Dankie dat jy Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Om intussen te verseker voortgesette ondersteuning, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Die Hv1 spanning-omheinde protonkanaal is 'n dimeriese kompleks wat bestaan uit twee spanningswaarnemingsdomeine (VSD's), wat elk 'n omheinde protonpermeasiebaan bevat.Dimerisasie word beheer deur die sitoplasmiese opgerolde spoeldomein.Die oorgang van die geslote toestand na dit is bekend dat die oop toestand in beide VSD's koöperatief voorkom; min is egter bekend oor die onderliggende meganismes.Intersubeenheid-koppelvlakke speel 'n sleutelrol in allosteriese prosesse; sulke koppelvlakke is egter nie in oop Hv1-kanale geïdentifiseer nie.Hier demonstreer ons dat 2-guanidinotiasool-derivate twee Hv1-VSD's op 'n samewerkende wyse blokkeer en een van hierdie verbindings gebruik as 'n sonde vir allosteriese koppeling tussen oop subeenhede. Ons het gevind dat die ekstrasellulêre einde van die eerste transmembraanfragment van VSD vorm 'n intersubeenheid-koppelvlak wat koppeling tussen bindingsplekke bemiddel, terwyl die opgerolde-spoel-domein nie direk by hierdie proses betrokke is nie. Ons het ook sterk bewyse gevind dat die kanaal se proton-selektiewe filter blokkerbindende koöperasie beheer .
Spanningsbeheerde protonkanale speel belangrike rolle in 'n verskeidenheid organismes, van fitoplankton tot mense1. In die meeste selle bemiddel hierdie kanale proton-uitvloei vanaf die protonmembraan en reguleer die aktiwiteit van NADPH-oksidase. Die enigste bekende spanning-gehekte protonkanaal by mense is Hv1, wat die produk is van die HVCN1-geen2,3.Hv1 (aka VSOP) is getoon om 'n rol te speel in B-selproliferasie4, produksie van reaktiewe suurstofspesies deur die aangebore immuunstelsel5,6,7,8, spermsel beweeglikheid9 en pH-regulering van lugwegoppervlakvloeistof10. Hierdie kanaal is betrokke by verskeie Ooruitgedrukte kankertipes soos B-sel maligniteite4,11 en bors- en kolorektale kankers12,13. Daar is gevind dat oormatige Hv1-aktiwiteit die metastatiese potensiaal van kankerselle 11, 12 verhoog. In die brein word Hv1 uitgedruk deur mikroglia, en die aktiwiteit daarvan is getoon om breinskade in modelle van iskemiese beroerte te vererger.
Die Hv1-proteïen bevat 'n spanningswaarnemingsdomein (VSD), wat bestaan uit vier transmembraansegmente genaamd S1 tot S414. Die VSD lyk soos die ooreenstemmende domeine van spanningsbeheerde Na+, K+ en Ca2+ kanale en spanningsensitiewe fosfatases, soos CiVSP vanaf Ciona gutis15.In hierdie ander proteïene is die C-terminus van S4 geheg aan 'n effektormodule, die poriedomein of ensiem.In Hv1 is S4 gekoppel aan die opgerolde spoeldomein (CCD) wat aan die sitoplasmiese kant van die membraan geleë is .Die kanaal is 'n dimeriese kompleks wat bestaan uit twee VSD's, wat elk 'n omheinde protonpermeasiebaan bevat16,17,18. Daar is gevind dat hierdie twee Hv1 subeenhede koöperatief oopmaak19,20,21,22, wat daarop dui dat allosteriese koppeling en inter-subeenheid interaksies speel 'n belangrike rol in die hekproses. Die koppelvlak tussen die subeenhede binne die opgerolde spoeldomein is goed gedefinieer omdat die kristalstrukture van die twee geïsoleerde domeine beskikbaar is22,23. Aan die ander kant is die koppelvlak tussen VSD's binne die membraan nie goed verstaan.Die kristalstruktuur van die Hv1-CiVSP chimeriese proteïen verskaf nie inligting oor hierdie koppelvlak nie, aangesien die trimeriese organisasie van die gekristalliseerde kanaalkompleks kan voortspruit uit die vervanging van die inheemse Hv1 CCD deur die gisleucien rits GCN424.
'n Onlangse studie van die subeenheid-organisasie van die Hv1-kanaal het tot die gevolgtrekking gekom dat twee S4-helikse na die CCD oorgaan sonder ernstige ontwrigting van sekondêre struktuur, wat lei tot lang helikopters wat vanaf die membraan begin en in die sitoplasma uitsteek. Gebaseer op sisteïen-kruisbindingsanalise, hierdie studie stel voor dat Hv1 VSD's mekaar langs die S4 segment kontak. Ander studies het egter alternatiewe koppelvlakke tussen VSD's voorgestel. Hierdie koppelvlakke sluit S1 segmente 17, 21, 26 en die buitenste punte van S2 segment 21 in. 'n Moontlike rede vir die botsende resultate van hierdie studies is dat allosteriese koppeling tussen VSD's ondersoek is in verhouding tot die hekproses, wat afhang van die geslote en oop toestande, en die koppelvlak tussen VSD's kan verskil in verskillende toestandveranderinge in konformasie.
Hier het ons gevind dat 2-guanidinotiasool Hv1-kanale inhibeer deur sinergisties aan twee oop VSD's te bind, en het een van die verbindings, 2-guanidinobensotiasool (GBTA), gebruik om die interaksie tussen subeenhede in die oop toestand te ondersoek. koppelvlak.Ons het gevind dat die GBTA bindingskurwe goed beskryf kan word deur 'n kwantitatiewe model waarin binding van 'n inhibeerder aan een subeenheid 'n toename in die bindingsaffiniteit van die aangrensende subeenheid tot gevolg het. Ons het ook gevind dat residue D112, selektiwiteit filters vir die kanaal 27, 28 en deel van die guanidien-afgeleide bindingsplek 29 beheer GBTA-bindingskoöperasie. Ons wys dat koöperatiewe binding in die Hv1-dimeer gehandhaaf word, waar die CCD van die S4-segment skei, wat daarop dui dat die intersubeenheid-koppelvlak in die CCD nie direk bemiddel allosteriese koppeling tussen GBTA-bindingsplekke. Daarteenoor vind ons dat die S1-fragment deel is van die koppelvlak tussen die subeenhede en stel 'n rangskikking van aangrensende VSD's voor met die ekstrasellulêre einde van die S4-heliks weg van die middel van die dimeer om toe te laat die S1-fragment in die oop toestand te wees.
Klein molekule inhibeerders van Hv1 is nuttig as antikankermiddels en neurobeskermende middels. Tot op hede kon min verbindings egter die kanaal30,31,32,33 inhibeer. Onder hulle, 2-guanidinobenzimidasool (2GBI, verbinding [1] in Fig. 1a) en sy afgeleides is gevind om VSD29,32-permeasie van protone deur die kanaal te blokkeer.Binding van sulke verbindings word vermoedelik onafhanklik in die twee oop subeenhede voorkom.2-guanidinobensotiasool (GBTA, verbinding [2] in Figuur 1a) voorheen getoon om Hv1 byna net so effektief as 2GBI te inhibeer wanneer dit by 'n konsentrasie van 200 μM getoets is (Figuur 1b). Ons het ander tiasoolderivate ondersoek en gevind dat sommige van hulle die kanaal met soortgelyke of groter sterkte as GBTA inhibeer (Fig. 1 en Aanvullend) teks).Ons het die konsentrasie-responskrommes van vier tiasool-derivate (GBTA en verbindings [3], [6] en [11], Fig. 1c) bepaal en gevind dat hulle steiler as dié van 2GBI was. Die Hill-koëffisiënte (h) van tiasool-derivate het gewissel van 1,109 ± 0,040 tot 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c en Aanvullende Fig. 1).Daarteenoor was die Hill-koëffisiënt vir 2GBI 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a en Aanvullende Fig. 1).'n Heuwelkoëffisiënt bo 1 dui bindingskoöperasie aan.Omdat elke Hv1-subeenheid sy eie inhibeerder- bindingsplek,29,32 het ons geredeneer dat die binding van 'n tiasoolderivaat aan een subeenheid die binding van 'n tweede inhibeerdermolekule aan die aangrensende subeenheid kan verbeter.GBTA was die toetsverbinding met die hoogste Hill-koëffisiënt. Daarom het ons hierdie verbinding gekies om bestudeer die meganisme van bindingsinergie verder en gebruik 2GBI as 'n verwysing negatiewe beheer.
(a) Toetsverbindings: [1] Verwysing Hv1 inhibeerder 2-guanidino-benzimidasool (2GBI).[2] 2-guanidien-bensotiasool (GBTA), [3] (5-trifluormetiel-1,3-bensotiasool-2-iel) guanidien, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiasool-2-iel -guanidien, [5](4-metiel-1,3-tiasool-2-iel)guanidien, [6](5-broom-4-metiel-1,3-tiasool-2-yl)guanidien, [7] famotidien, [8] 2-guanidino-5-metiel-1,3-tiasool-4-karboksielsuur-etielester, [9] 2-guanidino-4-metieletiel-1,3-tiasool-5-karboksilaat, [10 ](2-guanidino-4-metiel-1,3-tiasool-5-yl)etielasetaat, [11]1-[4-(4-Chloorfeniel)-1,3-tiasool-2-yl]guanidien, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifeniel)-1,3-tiasool-2-yl]guanidien .(b) Inhibisie van menslike Hv1-aktiwiteit deur die aangeduide guanidinotiasole en die verwysingsverbinding 2GBI (blou-groen stawe) .Hv1 protonstrome is gemeet in binne-buite plate van Xenopus oösiete in reaksie op depolarisasie vanaf 'n houpotensiaal van -80 mV tot +120 mV. Elke inhibeerder is by 'n konsentrasie van 200 μM gevoeg.pHi = pHo = 6.0 .Data is gemiddelde±SEM (n≥4).(c) Konsentrasie-afhanklike inhibisie van menslike Hv1 deur verbindings [2], [3], [6] en [11]. Elke punt verteenwoordig die gemiddelde inhibisie ± SD van 3 tot 15 metings. Die lyn is 'n Heuwelpassing wat gebruik word om die oënskynlike Kd-waardes wat in Aanvullende Tabel 1 gerapporteer word, te verkry. Heuwelkoëffisiënte is bepaal uit die passings wat in Aanvullende Fig. 1 gerapporteer word: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (sien Metodes).
(a,b) Verbindings 2GBI en GBTA het dimeriese en monomere Hv1 op 'n konsentrasie-afhanklike wyse geïnhibeer. Elke punt verteenwoordig die gemiddelde inhibisie ± SD van 3 tot 8 metings en die kromme is 'n Hill-passing. Die Hill-koëffisiënte (h) wat in die ingevoegde histogramme is bepaal uit die passings wat in Aanvullende Fig. 3 en 4 gerapporteer is. Die konsentrasierespons van GBTA wat in (a) getoon word, is dieselfde as dié in Fig. 1c. Sien Aanvullende Tabel 1 vir oënskynlike Kd-waardes.(c) Modellering van die samewerkende binding van GBTA aan dimeriese Hv1. Die soliede swart lyn verteenwoordig die passing by die eksperimentele data deur vergelyking (6), wat die bindingsmodel beskryf in (d). Die stippellyne gemerk Sub 1 en Sub 2 verteenwoordig die bimolekulêre assosiasie -dissosiasie-ewewigskurwes van die eerste en tweede bindingsgebeurtenisse, onderskeidelik (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Skematiese diagram van die voorgestelde meganisme van die Hv1 blok.In die geval van GBTA, binding aan een oop subeenheid verhoog die affiniteit van die aangrensende oop subeenheid (Kd2 Hv1-kanale kan gemonomeriseer word deur hul N- en C-terminale sitoplasmiese domeine te vervang met ooreenstemmende gedeeltes van die Ciona Intestinalis spanningsensitiewe fosfatase CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34. Ons het die konsentrasie-afhanklikheid van inhibisie van monomeriese Hv1 deur GBTA en 2GBI gemeet vergelyk hulle met dié van dimeriese kanaal (wilde tipe) inhibisie (Fig. 2a,b). Ons het gevind dat die verskil in bindingsamewerking tussen die twee verbindings uitgeskakel is in monomeriese Hv1, wat die verduideliking ondersteun dat GBTA-binding aan een subeenheid die affiniteit van die ander subeenheid vir die inhibeerder. Ons het geredeneer dat GBTA-binding aan een Hv1-subeenheid kan lei tot herrangskikking van die bindingsplek (wat fit35 induseer), wat die herrangskikking van die vakante bindingsplek van die aangrensende subeenheid sou veroorsaak, wat lei tot verhoogde binding affiniteit.
Om die samewerkende binding van GBTA aan die kanaal kwantitatief te beskryf, het ons 'n model gebruik waarin enige subeenheid die eerste inhibeerdermolekule kan bind na aanleiding van 'n bimolekulêre reaksie met 'n dissosiasiekonstante Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO* ). Binding veroorsaak dat die kanaal 'n toestand aanneem waarin die oorblywende leë subeenhede aan die inhibeerder bind na aanleiding van 'n unieke bimolekulêre reaksie met 'n dissosiasiekonstante Kd2, waar Kd2 Die soliede swart lyn in Figuur 2c is die passing van die modelvergelyking by die eksperimentele konsentrasie-respons-kromme, wat 'n Kd1 van ~290 μM en 'n Kd2 van ~29 μM (Metodes-afdeling, vergelyking (6)) lewer. Die model beskryf ook die binding van 2GBI, waar Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d).In monomeriese Hv1 is daar net een bindingsplek en een Kdm (O° + B ⇆ B°).In die geval van GBTA is Kdm ongeveer 54 μM, wat meer ooreenstem met Kd1 as Kd2 (Fig. 2d). Met ander woorde, die bindingsplek van die monomeer is in 'n konfigurasie (O°) meer soortgelyk aan die hoë-affiniteitstoestand (BO*) as die lae- affiniteitstoestand (OO) van die dimeer, heel waarskynlik as gevolg van die uitskakeling van die koppelvlak tussen subeenhede.
Soos voorheen getoon vir 2GBI32, het ons gevind dat GBTA Hv1-strome onderdruk het deur die kanaal te blokkeer wanneer dit oop was eerder as deur dit moeiliker te maak om oop te maak (Aanvullende Fig. 2a,b,d). Dit is ook bekend dat 2GBI stadig vervalende stertstrome veroorsaak. in reaksie op membraanrepolarisasie, maar hierdie verskynsel is nie in GBTA waargeneem nie (Aanvullende Fig. 2c). In die teenwoordigheid van Hv1-inaktivering in die teenwoordigheid van 2GBI, kan die hekke in elke subeenheid nie toemaak voordat die blokker die bindingsplek verlaat nie (die " foot gate”-meganisme), en 2GBI ontbind stadiger as wat die hekke sluit.As een Hv1-subeenheid ontblokkeer en toegemaak word, terwyl die aangrensende subeenheid geblokkeer bly, word die ontbinding van die oorblywende 2GBI-molekules stadiger (blokkeerdervang). Langlewende kanaalspesies met slegs een geblokkeerde subeenheid gelei protone kortstondig voor sluiting en lewer 'n beduidende bydrae tot die stadig vervalende stertstroom.
Die bevinding dat die verval van Hv1-stertstrome nie betekenisvol vertraag is in die teenwoordigheid van GBTA nie (Aanvullende Fig. 2c) stem ooreen met 'n sinergistiese bindingsmeganisme vir hierdie blokker (Fig. 2d). Sodra 'n GBTA-molekule van die Hv1-subeenheid los is , daal die affiniteit van die blokker met die aangrensende subeenheid ongeveer 10-voudig, wat die ontbindingsproses bevoordeel. Dit beteken dat die tweede molekule van GBTA 'n baie groter kans het om te ontrafel voordat dit in die kanaal vasgevang word. Langlewende kanaalspesies wat produseer slegs een blokkerende subeenheid, sal na verwagting baie meer volop wees in die teenwoordigheid van GBTA as in die teenwoordigheid van 2GBI, wat lei tot vinniger stertstroomverval.
Ten einde vir GBTA om saam met beide Hv1 subeenhede te bind, moet die bindingsplekke allosteries gekoppel wees. Elke bindingsplek moet in staat wees om: 1) 'n ketting van gebeurtenisse te aktiveer wat met aangrensende subeenhede gebind aan die inhibeerder kommunikeer, en 2) die bemiddeling van die oorgang van lae-affiniteit na hoë-affiniteit binding. Ons het geredeneer dat as spesifieke residue binne die bindingsplek bygedra het tot die koöperatiewe proses, hul mutasie die Hill-koëffisiënt van die konsentrasie-respons-kromme van GBTA-inhibisie van Hv1 behoort te verander. Residues D112, F150 , S181 en R211 is voorheen getoon om deel te wees van die 2GBI29-bindingsomgewing en ons het veronderstel dat hulle insgelyks by GBTA-binding betrokke sou wees (Fig. 3A). Ons het inhiberende konsentrasie-reaksiekrommes van GBTA gemeet vir mutantkanale D112E, F150A, S181A , en R211S (Figuur 3) en vergelyk hul Hill-koëffisiënte met dié van Hv1-wildtipe, deur 2GBI as verwysing te gebruik. Residu V109 is op dieselfde vlak van die S1-segment as D112 en het een ekstra heliese draai binne die sel. V109 was nie betrokke by die binding van 2GBI29 nie, ons het die V109A mutant as 'n kontrole gebruik (Fig. 3b).
(a) Voorgestelde Hv1-residu betrokke by guanidien-afgeleide binding. Gestreepte blou krommes omring voorheen voorgestelde sykettings wat in wisselwerking met verskillende dele van verbinding 2GBI29.(bf) Konsentrasie-afhanklike inhibisie van die aangeduide Hv1-mutante deur verbindings 2GBI (sian) en GBTA ( donkerrooi). Elke punt verteenwoordig die gemiddelde inhibisie van 3 tot 12 metings ± SD V109 as 'n negatiewe kontrole. Krommes is Heuwelpassings wat gebruik word om skynbare Kd-waardes te verkry (sien Aanvullende Tabel 1). Die Heuwelkoëffisiënte (h) wat in die ingevoegde histogramme is bepaal uit die passings wat in Aanvullende Fig 3 en 4 gerapporteer word. Verwysing h-waardes vir Hv1 WT word as stippellyne getoon. Sterretjies dui statisties beduidende verskille aan tussen mutant- en WT-passasies (p Ons het gevind dat die D112E-mutasie die Hill-koëffisiënt aansienlik verminder het (p Die bevinding dat die Hill-koëffisiënt vir GBTA-binding hoër as 1 in die Hv1-dimeer is en ~1 in die monomeriese kanaal word (Fig. 2b), stem ooreen met die bestaan van allosteriese interaksies tussen die bindingsplekke in die twee subeenhede. in die geval moet die Hill-koëffisiënt van GBTA-binding aan die dimeer waaraan die blokker aan een subeenheid gebind het ~1 wees. Ons het hierdie voorspelling getoets in die Hv1 F150A-WT-gekoppelde dimeer (Fig. 4a), waar die affiniteit van die F150A subeenheid vir GBTA was meer as 2 ordes van grootte hoër as dié van die WT subeenheid (Fig. 1c en 3d). Ons het toe konsentrasie-respons kurwes gemeet vir inhibisie van die WT subeenheid by 'n basale konsentrasie van 2 μM GBTA. By hierdie konsentrasie , word verwag dat die blokker ongeveer 99% van die F150A-subeenheid en (a) Skematiese diagram van die F150A-WT-aansluitingsdimeer wat gebruik word om die blokkerende hemikanaal ({F150A}b-WT/BAO*) te genereer. Wit diamante wys die ligging van die mutasie. In die BAO*- en BA*B*-toestande, die affiniteit van die F150A-subeenheid sal na verwagting hoër wees as dié van die WT-subeenheid.(b) Protonstrome vanaf F150A-WT-kanale gemeet in reaksie op veranderinge in membraanpotensiaal van -80 mV tot +120 mV.pHi = pHo = 6.0 .Grys spore verteenwoordig strome gemeet in die afwesigheid van inhibeerder. Die swart spoor (kontrole) verteenwoordig die stroom gemeet na byvoeging van 2 μM GBTA. By hierdie konsentrasie was die WT subeenheid nie betekenisvol geïnhibeer nie, terwyl die F150A subeenheid byna heeltemal aan GBTA gebind het ({F150A}b-WT). 'n Verdere toename in GBTA-konsentrasie het gelei tot blokkasie van die WT-subeenheid (oranje en rooi spore).(c) Konsentrasie-afhanklike inhibisie van {F150A}b-WT-dimeer (inhibeerder voorafgebind aan F150A subeenheid).Elke punt verteenwoordig die gemiddelde inhibisie ± SD van 3 tot 7 metings. Die kurwes was Hill-passings wat gebruik is om die oënskynlike Kd-waardes te verkry wat in Aanvullende Tabel 1 gerapporteer word. Die Heuwel-koëffisiënte wat in die ingevoegde histogramme gewys word, is bepaal uit die passings wat in Aanvullende Fig. 3 en 4 gerapporteer word. Die h-waardes van Hv1 WT is getoon as stippellyne.Asterisks dui statisties beduidende verskille aan in vergelyking met WT dimeer Hv1 (p Aangesien GBTA inhibisie van Hv1 in die oop kanaal gemeet is, het ons geredeneer dat GBTA bindende koöperasie gebruik kan word om die meganisme van intersubeenheid koppeling in die oop toestand te bestudeer. Daar is voorheen gevind dat hierdie twee Hv1 subeenhede koöperatief omheind is 19,20,21, 22 en die intersubeenheid koppeling betrokke by poort is voorgestel om bemiddel te word deur die sitoplasmiese opgerolde spoel domein (CCD)22,25. Daarom het ons gevra of CCD ook betrokke is by die koppeling tussen GBTA-bindingsplekke in die oop toestand. Triglisien mutasies by die raakvlak tussen die S4-transmembraanfragment en die opgerolde spoeldomein is in vroeëre studies getoon om hierdie domein van die res van die kanaal te ontkoppel terwyl dimerisasie-integriteit behou word. Daarom het ons die effek van mutasies V220G, K221G en T222G getoets (Fig. . twee subeenhede saam belangrik, maar CCD bemiddel nie direk intersubeenheid allosteriese koppeling tussen GBTA bindingsplekke nie.
(a) Skematiese diagram van die Hv1-dimeer met 'n triglisienmutasie aan die binnekant van S4 wat ontwerp is om die intersubeenheid-koppeling te ontwrig wat deur die sitoplasmiese opgerolde-spoel-domein (blou pyle) bemiddel word.(b) Skematiese voorstelling van Hv1-dimere en ligasie-dimere met aangeduide mutasies, ontwerp om S1-fragmente wat betrokke is by koppeling tussen subeenhede (blou pyle) te toets.(c–h) 2GBI (sian) en GBTA (donkerrooi) inhibeer die aangeduide konstrukte op 'n konsentrasie-afhanklike wyse. Elke punt verteenwoordig die gemiddelde inhibisie ± SD van 3 tot 10 metings. Die kromme was 'n Heuwelpassing wat gebruik is om oënskynlike Kd-waardes te verkry (sien Aanvullende Tabel 1). Heuwelkoëffisiënte in die geïnterpoleerde histogramme is bepaal soos beskryf in die Metodes-afdeling (sien Aanvullende Fig. 3 en 4). Verwysing h-waardes vir Hv1 WT word as stippellyne getoon.Asterisks dui statisties beduidende verskille aan tussen mutant- en WT-passasies (p Aangesien ons CCD as 'n direkte bemiddelaar van GBTA-koöperatiewe binding uitgesluit het, het ons gevra of interaksies tussen VSD's betrokke is by allosteriese koppeling tussen bindingsplekke. Ons het gevind dat GBTA-bindende koöperasie afgeskaf is deur konserwatiewe mutasie van residu D112 (Fig. 3c) geleë. in die S1-transmembraansegment.S1 bevat twee ander negatief gelaaide residue, E119 en D123, geleë aan dieselfde kant van die heliks as D112, maar nader aan die buitenste punt 24 van die fragment.Vroeë molekulêre dinamika-simulasies het aangedui dat hierdie residue gekoppel was na D112 via waterlyne36,37.Daarom het ons getoets of E119 en D123 betrokke is by allosteriese koppeling tussen GBTA-bindingsplekke (Fig. 5b). As 'n negatiewe kontrole het ons die behoue positief gelaaide posisie K125, wat naby D123 geleë is, getoets. maar aan die ander kant van die S1-heliks (Fig. 5b).
Ons het die konsentrasie-afhanklike inhibisie van E119A-, D123A- en K125A-kanale deur 2GBI en GBTA gemeet en gevind dat E119A- en K125A-mutasies nie die Hill-koëffisiënt van enige inhibeerder betekenisvol verander het in vergelyking met wilde tipe nie (p > 0.05, Fig. 5d,i). ). Aan die ander kant het mutasie D123A die Hill-koëffisiënt van GBTA aansienlik verminder (p 0.05/14).
Aangesien die neutralisering van die lading by posisie 123 op beide subeenhede 'n sterk verandering in GBTA bindende koöperasie tot gevolg gehad het, terwyl die omkeer van die lading op beide subeenhede slegs 'n klein effek gehad het, het ons die analise uitgebrei om slegs een subeenheid met die inversiekanaal van lading in te sluit. het Hv1-gekoppelde dimere met D123R-substitusie in die C-terminale subeenheid (Fig. 5b) gegenereer en die konsentrasie-respons-inhibisie deur GBTA en 2GBI gemeet. Ons het gevind dat die Hill-koëffisiënt van GBTA-binding aan WT-D123R-kanale aansienlik hoër as dit was van wild-tipe Hv1 (p Ons het ook gevind dat die D112E-mutasie die toename in die GBTA-bindende Hill-koëffisiënt wat deur die WT-D123R-agtergrond geproduseer word, opgehef het (Fig. 5b,h en Aanvullende Fig. 4). Die effek op die Hill-koëffisiënt van 2GBI-binding is ook uitgeskakel ( Fig. 5h en Aanvullende Fig. 3). Hierdie bevindinge dui daarop dat die verbeterde allosteriese koppeling tussen subeenhede wat veroorsaak word deur teenoorgestelde ladings by posisie 123 nie vertaal in sterker bindingskoöperasie wanneer die bindingsplek by posisie D112 versteur word nie.
Ons het geredeneer dat indien die D123-residue op aangrensende oop subeenhede naby genoeg was om elektrostaties met mekaar te reageer, die afstotende interaksie tussen die negatiewe ladings omgeskakel sou word na 'n kombinasie van negatiewe en positiewe ladings deur asparaginsuur na arginien te vervang. aantreklike interaksie tussen hulle.Een subeenheid (WT-D123R dimeer).Aantreklike interaksies kan die koppelvlak tussen die buitenste punte van die S1-fragment versterk, wat lei tot sterker allosteriese koppeling tussen die subeenhede en verhoogde GBTA-bindende koöperasie.
Om hierdie hipotese te ondersteun, het ons gesoek na 'n manier om die koppelvlak tussen die buitenste punte van die S1-segment te versterk, wat verskil van die ladingwisseling by posisie 123. Lee et al. Mutasie van Hv1-residu I127 na sisteïen is voorheen gevind om spontane intersubeenheid kruisbinding tot gevolg te hê17.Verder het die kristalstruktuur van die Hv1-CiVSP chimeriese VSD aangedui dat I127 van die buitenste punt van die S1 heliks geskei word deur slegs een residu24.Ons het dus gevra of die vorming van 'n kovalente binding tussen sisteïene by posisie 127, wat na verwagting sal lei tot 'n sterker S1-S1 interaksie, het 'n effek op GBTA bindende koöperasie soortgelyk aan dié wat waargeneem word deur die lading by posisie 123 te verander.
Ons het die konsentrasie-afhanklike inhibisie van Hv1 I127C deur GBTA en 2GBI gemeet in die teenwoordigheid en afwesigheid van 10 mM β-merkapto-etanol (βME) (Fig. 6a). Terselfdertyd as die inhibeerder by die intrasellulêre oplossing gevoeg word, word die verminderende middel word by die ekstrasellulêre oplossing gevoeg. 'n Gekoppelde dimeer met sisteïensubstitusie in slegs een subeenheid (WT-I127C) is as 'n negatiewe kontrole gebruik (Fig. 6a). Ons kon geen effek van spontane intersubeenheid-kruisbinding meet nie. tussen die I127C-subeenhede op 2GBI-inhibisie, omdat die Hill-koëffisiënt vir I127C-binding aan Hv1, met of sonder βME, aansienlik verskil van dié vir binding aan monosisteïen-gesubstitueerde dimere. Die Hill-koëffisiënt kon nie WT-I127C onderskei nie (Fig. 6b en Aanvullende Fig. 3). In skrille kontras het ons die dramatiese effek van spontane intersubeenheid-kruisbinding op GBTA-inhibisie gemeet. Die Hill-koëffisiënt vir binding aan Hv1 I127C in die afwesigheid van βME (kruisbinding aan) was aansienlik hoër as gemeet in die teenwoordigheid van βME (verknoping af) of met behulp van WT-127C om die dimeer te koppel (in die afwesigheid van kruisbinding) (Fig. 6c en Aanvullende Fig. 4), wat aandui dat die allosteriese koppeling tussen bindingsplekke word grootliks versterk deur die vorming van disulfiedbindings tussen die buitenste punte van die S1-fragmente. Hierdie resultate ondersteun ons interpretasie dat die aantreklike elektrostatiese interaksie van aspartaat en arginien by posisie 123 in die WT-D123R dimeer lei tot verhoogde allosteriese koppeling tussen die subeenhede.
Ooptoestand-koppeling word bemiddel deur direkte fisiese interaksies tussen die buitenste punte van die S1-segment in die twee subeenhede.
(a) Skematiese voorstelling van mutante Hv1-dimere en skakeldimere, ontwerp om te ondersoek hoe intersubeenheid sisteïen-kruisbindings GBTA-bindingskoöperasie beïnvloed.(bd) Konsentrasie-afhanklike inhibisie van die aangeduide konstrukte deur 2GBI (b,d) en GBTA (c, e) in die teenwoordigheid of afwesigheid van 10 mM βME in ekstrasellulêre oplossing. Elke punt verteenwoordig die gemiddelde inhibisie ± SD van 3 tot 10 metings. Die kromme was 'n Heuwelpassing wat gebruik is om Kd-waardes te verkry (sien Aanvullende Tabel 1). Heuwelkoëffisiënte in die ingevoegde histogramme is bepaal uit die passings wat in Aanvullende Fig 3 en 4 gerapporteer word. Sterretjies in (c,e) dui statisties beduidende verskille aan tussen verskillende GBTA inhibisie toestande (p 0,05).
Ons het ook gevind dat in die afwesigheid van βME, die Hill-koëffisiënt van GBTA-binding aan die D112E I127C Hv1-dimeer aansienlik hoër was as dié gemeet in die teenwoordigheid van reduseermiddels (Fig. 6e en Aanvullende Fig. 4), wat impliseer dat Die D112E-mutasie het nie die toename in GBTA-bindende koöperasie as gevolg van die kruisbinding van sisteïen 127 afgeskaf nie. Die Hill-koëffisiënt van 2GBI binding aan D112E, I127C Hv1-dimere is ook nie beduidend deur die D112E-mutasie beïnvloed nie (Figuur 1).6d en Aanvullende Fig. 3).
Saamgevat dui hierdie bevindinge daarop dat GBTA-binding versterk word deur die interaksie tussen die buitenste punte van S1-fragmente in aangrensende Hv1-subeenhede deur aantreklike elektrostatiese interaksies of deur die vorming van kovalente bindings tussen gesubstitueerde sisteïene. Allosteriese koppeling tussen terreine neem toe en lei tot bindingsamewerking. Terwyl die effek van aantreklike elektrostatiese interaksies op koöperasie opgehef kan word deur mutasie D112E, kan die effek van kovalente bindings nie.
In ons verkenning van die chemiese ruimte wat beskikbaar is vir die binding van guanidienderivate aan Hv1-kanale, het ons gevind dat 2-guanidinothiasole soos GBTA 'n steiler konsentrasie-afhanklikheid het as 2-guanidinobensimidasole (Fig. 1c). Die Hill-koëffisiënt-analise van GBTA-binding aan beide die dimeriese en monomeriese kanale (Fig. 2a,b) en aan die dimeriese kanaal waarin een subeenheid vooraf aan die inhibeerder gebind was (Fig. 4) het ons tot die gevolgtrekking gelei dat die inhibisie van Hv1 deur GBTA Die aksie 'n sinergistiese proses is, en die bindingsplekke van die verbindings in die twee subeenhede is allosteries gekoppel.Die ontdekking dat GBTA aan die oop kanaal bind, soos voorheen getoon vir die verwante verbinding 2GBI32, dui daarop dat allosteriese koppeling spesifiek in die oop toestand beoordeel kan word.Ons koöperatiewe bindingsmodel was in staat om die inhibisie van Hv1 deur GBTA kwantitatief te beskryf (Fig. 2c) en die verskillende effekte van 2GBI en GBTA op die verval van kanaalstertstrome na membraanrepolarisasie te verduidelik, wat ons interpretasie van die bindingsproses ondersteun.
Die maksimum Hill-koëffisiënt wat in 'n allosteriese proteïen met twee bindingsplekke (soos Hv1) bereik kan word, is 2. Ons het GBTA gemeet om Hv1-wildtipe te bind met 'n koëffisiënt van 1.31, wat tot 1.88 in Hv1 I127C toegeneem het. sinergistiese vrye energie, die verskil tussen die bindingsvrye energieë van die laagste en hoogste affiniteitsplekke (sien Metodes), was 1.3 kcal/mol in die geval van Hv1-wildtipe en 2.7 kcal/mol in die geval van Hv1 I127C. Die binding van suurstof na hemoglobien is die bekendste en goed bestudeerde voorbeeld van die samewerkende proses38.Vir menslike hemoglobien ('n tetrameer met vier allosteries gekoppelde bindingsplekke), wissel die Hill-koëffisiënt van 2,5-3,0, met waardes wat wissel van 1,26 tot 3,64 kcal/mol, afhangende van eksperimentele toestande38. Dus, in terme van globale energetika, is die koöperasie van GBTA-binding aan Hv1 nie wesenlik verskillend van dié van O2-binding aan hemoglobien wanneer die verskillende getalle proteïensubeenhede in die twee sisteme in ag geneem word nie.
In ons sinergiemodel lei die binding van GBTA-molekules aan een subeenheid tot 'n toename in die bindingsaffiniteit van die aangrensende subeenheid. Ons voorsien 'n proses waarin 'n herrangskikking van die bindingsomgewing wat voortspruit uit die eerste bindingsgebeurtenis (geïnduseerde passing) lei tot veranderinge in die interaksies tussen subeenhede.In reaksie op hierdie veranderinge verander aangrensende subeenhede hul bindingsplekke, wat stywer GBTA-binding tot gevolg het.Gedurende hierdie proses is die S1-aspartaat D112 verantwoordelik vir die herrangskikking van die bindingsplek wat geassosieer word met verhoogde bindingsaffiniteit.D112 is voorheen getoon om deel te wees van die Hv1-protonpermeasiepad en om as selektiwiteitsfilter op te tree27,28. Ons resultate toon dat selektiwiteitsfilters in die twee Hv1 subeenhede allosteries gekoppel is in die oop toestand. Figuur 7a toon die benaderde ligging van die GBTA bindingsplek en die ligging van residue D112, D123, K125 en I127 op 'n skematiese van die Hv1 VSD gebaseer op die kristalstruktuur van die Hv1-CiVSP chimera.Voorgestelde aanwysings vir allosteriese koppeling wat die ekstrasellulêre einde van S1 betrek, word met swart pyle getoon.
(a) Skematiese van die Hv1 VSD. Gebaseer op die kristalstruktuur van die Hv1-CiVSP chimera, word die heliese segmente getoon as silindries. In hierdie konfigurasie smelt die binnekant van die S4 segment saam met die CCD (nie getoon nie). Die voorspelde liggings van gebonde GBTA word as grys ovale getoon.Swart pyle dui paaie aan wat betrokke is by allosteriese koppeling tussen bindingsplekke in twee aangrensende subeenhede. Die posisies van die ondersoekde S1-reste is gemerk met gekleurde sfere.(b) Skematiese illustrasie van Hv1-subeenhede gerangskik in twee verskillende dimeer-konfigurasies soos gesien vanaf die ekstrasellulêre kant van die membraanvlak.Op die linkerpaneel word die dimeer-koppelvlak gevorm deur die S4-heliks.Rotasie van die twee VSD's 20 grade kloksgewys om 'n as loodreg op die membraanvlak, vergesel deur skeiding van die buitenste punte van die twee S4-helikse (gestreepte pyle), produseer die rangskikking wat aan die regterkant getoon word. In hierdie konfigurasie word residue D123 en I127 van aangrensende subeenhede toegelaat om naby mekaar te kom.(c) Skematiese voorstelling van die CiVSP VSD in die dimeerkonfigurasie wat in die 4G80 kristalstruktuur gevind word.Posisie P140 in CiVSP stem ooreen met posisie D123 in Hv1.
Ons resultate toon dat die afstotende elektrostatiese interaksie tussen oorblyfsel 123 (123D/123D of 123R/123R) geassosieer word met 'n "normale" vlak van GBTA-bindende koöperasie in die oop toestand en die interaksie verskuif van afstoting na Aangetrek (123D/123R) , verhoogde samewerking (Fig. 5g). Daar word verwag dat die verwydering van die afstotende interaksie met alanienvervanging ook tot verhoogde koöperasie sal lei. 'n Afname in koöperasie van die 123A/123A dimeer is egter waargeneem (Fig. 5e). Een moontlike verduideliking is dat die destabiliserende effek van die plasing van hidrofobiese residue in 'n hidrofiele omgewing die stabiliserende effek as gevolg van die uitskakeling van afstotende interaksies tussen D123-reste kan oorskry, wat lei tot 'n algehele vermindering in bindingskoöperasie.Mony et al.39 het onlangs berig dat oplosmiddeltoeganklikheid by posisie D171 van Ciona gutis Ci-Hv1 (wat ooreenstem met D123 in menslike Hv1) word verhoog met aktivering, wat die idee ondersteun dat D123 in 'n hidrofiele omgewing in die oop toestand geleë is.
Dit is bekend dat gate van Hv1-kanale deur veelvuldige oorgange plaasvind19,20,26,39,40,41. Qiu et al26 het gevind dat die spanningsensor van Ci-Hv1 by membraandepolarisasie 'n konformasieverandering ondergaan wat die kanaal geaktiveer, maar steeds gesluit laat , gevolg deur 'n duidelike oorgang wat veroorsaak dat protone geleiding oopmaak in beide subeenhede se pad. Die konformasieverandering van die spanningsensor is gemonitor deur spanning-klem fluoressensie, en daar is gevind dat die tweede oorgang selektief versteur is deur die mutasie by posisie D171. Die versteuring van die fluoresserende sein stem ooreen met die teenwoordigheid van elektrostatiese interaksies tussen die D171-reste van aangrensende subeenhede op 'n sekere punt langs die reaksiekoördinate van die konformasieverandering. Hierdie interpretasie stem ooreen met ons bevinding dat die D123-residu in die oop toestand elektrostaties in wisselwerking tree en bemiddel allosteriese koppeling tussen GBTA-bindingsplekke.
Fujiwara et al25 het voorgestel dat die dimeer-koppelvlak van die sitoplasmiese opgerolde spoeldomein tot in die membraan strek om twee S4-helikse te bevat (Fig. 7b, linkerpaneel). 'n Model van hierdie intersubeenheid-interaksie is gebaseer op sisteïen-kruiskoppelingsanalise wat dek die hele VSD en funksionele analise van die streek wat die S4-heliks en die CCD verbind. In die afwesigheid van 'n transmembraan pH-gradiënt, vereis Hv1-kanale aansienlike membraan-depolarisasie om oop te maak, en sisteïen-kruisbinding vind plaas onder toestande waar die kanaal oorwegend gesluit is. Daarom weerspieël die bespeurde S4-S4-koppelvlak waarskynlik die off-state subeenheid-konfigurasie. Ander studies het bewyse gevind vir die betrokkenheid van S1 en S2 in intersubeenheid-interaksies tydens poort17,21,26 wat daarop dui dat kanale verskillende subeenheidkonfigurasies in die oop en geslote state, 'n idee wat ooreenstem met die bevindinge van Mony et al. S1 skuif 39 tydens hekwerk.
Hier wys ons dat, in die oop toestand, die ekstrasellulêre punte van die S1-heliks naby genoeg is om direkte elektrostatiese interaksies te ondersteun wat allosteriese koppeling tussen subeenhede bemiddel. In die dimeer-konfigurasie met uitgebreide S4-S4-interaksies is die S1-helikse te ver 'n 20° kloksgewyse rotasie van die twee VSD-subeenhede om 'n as loodreg op die membraanvlak, gekombineer met die skeiding van die buitenste punte van die twee S4-helikse, het egter 'n S1-S1-konfigurasie konsekwent opgelewer met ons bevindinge (Fig. 7b, regterpaneel). Ons beveel hierdie konfigurasie aan vir die kanaal in die oop toestand.
Alhoewel die CiVSP-ensiem vermoedelik as 'n monomeer funksioneer, word die kristalstruktuur van sy geïsoleerde VSD in 'n dimeer toestand vasgevang. Die buitenste punte van die S1-helikse in hierdie dimeer is ruimtelik naby mekaar, en die algehele konfigurasie is soortgelyk aan die voorgestelde vir Hv1 (Fig. 7c). In die CiVSP-dimeer was die naaste oorblyfsel van die aangrensende subeenheid prolien by posisie 140 (Fig. 7c). Interessant genoeg stem P140 in CiVSP ooreen met posisie D123 in Hv1. Die ooreenkoms in subeenheidkonfigurasie tussen Hv1 en CiVSP dimere dui daarop dat die VSD's van hierdie proteïene 'n intrinsieke neiging het om 'n koppelvlak te vorm waar die ekstrasellulêre punte van S1 interaksie het.
Die noodsaaklike rol van Hv1 in spermselaktivering maak hierdie kanaal 'n aantreklike geneesmiddelteiken vir die beheer van manlike vrugbaarheid.Verder is getoon dat aktivering van Hv1 in mikroglia die herstel van iskemiese beroerte vererger. Daar is gevind dat verbeterde Hv1-aktiwiteit geassosieer word met laer oorlewing in pasiënte met bors 12 of kolorektale kanker 13 en word vermoedelik by te dra tot B-sel maligniteite 11 .Daarom kan klein molekule middels wat Hv1 teiken gebruik word as neurobeskermende middels of antikanker terapeutiese middels. oop Hv1-subeenheid, wat lei tot verhoogde bindingsaffiniteit, kan lei tot die ontwikkeling van kragtiger middels wat Hv1-kanale teiken.
Plekgerigte mutagenese van menslike Hv1 is uitgevoer met behulp van standaard PCR-tegnieke. In die Hv1NCCiVSP-konstruksie is residue 1-96 en 228-273 van Hv1 vervang deur residue 1-113 en 240-576 van CiVSP18. In die Hv1-gekoppelde dimeer, die C-terminus van een subeenheid is gekoppel aan die N-terminus van die tweede subeenheid deur die GGSGGSGGSGSGGSGG skakelaar. Die pGEMHE plasmiede wat die verskillende konstrukte bevat is gelineariseer met Nhe1 of Sph1 beperkingsensieme (New England Biolabs) en RNA sintese is uitgevoer met die T7 mMessage mMachine-transkripsiestel (Ambion).1-3 dae voor elektrofisiologiese metings is cRNA in Xenopus-oösiete ingespuit (50 nl per sel, 0.3-1.5 μg/μl). Stadium V en VI oösiete van Xenopus laevis (NASCO) is verkry van Ecocyte Bioscience.Na aanleiding van RNA-inspuiting is selle in ND96-medium gehou wat 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM piruvaat, 100 μg/ml gentamisien, 1°C, 100 μg/ml gentamisien bevat. .
2-guanidien-bensimidasool[1], 2-guanidien-bensotiasool[2], (4-metiel-1,3-tiasool-2-iel)guanidien [5], (5-broom-4-metiel-1,3 -tiasool-2-iel)guanidien) [6], etiel 2-guanidino-5-metiel-1,3-tiasool-4-karboksilaat [8], etiel 2-guanidino-4-metiel-1,3-tiasool- 5-karboksilaat [9] en (2-guanidino-4-metiel-1,3-tiasool-5-yl)etielasetaat [10] was van Sigma-Aldrich. Famotidine [7] was van MP Biomedicals.1-[4 -(4-Chloorfeniel)-1,3-tiasool-2-iel]guanidien[11] en 1-[4-(3,4-dimetoksifeniel)-1,3-tiasool-2-yl]guanidien [12] was van Matrix Scientific.Hierdie verbindings is van die hoogste suiwerheid wat kommersieel beskikbaar is.Hulle is in droë DMSO opgelos om 'n 100 mM voorraadoplossing te genereer, wat dan in die opnameoplossing verdun is teen die verlangde finale konsentrasie.Verbindings 3 en 4 is hieronder gesintetiseer met ten minste 99% suiwerheid.
By 'n suspensie van 2-amino-4-(trifluorometiel)benseentiolhidrochloried (1,02 g, 4,5 mmol) in 25 ml waterige soutsuur (2,5 N) is vaste dicyandiamied (380 mg, 4,5 mmol) en die resulterende heterogene mengsel gevoeg is onder sterk geroer vir 4 uur onder terugvloei gekook. Die reaksiemengsel is afgekoel tot kamertemperatuur en geneutraliseer deur geleidelike byvoeging van 10N kaliumhidroksied. Die wit neerslag wat gevorm is, is gefiltreer, met koue water (3 × 50 ml) gewas, in 'n oond gedroog ( 65 °C) vir 'n paar uur, en dan herkristalliseer uit etielasetaat/petroleumeter om 'n wit vaste stof (500 mg, 48 %) te gee; smeltpunt 221–222 °C (lig 225–226 °C) 45; 1H KMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [dpm] = 7.25 (baie breë s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1H, J = 8,1 Hz). = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z berekende waarde.Vir C9H8F3N4S (M + H)+: 416,1 gevind. : 261,0419.
Nafto[1,2-d]tiasool-2-amien (300 mg, 1,5 mmol), gesintetiseer soos voorheen beskryf, is verhit tot 200 °C in 'n oliebad in 'n klein proefbuis.300 mg (groot oormaat) siaanamied en 1,0 ml kons.By die warm verbinding is soutsuur vinnig gevoeg en die mengsel is vir ongeveer 2 minute in die oliebad gehou, waartydens die meeste van die water verdamp het. Die reaksiemengsel is dan afgekoel tot kamertemperatuur en die gevolglike gestolde materiaal is in klein stukkies gebreek en met water gewas om 'n liggeel amorfe vaste stof te verskaf.(38 mg, 10%) smp. 246-250 °C; 1H KMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz). , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 H, J = 8,3 Hz).13C KMR (150) MHZ, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z berekende waarde.for c12h11n4s (m + h) +: 243.0699 , gevind: 243,0704.
Protonstrome is gemeet in interne en eksterne kolle van oösiete wat verskillende konstrukte uitdruk deur 'n Axopatch 200B versterker te gebruik wat beheer word deur 'n Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) met pClamp10 sagteware. Intrasellulêre en ekstrasellulêre oplossings het dieselfde samestelling: 100 mM 2-(N-morpholino) )etaansulfonsuur (MES), 30 mM tetraëtielammonium (TEA) mesilaat, 5 mM TEA-chloried, 5 mM etileenglikol-bis(2-amino-etiel)-N,N,N',N'-tetraasynsuur (EGTA), aangepas na pH 6.0 met TEA-hidroksied. Alle metings is by 22 ± 2 °C uitgevoer. Die pipet het 'n toegangsweerstand van 1.5–4 MΩ. Stroomspore is by 1 kHz gefiltreer, by 5 kHz gemonster en met Clampfit10.2 (Molecular Devices) ontleed ) en Origin8.1 (OriginLab).
Oplossings wat verskeie konsentrasies Hv1-inhibeerder bevat en in sommige gevalle 10 mM βME is in die bad ingebring deur swaartekrag deur 'n spruitstuk wat gekoppel is aan 'n VC-6 perfusieklepstelsel (Warner Instr.), wat deur die pClamp sagteware TTL (Transistor- Transistor Logic) seine. Vinnige perfusie-eksperimente is uitgevoer met behulp van 'n multi-buis perfusiepotlood (AutoMate Sci.) met 'n 360 μm deursnee afleweringspunt wat voor 'n pleisterpipet gemonteer is. Kanaalinhibisie is bepaal deur isochronale amperometriese metings aan die einde van die +120 mV depolariserende puls.GV metings is uitgevoer soos voorheen beskryf18,20.Stertstrome is opgeneem teen -40 mV na depolarisasie stappe by verskillende spannings van -20 mV tot +120 mV tensy anders vermeld. Die verwysingspuls wat die toetspuls voorafgaan, is gebruik om te korrigeer vir stroomverval 18. Die GV-grafiek pas by die Boltzmann-vergelyking:
Die skynbare dissosiasiekonstantes (Kd) vir verskillende kombinasies van kanale en inhibeerders (Aanvullende Tabel 1) is bepaal deur die konsentrasie-afhanklikheid van inhibisie (gemiddelde %inhib-waardes) by die Hill-vergelyking te pas:
waar [I] die konsentrasie van inhibeerder I is en h die Hill-koëffisiënt is. Om die Hill-koëffisiënt te bereken, word vergelyking (2) herrangskik as:
Postyd: Jun-07-2022
