( Fig. 5h et Fig. 3 supplémentaire). Ces résultats suggèrent que le couplage allostérique amélioré entre les sous-unités provoqué par des charges opposées en position 123 ne se traduit pas par une coopérativité de liaison plus forte lorsque le site de liaison en position D112 est perturbé.
Nous avons estimé que si les résidus D123 sur les sous-unités ouvertes adjacentes étaient suffisamment proches pour interagir électrostatiquement les uns avec les autres, l'interaction répulsive entre les charges négatives serait convertie en une combinaison de charges négatives et positives par substitution de l'acide aspartique à l'arginine. interaction attrayante entre eux.Une sous-unité (dimère WT-D123R).Des interactions attrayantes peuvent renforcer l'interface entre les extrémités externes du fragment S1, conduisant à un couplage allostérique plus fort entre les sous-unités et à une coopérativité accrue de liaison au GBTA.
Pour étayer cette hypothèse, nous avons cherché un moyen de renforcer l'interface entre les extrémités externes du segment S1, qui est distincte de la commutation de charge en position 123. Lee et al. Une mutation du résidu Hv1 I127 en cystéine a été précédemment trouvée pour entraîner une réticulation spontanée entre les sous-unités17. De plus, la structure cristalline du VSD chimérique Hv1-CiVSP a indiqué que I127 est séparé de l'extrémité externe de l'hélice S1 par un seul résidu24. Nous avons donc demandé si la formation d'une liaison covalente entre les cystéines en position 127, qui devraient entraîner une interaction S1-S1 plus forte, ont un effet sur la coopérativité de liaison au GBTA similaire à celui observé en modifiant la charge en position 123.
Nous avons mesuré l'inhibition dépendante de la concentration du Hv1 I127C par GBTA et 2GBI en présence et en l'absence de 10 mM de β-mercaptoéthanol (βME) (Fig. 6a). En même temps que l'inhibiteur est ajouté à la solution intracellulaire, la réduction L'agent est ajouté à la solution extracellulaire. Un dimère lié avec une substitution de cystéine dans une seule sous-unité (WT-I127C) a été utilisé comme contrôle négatif (Fig. 6a). Nous n'avons pu mesurer aucun effet de la réticulation spontanée entre sous-unités. entre les sous-unités I127C sur l'inhibition de 2GBI, car le coefficient de Hill pour la liaison de I127C à Hv1, avec ou sans βME, était significativement différent de celui pour la liaison aux dimères substitués par la monocystéine. Le coefficient de Hill n'a pas pu différencier le WT-I127C (Fig. 6b et Fig. 3 supplémentaire). À l'opposé, nous avons mesuré l'effet spectaculaire de la réticulation spontanée entre sous-unités sur l'inhibition de la GBTA. Le coefficient de Hill pour la liaison au Hv1 I127C en l'absence de βME (réticulation activée) était significativement plus élevée que celle mesurée en présence de βME (réticulation désactivée) ou en utilisant WT-127C pour lier le dimère (en l'absence de réticulation) (Fig. 6c et Fig. 4 supplémentaire), indiquant que le couplage allostérique entre les sites de liaison est grandement renforcée par la formation de liaisons disulfure entre les extrémités externes des fragments S1. Ces résultats confortent notre interprétation selon laquelle l'interaction électrostatique attractive de l'aspartate et de l'arginine en position 123 dans le dimère WT-D123R entraîne une augmentation du couplage allostérique entre les sous-unités.
Le couplage à l'état ouvert est médié par des interactions physiques directes entre les extrémités externes du segment S1 dans les deux sous-unités.
(a) Représentation schématique des dimères Hv1 mutants et des dimères de liaison, conçue pour étudier comment les réticulations de la cystéine intersous-unités affectent la coopérativité de liaison du GBTA. (bd) Inhibition dépendante de la concentration des constructions indiquées par 2GBI (b, d) et GBTA (c, e) en présence ou en absence de βME 10 mM en solution extracellulaire. Chaque point représente l'inhibition moyenne ± SD de 3 à 10 mesures. La courbe était un ajustement de Hill utilisé pour obtenir les valeurs Kd (voir le tableau supplémentaire 1). Les coefficients de Hill dans les histogrammes en médaillon ont été déterminés à partir des ajustements rapportés dans les figures 3 et 4 supplémentaires. Les astérisques dans (c, e) indiquent des différences statistiquement significatives. entre différentes conditions d'inhibition du GBTA (p 0,05).
Nous avons également constaté qu'en l'absence de βME, le coefficient de Hill de liaison du GBTA au dimère D112E I127C Hv1 était significativement supérieur à celui mesuré en présence d'agents réducteurs (Fig. 6e et Fig. 4 supplémentaire), ce qui implique que la mutation D112E n'a pas supprimé l'augmentation de la coopérativité de liaison au GBTA résultant de la réticulation de la cystéine 127. Le coefficient de Hill de la liaison du 2GBI aux dimères D112E, I127C Hv1 n'a pas non plus été affecté de manière significative par la mutation D112E (Figure 1).6d et supplémentaire Fig.3).
Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la liaison au GBTA est renforcée par l'interaction entre les extrémités externes des fragments S1 dans les sous-unités Hv1 adjacentes via des interactions électrostatiques attrayantes ou via la formation de liaisons covalentes entre les cystéines substituées. Le couplage allostérique entre les sites augmente et entraîne une coopérativité de liaison. Alors que l’effet des interactions électrostatiques attractives sur la coopérativité peut être aboli par la mutation D112E, l’effet des liaisons covalentes ne le peut pas.
Dans notre exploration de l'espace chimique disponible pour la liaison des dérivés de la guanidine aux canaux Hv1, nous avons constaté que les 2-guanidinothiazoles comme le GBTA ont une dépendance en concentration plus prononcée que les 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). L'analyse du coefficient de Hill de la liaison du GBTA aux deux dimères et monomères (Fig. 2a, b) et au canal dimère dans lequel une sous-unité était pré-liée à l'inhibiteur (Fig. 4) nous ont amenés à conclure que l'inhibition de Hv1 par GBTA L'action est un processus synergique, et les sites de liaison des composés dans les deux sous-unités sont couplés de manière allostérique. La découverte que GBTA se lie au canal ouvert, comme indiqué précédemment pour le composé apparenté 2GBI32, suggère que le couplage allostérique peut être spécifiquement évalué à l'état ouvert. Notre modèle de liaison coopérative a pu décrire quantitativement l'inhibition de Hv1 par GBTA (Fig. 2c) et expliquer les différents effets de 2GBI et GBTA sur la décroissance des courants de queue de canal après repolarisation membranaire, ce qui conforte notre interprétation du processus de liaison.
Le coefficient de Hill maximum pouvant être atteint dans une protéine allostérique avec deux sites de liaison (comme Hv1) est de 2. Nous avons mesuré la GBTA pour lier le type sauvage Hv1 avec un coefficient de 1,31, qui a augmenté à 1,88 dans Hv1 I127C. L'énergie libre synergique, la différence entre les énergies libres de liaison des sites d'affinité la plus basse et la plus élevée (voir Méthodes), était de 1,3 kcal/mole dans le cas du type sauvage Hv1 et de 2,7 kcal/mole dans le cas du Hv1 I127C. de l'oxygène à l'hémoglobine est l'exemple le plus célèbre et le mieux étudié du processus collaboratif38. Pour l'hémoglobine humaine (un tétramère avec quatre sites de liaison allostériquement couplés), le coefficient de Hill varie de 2,5 à 3,0, avec des valeurs allant de 1,26 à 3,64. kcal/mol, en fonction des conditions expérimentales. Ainsi, en termes d'énergétique globale, la coopérativité de la liaison du GBTA à Hv1 n'est pas sensiblement différente de celle de la liaison de l'O2 à l'hémoglobine lorsque l'on considère les différents nombres de sous-unités protéiques dans les deux systèmes.
Dans notre modèle de synergie, la liaison des molécules GBTA à une sous-unité entraîne une augmentation de l'affinité de liaison de la sous-unité adjacente. Nous envisageons un processus dans lequel un réarrangement de l'environnement de liaison résultant du premier événement de liaison (ajustement induit) conduit à changements dans les interactions entre les sous-unités. En réponse à ces changements, les sous-unités adjacentes modifient leurs sites de liaison, ce qui entraîne une liaison plus étroite au GBTA. Au cours de ce processus, l'aspartate S1 D112 est responsable du réarrangement du site de liaison associé à une affinité de liaison accrue. D112 Il a déjà été démontré qu'elle faisait partie de la voie de perméation des protons Hv1 et qu'elle agissait comme un filtre de sélectivité . Nos résultats montrent que les filtres de sélectivité dans les deux sous-unités Hv1 sont couplés allostériquement à l'état ouvert. La figure 7a montre l'emplacement approximatif du site de liaison GBTA et l'emplacement des résidus D112, D123, K125 et I127 sur un schéma du VSD Hv1 basé sur sur la structure cristalline de la chimère Hv1-CiVSP. Les directions suggérées pour le couplage allostérique impliquant l'extrémité extracellulaire de S1 sont indiquées par des flèches noires.
(a) Schéma du VSD Hv1. Sur la base de la structure cristalline de la chimère Hv1-CiVSP, les segments hélicoïdaux sont montrés cylindriques. Dans cette configuration, l'extrémité interne du segment S4 fusionne avec le CCD (non représenté). Les emplacements prévus du GBTA lié sont représentés par des ovales gris. Les flèches noires indiquent les voies impliquées dans le couplage allostérique entre les sites de liaison dans deux sous-unités adjacentes. Les positions des résidus S1 étudiés sont marquées par des sphères colorées. (b) Illustration schématique des sous-unités Hv1 disposées dans deux configurations dimères différentes vues du côté extracellulaire du plan membranaire. Sur le panneau de gauche, l'interface dimère est formée par l'hélice S4. Rotation des deux VSD de 20 degrés dans le sens des aiguilles d'une montre autour d'un axe perpendiculaire au plan membranaire, accompagnée de la séparation des extrémités extérieures des deux hélices S4 (flèches pointillées) produit l'arrangement indiqué à droite. Dans cette configuration, les résidus D123 et I127 des sous-unités adjacentes peuvent se rapprocher. (c) Représentation schématique du CiVSP VSD dans la configuration dimère trouvée dans la structure cristalline 4G80. La position P140 dans CiVSP correspond à la position D123 dans Hv1.
Nos résultats montrent que l'interaction électrostatique répulsive entre le résidu 123 (123D/123D ou 123R/123R) est associée à un niveau « normal » de coopérativité de liaison au GBTA à l'état ouvert et fait passer l'interaction de la répulsion à l'attiré (123D/123R). , une coopération accrue (Fig. 5g). On s'attend à ce que la suppression de l'interaction répulsive avec la substitution de l'alanine conduise également à une coopérativité accrue. Cependant, une diminution de la coopérativité du dimère 123A/123A a été observée (Fig. 5e). L'explication est que l'effet déstabilisant du placement des résidus hydrophobes dans un environnement hydrophile peut l'emporter sur l'effet stabilisant dû à l'élimination des interactions répulsives entre les résidus D123, ce qui entraîne une réduction globale de la coopérativité de liaison. Mony et al.39 ont récemment rapporté que l'accessibilité des solvants à la position D171 de Ciona gutis Ci-Hv1 (correspondant à D123 dans Hv1 humain) est augmentée lors de l'activation, confortant l'idée selon laquelle D123 est situé dans un environnement hydrophile à l'état ouvert.
On sait que le déclenchement des canaux Hv1 se produit via de multiples transitions19,20,26,39,40,41. Qiu et al26 ont découvert que lors de la dépolarisation de la membrane, le capteur de tension de Ci-Hv1 subit un changement de conformation qui laisse le canal activé mais toujours fermé. , suivie d'une transition distincte qui provoque l'ouverture de la conduction des protons dans le trajet des deux sous-unités. Le changement de conformation du capteur de tension a été surveillé par fluorescence à pince de tension, et il a été constaté que la deuxième transition était sélectivement perturbée par la mutation en position D171. La perturbation du signal fluorescent est cohérente avec la présence d'interactions électrostatiques entre les résidus D171 de sous-unités adjacentes à un moment donné le long des coordonnées de réaction du changement conformationnel. Cette interprétation est cohérente avec notre découverte selon laquelle le résidu D123 interagit électrostatiquement à l'état ouvert. et médie le couplage allostérique entre les sites de liaison GBTA.
Fujiwara et al25 ont proposé que l'interface dimère du domaine cytoplasmique en spirale enroulée s'étende dans la membrane pour contenir deux hélices S4 (Fig. 7b, panneau de gauche). Un modèle de cette interaction intersous-unités est basé sur une analyse de réticulation de la cystéine couvrant l'ensemble du VSD et l'analyse fonctionnelle de la région reliant l'hélice S4 et le CCD. En l'absence de gradient de pH transmembranaire, les canaux Hv1 nécessitent une dépolarisation membranaire considérable pour s'ouvrir et la réticulation de la cystéine se produit dans des conditions où le canal est principalement fermé. Par conséquent, l'interface S4-S4 détectée reflète probablement la configuration des sous-unités hors état. D'autres études ont trouvé des preuves de l'implication de S1 et S2 dans les interactions inter-sous-unités pendant le déclenchement17,21,26, suggérant que les canaux peuvent adopter différentes configurations de sous-unités à l'air libre et états fermés, une idée cohérente avec les conclusions de Mony et al. S1 se déplace de 39 pendant le gate.
Ici, nous montrons qu'à l'état ouvert, les extrémités extracellulaires de l'hélice S1 sont suffisamment proches pour supporter les interactions électrostatiques directes qui assurent le couplage allostérique entre les sous-unités. Dans la configuration dimère avec des interactions S4-S4 étendues, les hélices S1 sont trop éloignées. l'une de l'autre pour interagir directement. Cependant, une rotation de 20° dans le sens des aiguilles d'une montre des deux sous-unités VSD autour d'un axe perpendiculaire au plan de la membrane, combinée à la séparation des extrémités extérieures des deux hélices S4, a donné une configuration S1-S1 cohérente. avec nos résultats (Fig. 7b, panneau de droite). Nous recommandons cette configuration pour le canal à l'état ouvert.
Bien que l'on pense que l'enzyme CiVSP fonctionne comme un monomère, la structure cristalline de son VSD isolé est capturée dans un état dimère. Les extrémités extérieures des hélices S1 de ce dimère sont spatialement proches les unes des autres et la configuration globale est similaire à celle proposée. pour Hv1 (Fig. 7c). Dans le dimère CiVSP, le résidu le plus proche de la sous-unité adjacente était la proline en position 140 (Fig. 7c). Fait intéressant, P140 dans CiVSP correspond à la position D123 dans Hv1. La similarité dans la configuration des sous-unités entre Hv1 et les dimères CiVSP suggèrent que les VSD de ces protéines ont une tendance intrinsèque à former une interface où les extrémités extracellulaires de S1 interagissent.
Le rôle essentiel de Hv1 dans l’activation des spermatozoïdes fait de ce canal une cible médicamenteuse intéressante pour le contrôle de la fertilité masculine. De plus, il a été démontré que l’activation de Hv1 dans la microglie aggrave la récupération après un accident vasculaire cérébral ischémique. survie chez les patientes atteintes d'un cancer du sein 12 ou colorectal 13 et on pense qu'il contribue aux tumeurs malignes à cellules B 11. Par conséquent, les médicaments à petites molécules ciblant Hv1 peuvent être utilisés comme agents neuroprotecteurs ou thérapeutiques anticancéreuses. La découverte que les dérivés du guanidinothiazole peuvent induire des réarrangements conformationnels dans le une sous-unité Hv1 ouverte, conduisant à une affinité de liaison accrue, pourrait conduire au développement de médicaments plus puissants ciblant les canaux Hv1.
La mutagenèse dirigée sur le site du Hv1 humain a été réalisée à l'aide de techniques de PCR standard. Dans la construction Hv1NCCiVSP, les résidus 1 à 96 et 228 à 273 de Hv1 ont été remplacés par les résidus 1 à 113 et 240 à 576 de CiVSP18. l'extrémité C-terminale d'une sous-unité est liée à l'extrémité N-terminale de la deuxième sous-unité via le lieur GGSGGSGGSGSGGSGG. Les plasmides pGEMHE contenant les différentes constructions ont été linéarisés avec les enzymes de restriction Nhe1 ou Sph1 (New England Biolabs) et la synthèse d'ARN a été réalisée avec le Kit de transcription T7 mMessage mMachine (Ambion). 1 à 3 jours avant les mesures électrophysiologiques, de l'ARNc a été injecté dans des ovocytes de Xenopus (50 nl par cellule, 0,3 à 1,5 μg/μl). Des ovocytes de stade V et VI de Xenopus laevis (NASCO) ont été obtenus d'Ecocyte Bioscience. Après l'injection d'ARN, les cellules ont été maintenues dans un milieu ND96 contenant 96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl, 1 mM de MgCl, 10 mM de HEPES, 5 mM de pyruvate, 100 µg/ml de gentamicine, pH 7,2 à 18 °C. .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole[2], (4-méthyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -méthyl-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], éthyl 2-guanidino-5-méthyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], éthyl 2-guanidino-4- méthyl-1,3-thiazole- Le 5-carboxylate [9] et l'acétate de (2-guanidino-4-méthyl-1,3-thiazol-5-yl)éthyle [10] provenaient de Sigma-Aldrich. La famotidine [7] provenait de MP Biomedicals.1-[4 -(4-chlorophényl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] et 1-[4-(3,4-diméthoxyphényl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine [12] de Matrix Scientific. Ces composés sont de la plus haute pureté disponible dans le commerce. Ils ont été dissous dans du DMSO sec pour générer une solution mère à 100 mM, qui a ensuite été diluée dans la solution d'enregistrement à la concentration finale souhaitée. Les composés 3 et 4 ont été synthétisés ci-dessous avec au moins 99 % de pureté.
À une suspension de chlorhydrate de 2-amino-4-(trifluorométhyl)benzènethiol (1,02 g, 4,5 mmol) dans 25 ml d'acide chlorhydrique aqueux (2,5 N), on a ajouté du dicyandiamide solide (380 mg, 4,5 mmol), et le mélange hétérogène résultant Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et neutralisé par ajout progressif de potasse 10N. Le précipité blanc formé a été filtré, lavé à l'eau froide (3 x 50 ml), séché à l'étuve ( 65 °C) pendant plusieurs heures, puis recristallisé dans de l'acétate d'éthyle/éther de pétrole pour donner un solide blanc (500 mg, 48 %) ; mp 221-222 °C (lumière 225-226 °C) 45 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) : δ [ppm] = 7,25 (s très large, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz). RMN 13C (200 MHz, DMSO-d6) : δ = 114,2 (d, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Hz), 126,1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.HRMS (ESI) : valeur calculée m/z. Pour C9H8F3N4S (M + H)+ : 261,0416, trouvé : 261.0419.
La naphto[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), synthétisée comme décrit précédemment, a été chauffée à 200 °C dans un bain d'huile dans un petit tube à essai. 300 mg (large excès) de cyanamide et 1,0 ml concentré. Au composé chaud, on a ajouté rapidement de l'acide chlorhydrique et le mélange a été maintenu dans le bain d'huile pendant environ 2 minutes, période pendant laquelle la majeure partie de l'eau s'est évaporée. Le mélange réactionnel a ensuite été refroidi à température ambiante et le matériau solidifié résultant a été brisé en petits morceaux et lavé avec de l'eau pour donner un solide amorphe jaune pâle. (38 mg, 10 %), point de fusion 246-250 °C ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, D2O) : δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 H, J = 8,3 Hz). RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) : δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1. HRMS (ESI) : valeur calculée m/z. Pour C12H11N4S (M + H)+ : 243,0699 , trouvé : 243.0704.
Les courants protoniques ont été mesurés dans des patchs internes et externes d'ovocytes exprimant différentes constructions à l'aide d'un amplificateur Axopatch 200B contrôlé par un Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) avec le logiciel pClamp10. Les solutions intracellulaires et extracellulaires ont la même composition : 100 mM 2-(N-morpholino )acide éthanesulfonique (MES), mésylate de tétraéthylammonium (TEA) 30 mM, chlorure de TEA 5 mM, acide éthylène glycol-bis (2-aminoéthyl) -N, N, N', N'-tétraacétique (EGTA) 5 mM, ajusté à pH 6,0 avec de l'hydroxyde de TEA. Toutes les mesures ont été effectuées à 22 ± 2 °C. La pipette a une résistance d'accès de 1,5 à 4 MΩ. Les traces de courant ont été filtrées à 1 kHz, échantillonnées à 5 kHz et analysées avec Clampfit10.2 (Molecular Devices ) et Origin8.1 (OriginLab).
Des solutions contenant diverses concentrations d'inhibiteur de Hv1 et dans certains cas 10 mM de βME ont été introduites dans le bain par gravité via un collecteur connecté à un système de valve de perfusion VC-6 (Warner Instr.), qui a été transmis via le logiciel pClamp TTL (Transistor- Transistor Logic). Des expériences de perfusion rapide ont été réalisées à l'aide d'un crayon de perfusion multitube (AutoMate Sci.) Avec un embout d'administration de 360 μm de diamètre monté devant une pipette de patch. L'inhibition du canal a été déterminée par des mesures ampérométriques isochrones à la fin du Impulsion dépolarisante de +120 mV. Les mesures GV ont été effectuées comme décrit précédemment 18,20. Les courants de queue ont été enregistrés à -40 mV après les étapes de dépolarisation à différentes tensions de -20 mV à +120 mV, sauf indication contraire. L'impulsion de référence précédant l'impulsion de test est utilisé pour corriger la décroissance du courant 18. Le graphique GV correspond à l'équation de Boltzmann :
Les constantes de dissociation apparentes (Kd) pour différentes combinaisons de canaux et d'inhibiteurs (tableau supplémentaire 1) ont été déterminées en ajustant la dépendance à la concentration de l'inhibition (valeurs moyennes% d'inhibition) avec l'équation de Hill :
où [I] est la concentration de l'inhibiteur I et h est le coefficient de Hill. Pour calculer le coefficient de Hill, l'équation (2) est réorganisée comme suit :
Heure de publication : 07 juin 2022
