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O le Hv1 voltage-gated proton channel o se faʻalavelave faʻapitoa e aofia ai vaega e lua e faʻalogoina voltage (VSDs), o ia mea taʻitasi o loʻo i ai se auala faʻaogaina o le proton gated.Dimerization e pulea e le cytoplasmic coiled-coil domain.The transition from the closed state to o le tulaga tatala i VSD uma e lua ua iloa e tupu faʻatasi; ae ui i lea, e itiiti se mea e iloa e uiga i faiga faʻavae. O fesoʻotaʻiga Intersubunit o loʻo i ai se sao taua i faʻagasologa allosteric; ae ui i lea, o ia fesoʻotaʻiga e leʻi faʻaalia i le avanoa Hv1 alalaupapa. O iinei matou te faʻaalia ai o 2-guanidinothiazole derivatives poloka le lua Hv1 VSDs i se faiga felagolagomai ma faʻaoga se tasi o nei mea faʻapipiʻi e fai ma suʻesuʻega mo fesoʻotaʻiga allosteric i le va o subunits tatala. fa'ai'uga o le vaega muamua o le transmembrane o le VSD o lo'o fausia ai se feso'ota'iga intersubunit e fa'afeso'ota'i feso'ota'iga i le va o nofoaga fa'apipi'i, a'o le vaega fa'apipi'i-coil e le'o fa'a'afia sa'o i lenei faiga. .
O ala tetele o le proton e ta'alo ai le malosi i le tele o meaola, mai le phytoplankton i tagata. o le Hv1, o le oloa o le HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) ua faʻaalia e faia se sao i le B cell proliferation4, gaosiga o ituaiga okesene reactive e le innate immune system5,6,7,8, sperm cell gaio'i9 ma le pH fa'atonutonu ole sua i luga ole ea10. O lenei auala o loʻo aʻafia i le tele o le Overexpressed i ituaiga kanesa e pei ole B-cell malignancies4,11 ma le susu ma le colorectal cancers12,13. O le tele o gaioiga Hv1 na maua e faʻateleina ai le gafatia o le kanesa o sela 11, 12 .I le faiʻai, Hv1 ua faʻaalia. e microglia, ma o lana gaioiga ua faʻaalia e faʻateleina ai le faʻaleagaina o le faiʻai i faʻataʻitaʻiga o le ischemic stroke.
O le polotini Hv1 o loʻo i ai se vaega o le voltage-sensing domain (VSD), lea e aofia ai vaega e fa o le transmembrane e taʻua o le S1 i le S414. O le VSD e foliga tutusa ma vaega tutusa o laina eletise Na +, K + ma Ca2 + ma phosphatases e maaleale voltage, e pei o le CiVSP mai. Ciona gutis15.I totonu o nei isi polotini, o le C-terminus o le S4 o loʻo faʻapipiʻiina i se module effector, o le pore domain poʻo le enzyme. .O le alalaupapa o se lavelave dimeric e aofia ai VSDs e lua, o loʻo i ai i latou taʻitasi se gated proton permeation pathway16,17,18. O nei lua Hv1 subunits na maua e tatala faʻatasi19,20,21,22, faʻapea o loʻo taʻalo fesoʻotaʻiga allosteric ma inter-subunit fegalegaleaiga. o se matafaioi taua i le gating process.O le fesoʻotaʻiga i le va o subunits i totonu o le coil coil domain o loʻo faʻamalamalamaina lelei ona o fausaga tioata o vaega tuʻufua e lua o loʻo avanoa22,23. I le isi itu, o le fesoʻotaʻiga i le va o VSD i totonu o le membrane e le o malamalama lelei.O le fausaga tioata o le Hv1-CiVSP chimeric protein e le maua ai faʻamatalaga e uiga i lenei atinaʻe, ona o le faʻatulagaina o trimeric o le faʻalavelave faʻapipiʻi tioata e mafai ona mafua mai i le suia o le Hv1 CCD masani e le fefete leucine zipper GCN424.
O se suʻesuʻega talu ai nei o le faʻalapotopotoga faʻavae o le Hv1 channel na faʻauʻuina e lua S4 helices suiga i le CCD e aunoa ma se faʻalavelave matuia o le fausaga lona lua, e mafua ai le umi o helices e amata mai le membrane ma le poloketi i totonu o le cytoplasm. O lenei suʻesuʻega o loʻo faʻamoemoeina e faʻafesoʻotaʻi e Hv1 VSD le tasi i le isi i luga o le vaega S4. Ae ui i lea, o isi suʻesuʻega ua faʻatulagaina isi fesoʻotaʻiga i le va o VSDs. O taunuuga o nei suʻesuʻega o le fesoʻotaʻiga faʻatasi i le va o VSD na suʻesuʻeina e faʻatatau i le gating process, lea e faʻalagolago i le tapunia ma le tatalaina o setete, ma o le fesoʻotaʻiga i le va o VSD e mafai ona fesuisuiai i suiga eseese o setete i le faʻatulagaina.
O iinei, na matou iloa ai o le 2-guanidinothiazole e taofia ai le Hv1 e ala i le fusia faʻatasi i VSD tatala e lua, ma faʻaaogaina se tasi o mea faʻapipiʻi, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), e suʻesuʻe le fegalegaleaiga i le va o subunits i le tulaga tatala. Na matou iloa e mafai ona faʻamatalaina lelei le puʻupuʻu o le GBTA e se faʻataʻitaʻiga quantitative lea o le fusifusia o se inhibitor i le tasi subunit e mafua ai le faateleina o le fusifusia affinity o le pito i tua. auala 27, 28 ma se vaega o le nofoaga o loʻo fusifusia ai le guanidine 29 pulea GBTA fusifusia felagolagomaʻi. Matou te faʻaalia o loʻo tumau pea le fusia faʻatasi i le Hv1 dimer, lea e vavae ese ai le CCD mai le vaega S4, e fautua mai ai e le saʻo le fesoʻotaʻiga intersubunit i le CCD. fa'afeso'ota'i feso'ota'iga allosteric i le va o nofoaga e fusifusia ai GBTA. I se fa'afeagai, matou te iloa o le vaega S1 o se vaega o le feso'ota'iga i le va o subunits ma fa'atūina se fa'atulagaga o VSDs fa'atasi ma le pito extracellular o le S4 helix ese mai le ogatotonu o le dimer e fa'ataga ai. le vaega S1 ia i le tulaga tatala.
O mea laiti mole mole inhibitors o le Hv1 e aoga e avea ma vailaʻau faʻamaʻi ma vailaʻau neuroprotective. Ae ui i lea, e oʻo mai i le taimi nei, o nai mea faʻapipiʻi na mafai ona faʻalavelaveina le alalaupapa30,31,32,33. Faatasi ai ma i latou, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, faʻapipiʻi [1] i le Fig .1a) ma ana mea na maua e poloka ai le VSD29,32 faʻapipiʻiina o protons e ala i le alalaupapa. O le fusifusia o ia mea faʻapipiʻi e manatu e tupu tutoʻatasi i vaega tatala e lua.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, faʻapipiʻi [2] i le Ata 1a) sa na faʻaalia muamua e faʻalavelaveina le Hv1 toetoe lava a tutusa lelei ma le 2GBI pe a faʻataʻitaʻiina i se faʻatonuga o le 200 μM (Ata 1b) . Na matou suʻesuʻeina isi mea e maua mai i le thiazole ma maua ai o nisi oi latou na faʻalavelaveina le auala e tutusa pe sili atu le malosi nai lo le GBTA (Fig. 1 ma le Faʻaopoopo. tusitusiga) . Na matou fuafuaina le faʻatonuga o tali o le fa thiazole derivatives (GBTA ma faʻapipiʻi [3], [6] ma [11], Ata 1c) ma maua ai e sili atu le maualuga nai lo le 2GBI. The Hill coefficients (h) o mea e maua mai i le thiazole mai le 1.109 ± 0.040 i le 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c ma Ata Faaopoopo. 1). I se eseesega, o le Hill coefficient mo 2GBI o le 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a ma le Fig Faaopoopo 1). O le Hill coefficient i luga aʻe o le 1 o loʻo faʻaalia ai le galulue faʻatasi. nofoaga fusifusia, 29,32 matou te manatu o le fusifusia o le thiazole e maua mai i le tasi subunit e mafai ona faʻaleleia ai le fusifusia o se mole mole inhibitor lona lua i le pito i tua. GBTA o le suʻega suʻega ma le maualuga maualuga o Hill coefficient. O le mea lea, na matou filifilia ai lenei tuufaatasiga e suʻesuʻe atili le faʻaogaina o le fesoʻotaʻiga faʻatasi ma faʻaaogaina le 2GBI e fai ma faʻamatalaga le lelei.
(a) Su'ega su'ega: [1] Fa'asinomaga Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10] ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Fa'asaina le gaioiga a le tagata Hv1 e le guanidinothiazoles ua fa'aalia ma le fa'aogaina o le 2GBI (lanu lanumoana-lanumeamata) .Hv1 proton currents na fuaina i totonu-i fafo plaques o Xenopus oocytes i le tali atu i le depolarization mai se gafatia umia o le -80 mV i + 120 mV. Sa faaopoopo inhibitor taitasi i le taele i se concentration o 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .O fa'amaumauga o lona uiga ± SEM (n≥4).(c) Fa'asalaina fa'atatau o le tagata Hv1 e ala i mea fa'apipi'i [2], [3], [6] ma le [11]. O togi ta'itasi o lo'o fa'atusalia ai le uiga fa'asaina ± SD o le 3. i le 15 fua. O le laina o le Hill fit na faʻaaogaina e maua ai le Kd faʻamaonia o loʻo lipotia i le Laulau Faʻaopoopo 1. O faʻamaufaʻailoga a Hill na faʻamoemoeina mai le fetaui o loʻo lipotia i le Faʻaopoopoga Ata 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (silasila i Metotia).
(a,b) Fa'aputuga 2GBI ma GBTA taofia dimeric ma monomeric Hv1 i se fa'atonuga fa'atatau. O vaega ta'itasi o lo'o fa'atusalia ai le uiga fa'asaina ± SD o le 3 i le 8 fua ma o le pi'o o se Hill fetaui. o faʻasologa faʻapipiʻi na faʻamoemoeina mai le fetaui o loʻo lipotia mai i le Faʻamatalaga Faʻaopoopo 3 ma le 4. O le tali faʻatonuga o le GBTA o loʻo faʻaalia i le (a) e tutusa ma le ata 1c. Vaʻai Faʻamatalaga Faʻaopoopo 1 mo faʻamatalaga Kd. (c) Faʻataʻitaʻiga o le o le fusia faʻatasi o le GBTA i le dimeric Hv1. O le laina uliuli mautu e fai ma sui o le fetaui i faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga e ala i le faʻatusa (6), o loʻo faʻamatalaina ai le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaalia i le (d). - fa'a'ese'esega fa'atutusa pupuni o mea fa'atasi muamua ma lona lua, fa'asologa (Sub 1: OO + B ⇄ BO *, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO * + B ⇄ B * O *, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o le masini fa'atulagaina o le poloka Hv1. I le tulaga o le GBTA, o le fusia i le tasi vaega tatala e fa'apupulaina ai le so'otaga o le va'aiga tatala lata ane (Kd2
Ina ia faʻamatalaina faʻatusatusaina le faʻaogaina o le GBTA i le alalaupapa, matou te faʻaogaina se faʻataʻitaʻiga lea e mafai ai e soʻo se subunit ona fusifusia le mole mole inhibitor muamua pe a maeʻa se tali bimolecular faʻatasi ai ma se faʻasalalauga tumau Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO + B ⇆ BO * ). O le fusifusia e mafua ai ona faʻaaogaina e le alalaupapa se tulaga e fusifusia ai vaega laiti gaogao o loʻo totoe i le iniseti pe a maeʻa se tali faʻapitoa bimolecular faʻatasi ai ma se Kd2 faʻatasi, lea Kd2
O le laina uliuli mautu i le Ata 2c o le fetaui lelei lea o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga i le faʻataʻitaʻiga faʻatonuga-tali curve, e maua ai le Kd1 o le ~ 290 μM ma le Kd2 o le ~ 29 μM (Methods section, equation (6)) . o le fusifusia o le 2GBI, lea Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). I le monomeric Hv1, e na o le tasi le nofoaga faʻapipiʻi ma le tasi Kdm (O ° + B ⇆ B °). I le tulaga o le GBTA, Kdm e tusa ma le 54. μM, lea e sili atu ona tutusa ma Kd1 nai lo Kd2 (Fig. 2d). I se isi faaupuga, o le nofoaga fusifusia o le monomer o loʻo i totonu o se faʻatulagaga (O °) e sili atu ona tutusa ma le tulaga maualuga-affinity (BO *) nai lo le maualalo- tulaga vavalalata (OO) o le dimer, e foliga mai ona o le faʻaumatiaina o le fesoʻotaʻiga i le va o vaega laiti.
E pei ona faʻaalia muamua mo le 2GBI32, na matou iloa ai o le GBTA na te taofiofia le Hv1 e ala i le polokaina o le alalaupapa pe a matala nai lo le faʻafaigata ona tatala (Faʻaopoopo Ata 2a,b,d).2GBI ua lauiloa foi e faʻaoso lemu le pala siʻusiʻu galu. i le tali atu i le repolarization membrane, ae o lenei tulaga e le o matauina i le GBTA (Faaopoopo Ata 2c). I le i ai o le Hv1 inactivation i luma o le 2GBI, e le mafai ona tapunia faitotoa i vaega taitasi seia oo ina tuua e le tagata poloka le nofoaga fusifusia (le ". vae faitotoa” masini), ma le 2GBI tatala lemu nai lo le tapunia o faitotoa. Afai o le tasi Hv1 subunit ua tatalaina ma tapunia, ae o le vaega pito i tua e tumau poloka, unbinding o totoe 2GBI molelaula avea lemu (pupuni poloka). e na'o le tasi le vaega o lo'o poloka e fa'atino fa'apolotoni mo sina taimi a'o le'i tapuni ma faia se sao taua i le fa'asolosolo malie o le si'usi'u.
O le mauaina o le pala o le siʻusiʻu o le Hv1 e leʻi faʻagesegese tele i luma o le GBTA (Faʻaopoopo Ata 2c) e ogatasi ma se faiga faʻapipiʻi faʻatasi mo lenei poloka (Fig. 2d). , O le vavalalata o le poloka i le vaega pito lata ane e pa'ū pe a ma le 10-fold, e fiafia i le faʻaogaina o le faagasologa. e na'o le tasi le vaega poloka poloka e fa'amoemoe e sili atu le tele i le i ai o le GBTA nai lo le i ai o le 2GBI, e mafua ai le fa'asolosolo vave o le si'usi'u.
Ina ia mafai e le GBTA ona fusifusia faʻatasi ma vaega laiti Hv1 e lua, e tatau ona tuʻufaʻatasia nofoaga faʻapipiʻi. E tatau ona mafai e nofoaga taʻitasi taʻitasi ona: 1) faʻaosoina se faasologa o mea tutupu e fesoʻotaʻi ma vaega laiti lata ane e fusifusia i le inhibitor, ma 2) faʻatalanoaina le suiga mai le maualalo-affinity i le maualuga-affinity binding.We manatu e faapea afai o totoe patino i totonu o le nofoaga fusia saofagā i le faagasologa felagolagomai, o latou mutation e tatau ona suia ai le Hill coefficient o le curve concentration-tali o GBTA inhibition o Hv1.Residues D112, F150. , S181 ma R211 na faʻaalia muamua o se vaega o le 2GBI29 faʻapipiʻi siosiomaga ma matou manatu o le a faapena foi ona latou aafia i le GBTA fusifusia (Fig. 3A). , ma le R211S (Ata 3) ma faʻatusatusa a latou Hill coefficients i latou o le Hv1 wild-type, faʻaaogaina le 2GBI e fai ma faʻamatalaga. O totoe V109 o loʻo i luga o foliga tutusa o le S1 vaega e pei o le D112 ma e tasi le faʻaopoopoga helical liliu i totonu o le cell. V109 e leʻi aʻafia i le fusia o le 2GBI29, matou te faʻaaogaina le V109A mutant e fai ma pule (Fig. 3b).
(a) Fautuaga Hv1 toega o loʻo aʻafia i le guanidine derivative fusifusia. O pupuni lanu moana vaʻavaʻai o loʻo siʻosiʻomia ai filifili itu na fuafuaina muamua e fegalegaleai ma vaega eseese o le 2GBI29 (bf). mūmū pogisa). O vaega ta'itasi o lo'o fa'atusalia ai le uiga fa'atapula'aina o le 3 i le 12 fua ± SD V109 e fai ma fa'atonuga le lelei. O Pi'o o Mauga e fetaui lelei ma fa'aoga e maua ai tau Kd (silasila i le Laulau Fa'aopoopo 1). o fa'amaufa'ailoga fa'apipi'i na fa'amauina mai fa'atatau o lo'o lipotia mai i le Fa'aopoopo Figs 3 ma le 4. Fa'asinoga h tau mo Hv1 WT o lo'o fa'aalia e pei o laina va'ava'ai. Fa'ailoga fa'ailoga e fa'ailoa mai ai le tele o eseesega i le va o mutant ma WT (p Na matou iloa o le suiga o le D112E na matua faʻaitiitia ai le maualuga o le Hill (p O le mauaina o le Hill coefficient mo GBTA fusia e maualuga atu nai lo le 1 i le Hv1 dimer ma avea ma ~ 1 i le monomeric channel (Fig. 2b) e ogatasi ma le i ai o fegalegaleaiga allosteric i le va o nofoaga fusifusia i vaega laiti e lua. o le mataupu, o le Hill coefficient o GBTA fusifusia i le dimer lea ua noatia le blocker i le tasi subunit e tatau ona ~ 1. Matou tofotofoina lenei vavalo i le Hv1 F150A-WT fesootai dimer (Fig. 4a), lea o le sootaga o le F150A. subunit mo GBTA na sili atu nai lo le 2 poloaiga o le maualuga maualuga atu nai lo le vaega o le WT (Fig. 1c ma le 3d). Ona matou fuaina lea o le faʻatonuga-tali curves mo le faʻasaina o le vaega o le WT i le faʻaogaina o le 2 μM GBTA. , o le poloka poloka e faʻamoemoe e fusifusia pe tusa ma le 99% o le F150A subunit ma (a) Fuafuaga ata o le F150A-WT junction dimer na fa'aaogaina e fa'atupu ai le poloka poloka ({F150A}b-WT/BAO*). o le sootaga o le vaega laiti F150A e tatau ona maualuga atu nai lo le vaega o le WT.(b) Proton au mai ala F150A-WT fuaina i le tali atu i suiga i le membrane gafatia mai le -80 mV i le +120 mV.pHi = pHo = 6.0 .Grey traces e fai ma sui o galu e fuaina i le leai o se inhibitor.O le lanu uliuli (pulea) o loʻo faʻatusalia le fuaina o loʻo i ai nei pe a maeʻa le faʻaopoopoga o le 2 μM GBTA. I lenei faʻatonuga, o le vaega o le WT e leʻi faʻalavelaveina tele, ae o le F150A subunit o loʻo fusia toetoe lava atoa i le GBTA ({F150A}b-WT).O le fa'atuputeleina atili o le GBTA na mafua ai ona poloka le vaega o le WT (lanu moli ma le mumu). F150A subunit).O togi ta'itasi o lo'o fa'atusalia ai le uiga fa'asaina ± SD o le 3 i le 7 fua. O pupuni sa fa'aogaina ma'ele'ele e maua mai ai fa'atatau Kd o lo'o lipotia mai i le Laulau Fa'aopoopo 1. O fa'aputuga o Mauga o lo'o fa'aalia i totonu o fa'asologa o fa'asologa na fa'amauina mai fetaui o lo'o lipotia mai i le Fa'aopoopo Figs 3 ma le 4. O tau o le Hv1 WT e o lo'o fa'aalia e pei o laina va'ava'ai. Fa'ailoga fa'ailoga e fa'ailoa mai ai le tele o fa'amaumauga fa'atusatusa i le WT dimer Hv1 (p Talu ai o le GBTA inhibition o le Hv1 na fuaina i le avanoa tatala, na matou manatu ai e mafai ona faʻaogaina le galulue faʻatasi o le GBTA e suʻesuʻe ai le faiga o fesoʻotaʻiga intersubunit i le setete tatala. 22 ma le fesoʻotaʻiga intersubunit o loʻo aʻafia i le gating na faʻatulagaina e faʻatalanoaina e le cytoplasmic coiled-coil domain (CCD) 22, 25. O le mea lea, na matou fesili ai pe o loʻo aʻafia foi le CCD i le faʻaogaina i le va o nofoaga faʻapipiʻi GBTA i le tulaga tatala.Triglycine suiga i le fesoʻotaʻiga i le va o le S4 transmembrane fragment ma le coiled-coil domain na faʻaalia i suʻesuʻega muamua e faʻaumatia ai lenei vaega mai le isi vaega o le alalaupapa aʻo tumau pea le faʻamaoni o le dimerization. .5a, GGG mutant) i luga o le GBTA binding cooperativity. Na matou maua se faʻaitiitiga faʻafuainumera (p> 0.05) faʻaititia i le Hill coefficient o le GBTA fusifusia i GGG faʻatusatusa i le ituaiga vao (Fig. 5c), faʻapea e ui lava i lana matafaioi i le tausia o le lua vaega laiti fa'atasi e taua, ae e le fa'afeso'ota'i sa'o e le CCD le feso'ota'iga va'ava'a fa'atasi i le va o nofoaga fa'apipi'i GBTA.
(a) Fuafuaga ata o le Hv1 dimer faatasi ai ma se suiga o le triglycine i le pito i totonu o le S4 ua fuafuaina e faʻalavelaveina le fesoʻotaʻiga intersubunit faʻatalanoaina e le cytoplasmic coiled-coil domain (aū lanumoana). fa'aalia suiga, fuafuaina e fa'ata'ita'i vaega S1 o lo'o a'afia i le so'otaga i le va o subunits (au lanumoana).(c-h) 2GBI (cyan) ma le GBTA (mumu uliuli) fa'alavelaveina faufale fa'aalia i se fa'atonuga fa'atatau. ± SD o le 3 i le 10 fua. O le pi'o o se Mauga e fetaui lelei e maua ai tau Kd (silasila i le Laulau Faaopoopo 1). O fa'atusatusaga o Maupu'epu'e i histograms interpolated na fuafuaina e pei ona fa'amatalaina i le vaega o Metotia (silasila Fa'aopoopo Ata 3 ma le 4). Hv1 WT o lo'o fa'aalia e pei o laina va'ava'ai. O fa'ailoga o lo'o fa'ailoa mai ai le tele o fa'amaumauga i le va o mutant ma le WT (p Talu ai na matou faʻateʻaina le CCD e avea o se puluvaga tuusaʻo o le GBTA felagolagomai faʻatasi, matou te fesili pe o fegalegaleaiga i le va o VSD o loʻo aʻafia i fesoʻotaʻiga allosteric i le va o nofoaga faʻapipiʻi. i le vaega S1 transmembrane.S1 o loʻo i ai isi toega leaga e lua, E119 ma le D123, o loʻo i luga o le itu lava e tasi o le helix e pei o le D112, ae latalata i le pito i fafo 24 o le vaega. i le D112 e ala i laina vai36,37. O lea, na matou suʻeina pe o E119 ma D123 o loʻo aʻafia i le fesoʻotaʻiga allosteric i le va o nofoaga faʻapipiʻi GBTA (Fig. 5b). ae i le isi itu o le S1 helix (Ata. 5b).
Na matou fuaina le faʻaogaina o le faʻaogaina o le E119A, D123A ma le K125A e ala i le 2GBI ma le GBTA ma iloa ai o suiga ole E119A ma le K125A e leʻi suia tele ai le maualuga o le Hill coefficient o le inhibitor pe a faʻatusatusa i le ituaiga vao (p> 0.05, Ata 5d, i). ). I le isi itu, o le suiga o le D123A na faʻaitiitia ai le maualuga o le Hill coefficient o GBTA (p 0.05/14).
Talu ai o le faʻaitiitia o le moliaga i le tulaga 123 i luga o vaega laiti uma e lua na mafua ai se suiga malosi i le GBTA fusifusia felagolagomai, aʻo fesuiaʻi le moliaga i luga o vaega laiti e lua na na o sina aafiaga itiiti, na matou faʻalauteleina le auʻiliʻiliga e aofia ai naʻo le tasi le vaega faʻatasi ma le inversion channel of charge.We fa'atupuina le Hv1-linked dimers ma le D123R suitulaga i le C-terminal subunit (Fig. 5b) ma fuaina le fa'atonuga-tali fa'asaina e le GBTA ma le 2GBI. Na matou iloa ai o le Hill coefficient o le GBTA o lo'o fusifusia i laina WT-D123R na matua maualuga atu nai lo lena. o le vao-ituaiga Hv1 (p Na matou iloa foi o le suiga o le D112E na soloia ai le faateleina o le GBTA-binding Hill coefficient na gaosia e le WT-D123R background (Fig. 5b, h ma le Fig. 4 Faaopoopo). O le aafiaga i luga o le Hill coefficient o le 2GBI binding na faʻaumatia foi ( Ata 5h ma le Fa'aopoopo Ata 3). O nei su'esu'ega o lo'o fautua mai ai o le fa'aleleia atili o feso'ota'iga i le va o vaega laiti e mafua mai i moliaga fa'afeagai i le tulaga 123 e le fa'aliliuina i le galulue fa'atasi malosi pe a fa'alavelaveina le nofoaga fa'amau i le tulaga D112.
Na matou manatu pe afai o le D123 toega i luga o vaega tatala lata ane e latalata i le electrostatically fegalegaleai ma le tasi ma le isi, o le a liua le fegalegaleai tetee i le va o tau le lelei i se tuufaatasiga o le lelei ma le lelei tau e ala i le suia o le aspartic acid i arginine. fegalegaleaiga faatosina i le va oi latou.One subunit (WT-D123R dimer) .O fegalegaleaiga faatosina e mafai ona faʻamalosia le faʻaogaina i le va o pito pito i fafo o le vaega S1, e taʻitaʻia ai le faʻaogaina o le allosteric malosi i le va o subunits ma faʻateleina le galulue faʻatasi o le GBTA.
Ina ia lagolagoina lenei manatu, matou te sailia se auala e faʻamalosia ai le fesoʻotaʻiga i le va o pito pito i fafo o le vaega S1, lea e ese mai le fesuiaiga o moliaga i le tulaga 123. Lee et al. Na maua muamua le suiga o le Hv1 totoe I127 i le cysteine e mafua ai le tuusao o le intersubunit cross-linking17. E le gata i lea, o le fausaga tioata o le Hv1-CiVSP chimeric VSD na faʻaalia ai o le I127 e vavae ese mai le pito i fafo o le S1 helix e naʻo le tasi le residue24. O lea na matou fesili ai pe o le faʻavaeina o se fusi faʻatasi i le va. cysteinees i le tulaga 127, lea e faʻamoemoe e maua ai se fesoʻotaʻiga malosi S1-S1, e iai se aʻafiaga i le galulue faʻatasi o le GBTA e tutusa ma le matauina e ala i le suia o le tau ile tulaga 123.
Na matou fuaina le faʻaogaina o le faʻaogaina o le Hv1 I127C e le GBTA ma le 2GBI i le i ai ma le leai o le 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fig 6a). I le taimi lava e tasi e faʻaopoopoina ai le inhibitor i le intracellular solution, o le faʻaitiitia ua faaopoopo le sui sooupu i le vaifofo extracellular.O se dimer fesootai ma le cysteine sustitution i na o le tasi subunit (WT-I127C) sa faaaogaina e avea o se pulea le lelei (Fig. 6a). Sa le mafai ona matou fuaina so o se aafiaga o le tuusao intersubunit cross-sootai. i le va o le I127C subunits i luga o le 2GBI inhibition, aua o le Hill coefficient mo I127C o loʻo fusifusia i le Hv1, faʻatasi ai ma le leai foi o le βME, sa matua ese lava mai lena mo le fusia i monocysteine dimers suitulaga. E le mafai e le Hill coefficient ona vaʻaia le WT-I127C (Fig. 6b ma le Faʻaopoopo Fig. 3). I se eseesega tele, na matou fuaina le aafiaga tele o le faʻaogaina o fesoʻotaʻiga vavalalata i luga ole GBTA inhibition.O le Hill coefficient mo le fusia i le Hv1 I127C i le leai o βME (crosslink on) e sili atu le maualuga nai lo le fuaina i le i ai o le βME (crosslink off) poʻo le faʻaaogaina o le WT-127C e faʻafesoʻotaʻi ai le dimer (i le leai o se faʻamaufaʻailoga) (Fig. 6c ma le Faʻaopoopo Fig. 4), e faʻaalia ai o le fesoʻotaʻiga allosteric. i le va o nofoaga fusifusia e matua faʻaleleia atili e ala i le faʻavaeina o fusi o le disulfide i le va o pito pito i fafo o le vaega S1. O nei taunuuga e lagolagoina ai la tatou faʻamatalaga o le faʻaogaina o le eletise eletise o le aspartate ma le arginine i le tulaga 123 i le WT-D123R dimer e mafua ai le faʻateleina o fesoʻotaʻiga allosteric i le va. o vaega laiti.
O fesoʻotaʻiga tatala-setete e faʻatalanoaina e ala i fegalegaleaiga faʻaletino tuusaʻo i le va o pito pito i fafo o le vaega S1 i vaega laiti e lua.
(a) Fa'ata'ita'iga fa'atusa o mutant Hv1 dimers ma linker dimers, ua fuafuaina e su'esu'e pe fa'afefea ona a'afia le feso'ota'iga fa'atasi o le cysteine i le GBTA. e) i le i ai poʻo le leai o le 10 mM βME i le extracellular solution.O vaega taʻitasi o loʻo faʻatusalia ai le uiga faʻasaina ± SD o 3 i 10 fua. O le pi'o o se Mauga e fetaui lelei e maua ai Kd tau (silasila i le Laulau Fa'aopoopo 1). O fa'amaufa'ailoga maupu'epu'e i totonu o fa'asologa o fa'asologa na fa'amauina mai le fetaui o lo'o lipotia mai i Fa'amatalaga Fa'aopoopo 3 ma le 4. Fa'ailoga i le (c,e) fa'ailoa mai ai se eseesega taua tele. i le va o tulaga faʻalavelave GBTA eseese (p 0.05).
Na matou iloa foi i le leai o se βME, o le Hill coefficient o le GBTA o loʻo fusifusia i le D112E I127C Hv1 dimer na sili atu le maualuga nai lo le fuaina i le i ai o sui faʻaitiitia (Fig. 6e ma Faʻamatalaga Faʻaopoopo. 4), faʻaalia o le D112E mutation e le'i soloia le si'itia o le felagolagoma'i o le GBTA e mafua mai i le feso'ota'iga o le cysteine 127. O le maualuga o le Hill o le 2GBI o lo'o fusifusia i le D112E, I127C Hv1 dimers e le'i matua'i afaina fo'i i le suiga o le D112E (Ata 1).6d ma le Fa'aopoopo. Ata 3).
Faʻatasi, o nei suʻesuʻega o loʻo fautua mai ai e faʻaleleia le fusifusia o le GBTA e ala i le fegalegaleaiga i le va o pito pito i fafo o vaega o le S1 i pito i lalo o le Hv1 e ala i fesoʻotaʻiga eletise eletise poʻo le faʻavaeina o soʻotaga i le va o cysteines sui. E ui e mafai ona faʻaumatia le aʻafiaga o fesoʻotaʻiga eletise eletise i luga o le galulue faʻatasi e ala i suiga D112E, e le mafai e le aʻafiaga o fusi faʻatasi.
I la matou suʻesuʻega o le vailaʻau avanoa avanoa mo le fusifusia o mea e maua mai i le Hv1, na matou iloa ai o 2-guanidinothiazoles pei o le GBTA o loʻo i ai le faʻalagolago i le maualuga o le faʻalagolago nai lo le 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). ma monomeric channels (Fig. 2a,b) ma i le dimeric channel lea na muaʻi fusia ai le tasi subunit i le inhibitor (Fig. 4) na taʻitaʻia ai i matou e faʻamaonia o le faʻalavelaveina o le Hv1 e le GBTA O le gaioiga o se faiga faʻatasi, ma O le mauaina o le GBTA e fusifusia i le auala tatala, e pei ona faʻaalia muamua mo le fesoʻotaʻiga 2GBI32, o loʻo fautua mai ai e mafai ona iloiloina faʻapitoa le faʻaogaina o le allosteric i le tulaga tatala. na mafai ona faʻamatalaina faʻatusatusaina le faʻalavelaveina o le Hv1 e GBTA (Fig. 2c) ma faʻamatalaina aafiaga eseese o le 2GBI ma le GBTA i luga o le pala o le siʻusiʻu alavai pe a maeʻa le repolarization membrane, lea e lagolagoina la tatou faʻamatalaga o le faʻaogaina o le faagasologa.
O le maualuga maualuga o Hill e mafai ona maua i se polotini allosteric ma nofoaga fusifusia e lua (e pei o le Hv1) e 2. Sa matou fuaina le GBTA e fusifusia ai Hv1 wild-type ma le coefficient o le 1.31, lea na siitia i le 1.88 i le Hv1 I127C.The malosi saoloto synergistic, o le eseesega i le va o le malosi saoloto fusifusia o nofoaga sili ona maualalo ma sili ona vavalalata (silasila i Metotia), o le 1.3 kcal / mole i le tulaga o le Hv1 wild-type ma le 2.7 kcal / mole i le tulaga o le Hv1 I127C. o le okesene i le hemoglobin o le faʻataʻitaʻiga sili ona taʻutaʻua ma suʻesuʻeina lelei o le faiga faʻatasi38. Mo le hemoglobin tagata (se tetramer faʻatasi ai ma nofoaga faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻatasi), o le Hill coefficient e amata mai le 2.5-3.0, faʻatasi ai ma tau mai le 1.26 i le 3.64 kcal / mol, faʻalagolago i tulaga faʻataʻitaʻiga38. O lea, i le tulaga o le malosi o le lalolagi, o le galulue faʻatasi o le GBTA o loʻo fusifusia i le Hv1 e le matua ese lava mai le O2 o loʻo fusifusia i le hemoglobin pe a iloiloina le numera eseese o vaega ole porotini i totonu o faiga e lua.
I la matou faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, o le fusifusia o mole o le GBTA i le tasi subunit e mafua ai le faʻateleina o le fusifusia affinity o le pito i tua. suiga i fegalegaleaiga i le va o vaega laiti. I le tali atu i nei suiga, o vaega pito i tua e suia o latou nofoaga fusifusia, e mafua ai ona faʻamalosia le fusifusia GBTA. I le taimi o lenei faagasologa, o le S1 aspartate D112 e nafa ma le toe faʻatulagaina o le nofoaga faʻapipiʻi e fesoʻotaʻi ma le faʻateleina o le fusifusia.D112 na faʻaalia muamua o se vaega o le Hv1 proton permeation pathway ma galue e avea ma filiga filifilia27,28. O a matou faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai o filiga filifilia i vaega e lua o le Hv1 o loʻo tuʻufaʻatasia faʻatasi i le tulaga tatala. Ata 7a o loʻo faʻaalia ai le nofoaga faʻatatau o le GBTA fusifusia nofoaga ma le nofoaga o toega D112, D123, K125 ma I127 i luga o se schematic o le Hv1 VSD faavae. i luga o le fausaga tioata o le Hv1-CiVSP chimera. Fautuaga fautuaina mo soʻotaga allosteric e aofia ai le pito extracellular o le S1 o loʻo faʻaalia i aū uliuli.
(a) Fuafuaga o le Hv1 VSD. Faʻavae i luga o le fausaga tioata o le Hv1-CiVSP chimera, o vaega o le helical o loʻo faʻaalia i le cylindrical. O nofoaga valoia o le GBTA fusifusia o loʻo faʻaalia o ni ovals efuefu. O aū uliuli o loʻo faʻaalia ai ala o loʻo aʻafia ai i le fesoʻotaʻiga faʻatasi i le va o nofoaga faʻapipiʻi i ni vaega laiti e lua. i le lua dimer configurations eseese e pei ona vaaia mai le extracellular itu o le membrane plane.On the left panel, the dimer interface is made by the S4 helix.Rotation of the two VSDs 20 degrees clockwise around a axis perpendicular to the membrane plane, o faatasi ma tuueseeseina o pito pito i fafo o le S4 helices e lua (aū fa'amavae), e maua ai le faatulagaga o lo'o fa'aalia i le itu taumatau. i le seti dimer o loʻo maua i le fausaga tioata 4G80. Tulaga P140 i le CiVSP e fetaui ma le tulaga D123 i le Hv1.
O a matou faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai o le faʻaogaina o fesoʻotaʻiga eletise i le va o toega 123 (123D / 123D poʻo le 123R / 123R) e fesoʻotaʻi ma se tulaga "masani" o le felagolagomaʻi o le GBTA i le tulaga tatala ma fesuiaʻi le fegalegaleaiga mai le teenaina i le Attracted (123D / 123R) , faʻateleina le galulue faʻatasi (Fig. 5g) . E faʻamoemoeina o le aveeseina o le faʻalavelave faʻafefe ma le alanine suitulaga o le a oʻo atu ai foi i le faʻateleina o le galulue faʻatasi. faʻamatalaga o le faʻalavelave faʻaleagaina o le tuʻuina o mea e totoe o le hydrophobic i totonu o se siosiomaga hydrophilic atonu e sili atu nai lo le faʻamautuina o aʻafiaga ona o le faʻaumatiaina o fegalegaleaiga faʻafefe i le va o D123 toega, e mafua ai le faʻaitiitia atoa o le galulue faʻatasi. tulaga D171 o Ciona gutis Ci-Hv1 (e tutusa ma le D123 i tagata Hv1) ua faateleina i luga o le faʻagaoioia, lagolagoina le manatu o D123 o loʻo i totonu o se siosiomaga hydrophilic i le tulaga tatala.
Gating of Hv1 channels ua iloa e tupu e ala i le tele o suiga19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 na maua i luga o le depolarization membrane, o le voltage sensor o le Ci-Hv1 o loʻo i ai se suiga faʻavae e tuʻu ai le alalaupapa faʻagaoioia ae tapunia pea. , Ona sosoo ai lea ma se suiga manino e mafua ai le tatalaina o le protons i vaega laiti uma e lua. O le suiga o le conformational o le voltage sensor na mataʻituina e le voltage-clamp fluorescence, ma na maua ai o le suiga lona lua na faʻafefeteina e le suiga i le tulaga D171. O le faʻalavelave o le faailo o le fluorescent e ogatasi ma le i ai o fesoʻotaʻiga eletise i le va o le D171 toega o subunits lata ane i se taimi i luga o le tali faamaopoopoina o le conformational change.O lenei faauigaga e ogatasi ma lo tatou mauaina o le D123 toega electrostatically fegalegaleai i le tulaga tatala. ma fa'afeso'ota'i feso'ota'iga allosteric i le va o nofoaga fa'apipi'i GBTA.
Fujiwara et al25 na fautua mai o le dimer interface o le cytoplasmic coiled-coil domain e faʻalautele atu i totonu o le membrane e aofia ai le lua S4 helices (Fig. 7b, left panel). le VSD atoa ma le suʻesuʻeina o galuega o le itulagi e fesoʻotaʻi ai le S4 helix ma le CCD. I le leai o se transmembrane pH gradient, o le Hv1 e manaʻomia ai le tele o le depolarization o le membrane e tatala, ma o le cysteine crosslinking e tupu i lalo o tulaga e matua tapunia ai le alalaupapa. O le mea lea, o le suʻesuʻega S4-S4 ua iloa e foliga mai o loʻo atagia mai ai le faʻaogaina o vaega laiti i fafo atu o le setete. setete tapunia, o se manatu e ogatasi ma mea na maua e Mony et al. S1 fa'agaoioi 39 i le taimi o le pa.
O iinei, matou te faʻaalia ai, i le tulaga tatala, o pito pito i fafo o le S1 helix e latalata tele e lagolago ai fesoʻotaʻiga eletise tuusaʻo e faʻatautaia le fesoʻotaʻiga allosteric i le va o subunits. e ese mai le tasi i le isi e fegalegaleai tuusaʻo. Ae ui i lea, o le 20 ° faʻasolosolo faʻasolosolo o vaega laiti VSD e lua faʻataʻamilo i se axis perpendicular i le vaalele membrane, faʻatasi ma le vavaeeseina o pito i fafo o le lua S4 helices, maua ai se S1-S1 faʻatulagaina tutusa faatasi ai ma a matou sailiga (Fig. 7b, laulau taumatau). Matou te fautuaina lenei faʻatulagaga mo le alalaupapa i le tulaga tatala.
E ui lava o le CiVSP enzyme e manatu e galue e pei o se monomer, o le fausaga tioata o lona VSD tuʻufua o loʻo puʻeina i se tulaga dimer. mo Hv1 (Fig. 7c) .I le CiVSP dimer, o le toega pito lata ane mai le pito i tafatafa o le proline i le tulaga 140 (Fig. 7c). O le mea e malie ai, o le P140 i le CiVSP e fetaui ma le tulaga D123 i le Hv1. ma le CiVSP dimers o loʻo fautua mai ai o VSDs o nei polotini o loʻo i ai se uiga faʻapitoa e fausia ai se atinaʻe lea e fegalegaleai ai pito extracellular o le S1.
O le matafaioi taua a le Hv1 i le sperm cell activation ua avea ai lenei auala o se taulaiga fualaau faasaina mo le puleaina o le fertility o tane. E le gata i lea, o le faʻagaoioia o le Hv1 i microglia ua faʻaalia e faʻaleagaina ai le toe faʻaleleia mai le stroke. ola i tagata mamaʻi e maua i le susu 12 poʻo le kanesa colorectal 13 ma e manatu e saofagā i le B-cell malignancies. tatala le vaega ole Hv1, e o'o atu ai i le fa'ateleina o feso'ota'iga, e mafai ona ta'ita'ia ai le fa'atupuina o vaila'au malolosi e fa'atatau ile ala ole Hv1.
O suiga o le Hv1 i luga ole laiga na faia i le faʻaaogaina o metotia PCR masani. I le Hv1NCCiVSP faufale, o totoe 1-96 ma le 228-273 o le Hv1 na suia i toega 1-113 ma le 240-576 o le CiVSP18. I le Hv1-linked dimer, o le C-terminus o le tasi subunit e fesoʻotaʻi atu i le N-terminus o le vaega lona lua e ala i le GGSGGSGGSGSGGSGG linker. O le pGEMHE plasmids o loʻo i ai le tele o fausaga na faʻapipiʻiina ma Nhe1 poʻo Sph1 faʻatapulaʻaina enzymes (New England Biolabs) ma RNA synthesis na faia ma le T7 mMessage mMachine transcription kit (Ambion) .1-3 aso aʻo leʻi fuaina le electrophysiological, cRNA na tui ile Xenopus oocytes (50 nl i le cell, 0.3-1.5 μg / μl) . Stage V ma VI oocytes mai Xenopus laevis (NASCO) na maua mai. mai le Ecocyte Bioscience. I le mulimuli ai i le tui RNA, na tausia sela i le ND96 medium e aofia ai 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg / ml gentamicin, pH 18 ° C.2. .
2-guanidino-benzimidazole [1], 2-guanidino-benzothiazole [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- 5-carboxylate [9] ma le (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetate [10] sa mai Sigma-Aldrich. Famotidine [7] sa mai MP Biomedicals.1-[4 -(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] ma le 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-yl]guanidine [12] sa mai le Matrix Scientific.O nei tuufaatasiga o le mama sili ona maualuga e maua i pisinisi. Na soloia i le DMSO mago e gaosia ai se vaifofo oloa 100 mM, lea na faʻafefeteina i totonu o le vaifofo puʻeina i le faʻatonuga mulimuli e manaʻomia. Faʻapipiʻi 3 ma 4 i lalo ma a itiiti mai 99% mama.
I se taofiga o le 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) i le 25 mL o le aqueous hydrochloric acid (2.5 N) sa faaopoopo i ai le dicyandiamide malosi (380 mg, 4.5 mmol), ma le taunuuga o le paluga eseese. na faʻafefeteina ma faʻamalosi malosi mo itula 4. O le faʻafefiloi o tali na faʻamafanafanaina i le vevela o le potu ma faʻaleagaina e ala i le faʻaopoopoga malie o le 10N potassium hydroxide. O le paʻepaʻe paʻepaʻe na faia na faʻamamaina, fufuluina i le vai malulu (3 × 50 ml), faʻagogo i totonu o se ogaumu ( 65 °C) mo ni nai itula, ona toe fa'ama'i mai le ethyl acetate/petroleum ether e maua ai se malo pa'epa'e (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (malamalama 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (tele lautele s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d) , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J). = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z tau fuafuaina.Mo C9H8F3N4S (M + H)+: 261. : 261.0419.
Naphtho [1,2-d] thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), faʻapipiʻiina e pei ona faʻamatalaina muamua, na faʻamafanafanaina i le 200 ° C i totonu o se suauʻu taele i totonu o se tamai tube suʻega.300 mg (tele tele) cyanamide ma 1.0 ml conc.To le vevela vevela sa faaopoopo hydrochloric acid vave ma le paluga sa teuina i totonu o le vai taele mo le tusa o le 2 minute, i le taimi lea o le tele o le vai evaporated. O le paluga tali na faamalūina i le vevela potu ma le taunuuga o mea solidified. sa gaui i ni vaega laiti ma fufulu i le vai ina ia maua ai se malo samasama samasama amorphous.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H) , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150). MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z 128.7, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z + 12H12 (ESI): m/z + 12H12. , maua: 243.0704.
Proton currents na fuaina i totonu ma fafo o patches o oocytes faʻaalia fausaga eseese e faʻaaoga ai le Axopatch 200B amplifier pulea e le Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) ma le pClamp10 software. Intracellular and extracellular solutions have the same composition: 100 mM 2-(N-morpholino). )ethanesulfonic acid (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM TEA chloride, 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), fetuutuunai i pH 6.0 ma TEA hydroxide. O fua uma na faia i le 22 ± 2 °C. O le paipa e iai le avanoa e teteʻe ai i le 1.5-4 MΩ. O faʻataʻitaʻiga o loʻo iai nei na faʻamamaina i le 1 kHz, faʻataʻitaʻiina i le 5 kHz ma suʻesuʻeina ma Clampfit10.2 (Molecular Devices). ) ma le Origin8.1 (OriginLab).
O vaifofo o loʻo i ai faʻalavelave eseese o le inhibitor Hv1 ma i nisi tulaga 10 mM βME na faʻafeiloaʻi i totonu o le taele e ala i le kalave e ala i se faʻapipiʻi fesoʻotaʻi atu i se VC-6 perfusion valve system (Warner Instr.), lea na pasia i le pClamp software TTL (Transistor- Transistor Logic) faailoilo. Fa'ata'ita'iga fa'avavevave na fa'aaogaina e fa'aaoga ai se penitala fa'aulu tele-tube (AutoMate Sci.) Fa'atasi ai ma se pito tu'uina atu o le 360 μm o lo'o fa'apipi'iina i luma o se paipa fa'apipi'i. Fa'amauina le fa'amataina o alaleo e fua amperometric isochronal i le pito o le. + 120 mV depolarizing pulse.GV fua na faia e pei ona faamatalaina muamua18,20. Siʻusiʻu galu na faamaumauina i le -40 mV ina ua uma depolarization laasaga i voltages eseese mai le -20 mV i le +120 mV sei vagana ua taʻua. fa'aoga e fa'asa'o ai le pala o lo'o iai nei 18 .O le kalafi GV e fetaui ma le fa'atusa a Boltzmann:
Ole fa'amanino ole fa'a'ese'esega (Kd) mo tu'ufa'atasiga 'ese'ese o alalaupapa ma inhibitors (Tula'au Fa'aopoopo 1) na fa'amoemoeina e ala i le fa'atatauina o le fa'amoemoega fa'alagolago o le fa'asaina (o lona uiga % inhib tau) ma le Hill equation:
o le [I] o le fa'atonuga o le inhibitor I ma le h o le fa'atasi o Mauga.
Taimi meli: Iuni-07-2022
