Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-г хязгаарлагдмал дэмждэг. Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг унтраах). үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлбэл бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулах болно.
Hv1 хүчдэлийн хамгаалалттай протоны суваг нь хүчдэл мэдрэгчтэй хоёр мужаас (VSD) бүрдэх димерийн цогцолбор бөгөөд тэдгээр нь тус бүр нь хаалттай протоны нэвчүүлэх замыг агуулдаг. Димержилтийг цитоплазмын ороомог-ороомогоор удирддаг. Хаалттай төлөвөөс шилжих шилжилт. VSD-ийн аль алинд нь нээлттэй төлөв нь хамтран тохиолддог гэдгийг мэддэг; Гэсэн хэдий ч үндсэн механизмын талаар бага зүйл мэддэг. Нэгж хоорондын интерфейс нь аллостерийн процесст гол үүрэг гүйцэтгэдэг; Гэсэн хэдий ч нээлттэй Hv1 сувгуудад ийм интерфэйсүүд тодорхойлогдоогүй байна. Энд бид 2-гуанидинотиазолын деривативууд нь хоёр Hv1 VSD-ийг хамтран хааж, эдгээр нэгдлүүдийн аль нэгийг нээлттэй дэд нэгжүүдийн хооронд аллостерийн холболтыг шалгах зорилгоор ашигладаг болохыг харуулж байна. Бид эсийн гаднах VSD-ийн эхний трансмембран фрагментийн төгсгөл нь холбох хэсгүүдийн хоорондох холболтыг зуучлах дэд нэгж хоорондын интерфэйсийг бүрдүүлдэг бол ороомог-ороомог домэйн энэ үйл явцад шууд оролцдоггүй. Мөн сувгийн протон-сонгогч шүүлтүүр нь хориглогч-холбогчийг хянадаг гэсэн баттай нотолгоог олсон. .
Хүчдэлд холбогдсон протоны сувгууд нь фитопланктоноос эхлээд хүн хүртэл төрөл бүрийн организмд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг1.Ихэнх эсүүдэд эдгээр сувгууд нь протоны мембранаас протоны гадагшлах урсгалыг зуучилж, NADPH оксидазын үйл ажиллагааг зохицуулдаг. Хүнд мэдэгдэж байгаа цорын ганц хүчдэлтэй протоны суваг. нь HVCN1 генийн бүтээгдэхүүн2,3.Hv1 (VSOP гэх) нь В эсийн тархалт4, төрөлхийн дархлааны системээр реактив хүчилтөрөгчийн төрлүүдийг үйлдвэрлэх5,6,7,8, эр бэлгийн эсэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг нь батлагдсан. хөдөлгөөн9 ба амьсгалын замын гадаргуугийн шингэний рН-ийн зохицуулалт10. Энэ суваг нь B-эсийн хорт хавдар4,11, хөхний болон бүдүүн гэдэсний хорт хавдар зэрэг хэд хэдэн Overexpressed хорт хавдрын төрлүүдэд оролцдог.Hv1-ийн хэт их үйл ажиллагаа нь хорт хавдрын эсүүдийн үсэрхийллийн чадавхийг нэмэгдүүлдэг болохыг тогтоожээ 11, 12 .Тархинд Hv1 илэрдэг. microglia-аар үүсгэгддэг бөгөөд түүний үйл ажиллагаа нь ишемийн харвалтын загваруудад тархины гэмтлийг улам хүндрүүлдэг болохыг харуулсан.
Hv1 уураг нь S1-S414 гэж нэрлэгддэг дөрвөн трансмембран сегментээс тогтсон хүчдэл мэдрэгчтэй домэйн (VSD) агуулдаг. VSD нь хүчдэлийн хамгаалалттай Na+, K+, Ca2+ сувгууд ба хүчдэлд мэдрэмтгий фосфатаза, тухайлбал CiVSP-ийн холбогдох домайнуудтай төстэй. Ciona gutis15. Эдгээр бусад уургуудад S4-ийн C-төгсгөл нь эффектор модуль, нүх сүв эсвэл ферменттэй холбогддог. Hv1-д S4 нь мембраны цитоплазмын тал дээр байрлах ороомогтой ороомогтой (CCD) холбогддог. .Суваг нь хоёр VSD-ээс бүрдэх димерийн цогцолбор бөгөөд тус бүр нь хаалгатай протоны нэвчилтийн замыг агуулсан байдаг16,17,18. Эдгээр хоёр Hv1 дэд нэгж нь хамтран нээгддэг нь тогтоогдсон19,20,21,22 нь аллостерийн холболт болон дэд нэгж хоорондын харилцан үйлчлэлийг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. ороомогтой ороомгийн домэйн доторх дэд нэгжүүдийн хоорондын интерфэйс нь маш сайн тодорхойлогддог, учир нь тусгаарлагдсан хоёр домэйны талст бүтэц боломжтой байдаг22,23. Нөгөө талаар мембран доторх VSD-ийн хоорондох интерфейс нь тийм ч чухал биш юм. сайн ойлгосон. Hv1-CiVSP химер уургийн талст бүтэц нь энэ интерфейсийн талаар мэдээлэл өгөхгүй, учир нь талстжсан сувгийн цогцолборын тримерик зохион байгуулалт нь төрөлхийн Hv1 CCD-ийг мөөгөнцрийн лейцин цахилгаан товч GCN424-ээр сольсны үр дүнд үүсч болно.
Hv1 сувгийн дэд нэгжийн зохион байгуулалтыг саяхан хийсэн судалгаагаар хоёр S4 спираль нь хоёрдогч бүтцийг ноцтой тасалдуулалгүйгээр CCD руу шилждэг бөгөөд үүний үр дүнд мембранаас эхлээд цитоплазм руу шилждэг урт мушгиа үүсдэг. Цистеины хөндлөн холбоосын шинжилгээнд үндэслэн, Энэхүү судалгаа нь Hv1 VSD-ууд S4 сегментийн дагуу бие биетэйгээ холбогдохыг санал болгож байна. Гэсэн хэдий ч бусад судалгаанууд VSD-ийн хооронд өөр интерфэйсийг санал болгосон. Эдгээр интерфэйсүүд нь S1 сегмент 17, 21, 26 болон S2 сегментийн 21-ийн гаднах төгсгөлүүдийг агуулдаг. Зөрчилдөөний боломжит шалтгаан. Эдгээр судалгааны үр дүн нь VSD-ийн хоорондох аллостерик холболтыг хаалттай ба нээлттэй төлөвөөс хамаардаг хаалганы үйл явцтай холбоотой судалж үзсэн бөгөөд VSD-ийн хоорондын интерфейс нь конформацийн янз бүрийн төлөвийн өөрчлөлтөөс хамаарч өөр өөр байж болно.
Эндээс бид 2-гуанидинотиазол нь хоёр нээлттэй VSD-тэй синергетик байдлаар холбогдож Hv1 сувгийг дарангуйлдаг болохыг олж мэдсэн бөгөөд нээлттэй төлөвт байгаа дэд нэгжүүдийн хоорондын харилцан үйлчлэлийг шалгахын тулд нэгдлүүдийн нэг болох 2-гуанидинобинзотиазолыг (GBTA) ашигласан. интерфэйс. Бид GBTA холбох муруйг тоон загвараар сайн тайлбарлаж болохыг олж мэдсэн бөгөөд үүнд дарангуйлагчийг нэг дэд нэгжтэй холбосноор зэргэлдээх дэд нэгжийн холбогдох хамаарал нэмэгддэг. Мөн бид D112 үлдэгдэл, сонгомол шүүлтүүрүүд болохыг олж мэдсэн. суваг 27, 28 болон гуанидины деривативыг холбох сайтын 29-р хэсэг нь GBTA холбох хамтын ажиллагааг хянадаг.Бид CCD нь S4 сегментээс тусгаарлагдсан Hv1 dimer-д хоршооны холболт хадгалагдаж байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь CCD дахь дэд нэгж хоорондын интерфэйс нь шууд биш гэдгийг харуулж байна. GBTA холбогч хэсгүүдийн хоорондох аллостерийн холболтыг зуучилна. Үүний эсрэгээр бид S1 фрагмент нь дэд хэсгүүдийн хоорондох интерфейсийн нэг хэсэг болохыг олж мэдсэн бөгөөд S4 мушгиагийн эсийн гаднах төгсгөлийг димерийн төвөөс хол зайд байрлуулахыг санал болгож байна. S1 фрагмент нь нээлттэй төлөвт байна.
Hv1-ийн жижиг молекул дарангуйлагчид нь хорт хавдрын эсрэг эм, мэдрэлийн хамгаалалтын бодис болгон хэрэглэхэд тустай. Гэсэн хэдий ч өнөөг хүртэл цөөхөн нэгдлүүд сувгийг 30,31,32,33 дарангуйлж чадсан байна.Тэдгээрийн дотор 2-гуанидинобензимидазол (2GBI, нэгдэл [1] Зураг дээр) 1a) болон түүний деривативууд нь VSD29,32 сувгаар протоны нэвчилтийг хаадаг болохыг тогтоожээ.Ийм нэгдлүүдийн холболт нь хоёр нээлттэй дэд нэгжид бие даан явагддаг гэж үздэг.2-гуанидинобэнзотиазол (Зураг 1а дахь ГБТА, нэгдэл [2]). Өмнө нь Hv1-ийг 200 мкМ концентрацид туршиж үзэхэд бараг 2GBI шиг үр дүнтэйгээр дарангуйлдаг болохыг харуулсан (Зураг 1b). Бид бусад тиазолын деривативуудыг судалж үзээд тэдгээрийн зарим нь GBTA-тай ижил эсвэл илүү хүчтэй сувгийг дарангуйлдаг болохыг олж мэдсэн (Зураг 1 ба Нэмэлт). текст).Бид дөрвөн тиазолын деривативын (ГБТА ба нэгдлүүд [3], [6] ба [11], 1в-р зураг) концентрацийн хариу урвалын муруйг тодорхойлж, тэдгээр нь 2GBI-аас илүү эгц болохыг олж мэдсэн. The Hill коэффициент (h) тиазолын деривативын хэмжээ 1.109 ± 0.040-аас 1.306 ± 0.033 хооронд хэлбэлзэж байна (Зураг 1). 1c ба Нэмэлт зураг 1). Үүний эсрэгээр, 2GBI-ийн Hill коэффициент нь 0.975 ± 0.024 29, Зураг 2a ба Нэмэлт зураг 1. 1-ээс дээш байгаа Хилл коэффициент нь холболтын хамтын ажиллагааг илэрхийлдэг. Учир нь Hv1 дэд нэгж бүр өөрийн дарангуйлагчтай- холбох газар,29,32 бид тиазолын деривативыг нэг дэд нэгжтэй холбох нь хоёр дахь дарангуйлагч молекулыг зэргэлдээх дэд нэгжтэй холбохыг сайжруулж чадна гэж бид үзсэн. ГБТА нь хамгийн өндөр Хилл коэффициенттэй туршилтын нэгдэл байсан. Тиймээс бид энэ нэгдлийг сонгосон. цаашид холбох синергетик механизмыг судалж, 2GBI-ийг сөрөг хяналтын лавлагаа болгон ашигласан.
(a) Туршилтын нэгдлүүд: [1] Hv1 дарангуйлагч 2-гуанидино-бензимидазол (2GBI).[2] 2-гуанидино-бензотиазол (ГБТА), [3] (5-трифторметил-1,3-бензотиазол-2-ил) гуанидин, [4] нафто[1,2-д][1, 3] Тиазол-2-ил -гуанидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [6](5-бромо-4-метил-1,3-тиазол- 2-ил)гуанидин, [7] фамотидин, [8] 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилын хүчил этилийн эфир, [9] 2-гуанидино-4-метил этил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10] ](2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)этил ацетат, [11]1-[4-(4-Хлорофенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин.(б) Заасан гуанидинотиазолууд болон лавлагаа нэгдэл 2GBI (цэнхэр-ногоон баар) хүний Hv1 идэвхийг дарангуйлах .Hv1 протоны гүйдлийг -80 мВ-аас +120 мВ хүртэл хадгалах потенциалаас деполяризацийн хариуд Xenopus ооцитуудын дотор талын товруунд хэмжсэн. Дарангуйлагч бүрийг 200 μM.pHi = pHo = 6.0 концентрацитай ваннд нэмсэн. .Өгөгдөл нь дундаж±SEM (n≥4) байна.(c) Хүний Hv1-ийн нэгдлүүдийн концентрацаас хамааралтай дарангуйлал [2], [3], [6] болон [11]. Цэг бүр нь ± SD 3-ын дундаж дарангуйллыг илэрхийлнэ. 15 хэмжилт хүртэл. Энэ шугам нь Нэмэлт хүснэгт 1-д тайлагнасан Kd-ийн илэрхий утгыг олж авахад хэрэглэгддэг Хилл тохируулга юм. Уулын коэффициентийг нэмэлт 1-р зурагт тайлагнасан тохируулгаас тодорхойлсон: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ±. 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (Аргачлалыг үзнэ үү).
(a,b) 2GBI болон GBTA нэгдлүүд димер болон мономер Hv1-ийг концентрацаас хамааралтай байдлаар дарангуйлдаг. Цэг бүр нь 3-8 хэмжилтийн дундаж дарангуйлал ± SD-ийг илэрхийлдэг ба муруй нь Hill-д нийцсэн байна. Оруулсан гистограммуудыг нэмэлт 3 ба 4-р зурагт мэдээлсэн тохиролоос тодорхойлсон. (a)-д үзүүлсэн GBTA-ийн концентрацийн хариу нь Зураг 1в-д үзүүлсэнтэй ижил байна. Илэрхий Kd утгыг Нэмэлт Хүснэгт 1-ээс үзнэ үү.(c) Загварчлал GBTA-ийн димерик Hv1-тэй хамтарсан холболт. Хатуу хар шугам нь (d)-д үзүүлсэн холбох загварыг тодорхойлсон тэгшитгэл (6)-аар туршилтын өгөгдөлд тохирохыг илэрхийлнэ. Дэд 1 ба Дэд 2-р тэмдэглэсэн тасархай шугамууд нь бимолекулын холбоог илэрхийлнэ. -эхний болон хоёр дахь холболтын үйл явдлын диссоциацийн тэнцвэрийн муруй (Дэд 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Дэд 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(г) Hv1 блокийн санал болгож буй механизмын бүдүүвч диаграм. GBTA-ийн хувьд нэг нээлттэй дэд нэгжтэй холбогдох нь зэргэлдээх нээлттэй дэд нэгжийн хамаарлыг нэмэгдүүлдэг (Kd2
ГБТА-ийн сувагтай хамтарсан холболтыг тоон хувьд тодорхойлохын тулд бид аль нэг дэд нэгж нь Kd1 диссоциацийн тогтмолтай хоёр молекулын урвалын дараа эхний дарангуйлагч молекулыг холбож чаддаг загварыг ашигласан (Зураг 2c, Дэд 1, OO+ B ⇆ BO*). Холбох нь суваг нь Kd2 диссоциацийн тогтмолтай хосгүй бимолекулын урвалын дараа үлдсэн хоосон дэд нэгжүүд дарангуйлагчтай холбогддог төлөвт шилжихэд хүргэдэг ба энд Kd2 Зураг 2c дээрх цул хар шугам нь загварын тэгшитгэлийн туршилтын концентраци хариу урвалын муруйтай таарч, Kd1 нь ~290 μM, Kd2 нь ~29 μM (Аргачлалын хэсэг, тэгшитгэл (6)) өгөгддөг. Загвар нь мөн тайлбарлав. 2GBI-ийн холболт, энд Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Зураг 2d). Мономер Hv1-д зөвхөн нэг холбох газар ба нэг Kdm (O° + B ⇆ B°) байдаг. GBTA-ийн хувьд Kdm нь 54 орчим байна. μM, энэ нь Kd2-ээс Kd1-тэй илүү төстэй (Зураг 2d). Өөрөөр хэлбэл, мономерыг холбох газар нь бага-аас илүү өндөр хамааралтай төлөвтэй (BO*) төстэй тохиргоонд (O°) байна. Димерийн ойр дотно байдал (OO) нь дэд нэгжүүдийн хоорондын интерфейсийг арилгасантай холбоотой юм.
Өмнө нь 2GBI32-д үзүүлсэнчлэн GBTA нь суваг нээхэд хүндрэл учруулахаас илүү нээлттэй үед нь хааж Hv1 гүйдлийг дардаг болохыг олж мэдсэн (Нэмэлт зураг. 2a,b,d). мембраны реполяризацийн хариу үйлдэл боловч GBTA-д энэ үзэгдэл ажиглагдаагүй (Нэмэлт зураг 2c). 2GBI-ийн дэргэд Hv1 идэвхгүй болох үед блокатор нь холбох газраас гарах хүртэл дэд нэгж бүрийн хаалга хаагдах боломжгүй (" хөлийн хаалга” механизм) ба 2GBI нь хаалганууд хаагдсанаас удаан тайлагддаг.Хэрэв нэг Hv1 дэд нэгжийг хааж, хаасан бол зэргэлдээх дэд нэгж нь бөглөрсөн хэвээр байвал үлдсэн 2GBI молекулуудын задрах нь удааширна (хориглогч барих). Урт насалдаг сувгийн төрлүүд Зөвхөн нэг блоклогдсон дэд нэгж нь хаагдахын өмнө протоныг түр зуур дамжуулж, аажмаар ялзарч буй сүүлний гүйдэлд чухал хувь нэмэр оруулдаг.
GBTA (Нэмэлт зураг 2c) байгаа үед Hv1 сүүлний гүйдлийн задрал нь мэдэгдэхүйц удаашраагүй гэсэн дүгнэлт нь энэ хориглогчийг синергетик холбох механизмтай нийцэж байна (Зураг 2d). Нэгэнт GBTA молекул Hv1 дэд нэгжээс салгагдана. , блоклогчийн зэргэлдээ дэд нэгжтэй ойртох чадвар 10 дахин буурч, задлах процессыг дэмжинэ. Энэ нь GBTA-ийн хоёр дахь молекул сувагт баригдахаас өмнө задрах магадлал хамаагүй өндөр байна гэсэн үг юм. Урт насалдаг сувгийн төрөл зүйл. Зөвхөн нэг блоклох дэд нэгжийг үүсгэдэг бөгөөд энэ нь GBTA байгаа тохиолдолд 2GBI-тэй харьцуулахад илүү их байх бөгөөд энэ нь сүүлний гүйдэл хурдан задрахад хүргэдэг.
GBTA нь Hv1 дэд хэсгүүдтэй хамтран ажиллахын тулд холбох газрууд нь аллостерийн хосолсон байх ёстой. Холбох газар бүр нь дараах чадвартай байх ёстой: 1) дарангуйлагчтай холбогдсон зэргэлдээх дэд хэсгүүдтэй холбогдох үйл явдлын гинжин хэлхээг өдөөх, 2) зуучлах. бага наалдацаас өндөр наалдацтай холбох руу шилжинэ. Хэрэв холбох талбайн доторх тодорхой үлдэгдэл нь хамтын үйл явцад нөлөөлсөн бол тэдгээрийн мутаци нь Hv1-ийг дарангуйлах GBTA-ийн концентраци-хариу муруйн Hill коэффициентийг өөрчлөх ёстой гэж бид үзсэн. D112, F150 үлдэгдэл. , S181 ба R211 нь 2GBI29 холбох орчны нэг хэсэг болохыг өмнө нь харуулсан бөгөөд бид GBTA-г холбоход ижил төстэй байдлаар оролцоно гэж бид таамаглаж байсан (Зураг 3A). Бид мутант сувгуудын D112E, F150A, S181A-д GBTA-ийн дарангуйлагч концентраци-хариу муруйг хэмжсэн. , болон R211S (Зураг 3) ба тэдгээрийн Hill коэффициентийг Hv1 зэрлэг төрлийнхтэй харьцуулж, 2GBI-г лавлагаа болгон ашигласан. V109 үлдэгдэл нь S1 сегментийн D112-той ижил нүүрэн дээр байгаа бөгөөд үүр дотор нэг нэмэлт мушгиа эргэлттэй байна. V109 нь 2GBI29-ийг холбоход оролцоогүй, бид V109A мутантыг хяналт болгон ашигласан (Зураг 1). 3б).
(a) Гуанидины деривативыг холбоход оролцдог санал болгож буй Hv1 үлдэгдэл. Тасархай цэнхэр муруйнууд нь 2GBI29 нэгдлийн өөр өөр хэсгүүдтэй харилцан үйлчилдэг өмнө нь санал болгосон хажуугийн гинжийг хүрээлдэг.(bf) 2GBI (цэнхэр) ба GBTA ( нэгдлүүдээр заасан Hv1 мутантуудын концентрацаас хамааралтай дарангуйлал) бараан улаан). Цэг бүр нь сөрөг хяналт болох 3-12 хэмжилтийн ± SD V109-ийн дундаж дарангуйллыг илэрхийлнэ. Муруйнууд нь Kd-ийн илэрхий утгыг олж авахад ашигладаг Hill таарч байна (Нэмэлт Хүснэгт 1-ийг үзнэ үү). Хилл коэффицент (h) -д үзүүлсэн. Оруулсан гистограммуудыг нэмэлт зураг 3 ба 4-т тайлагнасан тохирлоор тодорхойлсон. Hv1 WT-ийн лавлагааны h утгыг тасархай шугамаар харуулав. Од тэмдэг нь мутант болон WT хэсгүүдийн хоорондын статистикийн ач холбогдолтой ялгааг харуулж байна (p D112E мутаци нь GBTA-ийн зэрлэг төрөлтэй (Зураг 3c ба Нэмэлт зураг 3, 4) харьцуулахад Хилл коэффициентийг (p GBTA-ийн холболтын Hill коэффициент нь Hv1 димерт 1-ээс их бөгөөд мономер сувагт ~1 болдог (Зураг 2б) нь хоёр дэд нэгж дэх холбох газруудын хооронд аллостерийн харилцан үйлчлэл байгаатай нийцэж байна.Хэрэв энэ нь Энэ тохиолдолд блокаторын нэг дэд нэгжтэй холбогдсон димертэй GBTA-ийн холбогдох Hill коэффициент нь ~1 байх ёстой. Бид энэ таамаглалыг Hv1 F150A-WT холбогч димерт (Зураг 4а) туршсан бөгөөд F150A-ийн хамаарал GBTA-ийн дэд нэгж нь WT дэд нэгжийнхээс 2-оос дээш тушаалаар их байсан (Зураг 1c ба 3d). Дараа нь бид 2 μM GBTA-ийн суурь концентрацид WT дэд нэгжийг дарангуйлах концентраци-харилын муруйг хэмжсэн. Энэ концентрацид , хориглогч нь F150A дэд нэгжийн ойролцоогоор 99% ба WT дэд нэгжийн (a) Блоклох хагас сувгийг ({F150A}b-WT/BAO*) үүсгэхэд ашигладаг F150A-WT уулзвар димерийн бүдүүвч диаграмм нь цагаан алмааз нь мутацийн байршлыг харуулж байна. BAO* ба BA*B* төлөвт, F150A дэд нэгжийн ойр дотно байдал нь WT дэд нэгжийнхээс өндөр байх төлөвтэй байна.(b) F150A-WT сувгуудын протоны гүйдлийг -80 мВ-аас +120 мВ хүртэлх мембраны потенциалын өөрчлөлтийн хариуд хэмждэг.pHi = pHo = 6.0 .Саарал ул мөр нь дарангуйлагч байхгүй үед хэмжсэн гүйдлийг илэрхийлнэ. Хар ул мөр (хяналт) нь 2 мкМ GBTA нэмсний дараа хэмжсэн гүйдлийг илэрхийлнэ. Энэ концентрацид WT дэд нэгж мэдэгдэхүйц дарагдаагүй байхад F150A дэд хэсэг нь GBTA-тай бараг бүрэн холбогддог. ({F150A}b-WT). ГБТА концентрацийн цаашдын өсөлт нь WT дэд нэгжийг (улбар шар ба улаан ул мөр) бөглөрөхөд хүргэсэн.(в) {F150A}b-WT димерийн концентрацаас хамааралтай дарангуйлал (дарангуйлагч F150A дэд нэгж).Цэг бүр нь 3-7 хэмжилтийн дундаж дарангуйлал ± SD-ийг илэрхийлнэ. Муруйнууд нь Нэмэлт хүснэгт 1-д тайлагнасан Kd-ийн илэрхий утгыг олж авахын тулд ашигласан Хилл фитүүд байв. Гистограммд үзүүлсэн Хилл коэффициентийг нэмэлт зураг 3 ба 4-т тайлагнасан тохиролоос тодорхойлсон. Hv1 WT-ийн h утгууд нь байна. тасархай шугамаар харуулав.Од тэмдэг нь WT dimer Hv1-тэй харьцуулахад статистикийн ач холбогдолтой ялгааг харуулж байна (p Hv1-ийн GBTA дарангуйллыг нээлттэй сувагт хэмжсэн тул бид GBTA-г холбох хамтын ажиллагааг нээлттэй төлөвт дэд нэгж хоорондын холболтын механизмыг судлахад ашиглаж болно гэж үзсэн. Эдгээр хоёр Hv1 дэд нэгж нь өмнө нь 19,20,21, 22 болон хаалганы үйл ажиллагаанд оролцдог дэд нэгж хоорондын холболтыг цитоплазмын ороомог ороомог домэйн (CCD) 22,25-аар зуучлахыг санал болгосон.Тиймээс бид CCD нь нээлттэй төлөвт GBTA-тай холбогдох газруудын хоорондох холболтод оролцож байгаа эсэхийг асуув.Триглицин S4 трансмембран фрагмент ба ороомог ороомгийн домэйны хоорондох интерфэйс дэх мутацуудыг димеризацийн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахын зэрэгцээ сувгийн бусад хэсгээс салгах зорилгоор өмнөх судалгаанд харуулсан. Тиймээс бид V220G, K221G, T222G мутацийн үр нөлөөг туршиж үзсэн (Зураг 1). 5a, GGG мутант) GBTA binding cooperativity. Бид зэрлэг төрлийн (Зураг. 5c) харьцуулахад GBTA холболтын Hill коэффициент нь статистикийн хувьд ач холбогдол багатай (p > 0.05) буурч байгааг олж мэдсэн нь хэдийгээр Хоёр дэд нэгж хамтдаа чухал боловч CCD нь GBTA холбогч хэсгүүдийн хоорондох дэд нэгж хоорондын аллостерик холболтыг шууд зуучлахгүй.
(a) Цитоплазмын ороомогтой ороомгийн домэйн (цэнхэр сум)-аар үүсгэгдсэн дэд нэгж хоорондын холболтыг тасалдуулах зорилготой S4-ийн дотоод төгсгөлд триглициний мутаци бүхий Hv1 димерийн бүдүүвч диаграмм. (б) дэд нэгжүүдийн хоорондын холболтод оролцдог S1 фрагментуудыг турших зорилготой заасан мутаци (цэнхэр сум).(c–h) 2GBI (цэнхэр) ба GBTA (хар улаан) нь заасан бүтцийг концентрацаас хамааралтай байдлаар дарангуйлдаг. Цэг бүр нь дундаж дарангуйллыг илэрхийлдэг. ± SD 3-аас 10 хэмжилт. Муруй нь Kd-ийн илэрхий утгыг олж авахад хэрэглэгддэг Hill fit (Нэмэлт Хүснэгт 1-ийг үзнэ үү). Интерполяцлагдсан гистограмм дахь толгодын коэффициентийг Аргачлалын хэсэгт тайлбарласны дагуу тодорхойлсон (Нэмэлт 3 ба 4-р зургийг үзнэ үү). h утгыг лавлана. Hv1 WT нь тасархай шугамаар харагдаж байна. Од тэмдэг нь мутант болон WT хэсгүүдийн хоорондын статистикийн ач холбогдолтой ялгааг харуулж байна (p Бид CCD-ийг GBTA хоршооллын шууд зуучлагч гэж үзэн бид VSD-ийн хоорондын харилцан үйлчлэл нь холбох газруудын хоорондох аллостерийн холболтод оролцож байгаа эсэхийг асуув. Бид GBTA-ийн холболтыг D112 үлдэгдлийн (Зураг 3c) консерватив мутацаар устгасан болохыг олж мэдсэн. S1 трансмембран сегментэд.S1 нь мушгиа нь D112-той ижил тал дээр байрладаг, гэхдээ фрагментийн гадна талын 24-р төгсгөлд ойр байрлах E119 ба D123 гэсэн өөр хоёр сөрөг цэнэгтэй үлдэгдлийг агуулдаг. Молекулын динамикийн эхэн үеийн загварчлалууд нь эдгээр үлдэгдэл хоорондоо холбоотой болохыг харуулсан. Усны шугамаар D112 руу36,37.Тиймээс бид E119 ба D123 нь GBTA-тай холбогдох газруудын хоорондох аллостерийн холболтод оролцож байгаа эсэхийг шалгасан (Зураг 5б). Сөрөг хяналтын хувьд бид D123-ын ойролцоо байрлах хадгалагдсан эерэг цэнэгтэй K125 байрлалыг туршсан. харин S1 мушгианы нөгөө талд (Зураг 5б).
Бид E119A, D123A, K125A сувгуудын концентрацаас хамааралтай дарангуйллыг 2GBI болон GBTA-аар хэмжсэн бөгөөд E119A болон K125A мутаци нь зэрлэг төрлийнхтэй харьцуулахад аль нэг дарангуйлагчийн Hill коэффициентийг мэдэгдэхүйц өөрчлөөгүй болохыг олж мэдсэн (p > 0.05, Зураг 5d, i ) ). Нөгөөтэйгүүр D123A мутаци нь GBTA-ийн Hill коэффициентийг мэдэгдэхүйц бууруулсан (p 0.05/14).
Хоёр дэд нэгжийн 123-р байрлал дахь цэнэгийг саармагжуулснаар GBTA-ийн холболтын хамтын ажиллагаанд хүчтэй өөрчлөлт гарч, харин хоёр дэд нэгжийн цэнэгийг буцаах нь бага зэрэг нөлөө үзүүлсэн тул бид дүн шинжилгээг зөвхөн урвуу суваг бүхий зөвхөн нэг дэд нэгжийг багтаахаар өргөтгөсөн. C-терминал дэд нэгжид D123R орлуулалттай Hv1-холбогдсон димерүүдийг үүсгэсэн (Зураг 5б) ба концентраци-хариу дарангуйллыг GBTA болон 2GBI-ээр хэмжсэн. Бид GBTA-ийн WT-D123R сувгуудтай холбогдох Hill коэффициент нь үүнээс хамаагүй өндөр болохыг олж мэдсэн. зэрлэг төрлийн Hv1 (p Мөн D112E мутаци нь WT-D123R дэвсгэрийн үүсгэсэн GBTA-холбогч Hill коэффициентийн өсөлтийг цуцалсныг бид олж мэдсэн (Зураг 5b,h ба Нэмэлт зураг. 4). 2GBI холболтын Hill коэффициентийн нөлөөллийг мөн арилгасан (Зураг. Зураг. 5h ба Нэмэлт зураг. 3). Эдгээр олдворууд нь 123-р байрлал дахь эсрэг цэнэгийн улмаас үүссэн дэд нэгжүүдийн хоорондын сайжруулсан аллостерийн холбоо нь D112 байрлал дахь холболтын хэсэг эвдэрсэн үед илүү хүчтэй холбох хамтын ажиллагаа болж хувирдаггүй болохыг харуулж байна.
Хэрэв зэргэлдээх задгай дэд нэгжүүд дээрх D123 үлдэгдэл бие биетэйгээ электростатикаар харилцан үйлчлэхэд хангалттай ойрхон байвал сөрөг цэнэгийн хоорондох түлхэлтийн харилцан үйлчлэл нь аспарагины хүчлийг аргинин болгон орлуулах замаар сөрөг ба эерэг цэнэгийн хослол болж хувирна гэж бид үзсэн. тэдгээрийн хоорондын сонирхол татахуйц харилцан үйлчлэл.Нэг дэд нэгж (WT-D123R dimer).Сэтгэл татахуйц харилцан үйлчлэл нь S1 фрагментийн гаднах төгсгөлүүдийн хоорондох интерфэйсийг бэхжүүлж, дэд нэгжүүдийн хооронд илүү хүчтэй аллостерийн холбоог бий болгож, GBTA-ийн холболтыг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэг.
Энэхүү таамаглалыг батлахын тулд бид 123-р байрлал дахь цэнэгийн шилжилтээс ялгаатай S1 сегментийн гадна талын төгсгөлүүдийн хоорондох интерфэйсийг бэхжүүлэх арга замыг эрэлхийлэв.Ли нар Hv1 үлдэгдэл I127-ийн цистеин руу мутаци урьд өмнө илэрсэн. аяндаа дэд нэгж хоорондын хөндлөн холбоос үүсэхэд хүргэдэг17.Цаашилбал, Hv1-CiVSP химерик VSD-ийн болор бүтэц нь I127 нь S1 геликсийн гаднах төгсгөлөөс зөвхөн нэг үлдэгдэлээр тусгаарлагдаж байгааг харуулж байна24. Тиймээс бид хооронд ковалент холбоо үүсэх эсэхийг асуув. 127-р байрлалд байгаа цистеинууд нь S1-S1-ийн илүү хүчтэй харилцан үйлчлэлд хүргэх төлөвтэй байгаа нь 123-р байрлал дахь цэнэгийг өөрчилснөөр ажиглагдсантай адил GBTA-г холбох хамтын ажиллагаанд нөлөөлдөг.
Бид Hv1 I127C-ийн концентрацаас хамааралтай дарангуйллыг GBTA болон 2GBI-ээр 10 мМ β-меркаптоэтанол (βME) байгаа болон байхгүй үед хэмжсэн (Зураг 6a). Эсийн доторх уусмалд дарангуйлагчийг нэмэхтэй зэрэгцэн бууруулагч бодисыг эсийн гаднах уусмалд нэмнэ. Зөвхөн нэг дэд нэгжид цистеин орлуулагчтай холбосон димерийг (WT-I127C) сөрөг хяналт болгон ашигласан (Зураг 6a). Бид аяндаа дэд нэгж хоорондын хөндлөн холбоосын үр нөлөөг хэмжиж чадсангүй. 2GBI дарангуйлах I127C дэд нэгжүүдийн хооронд, учир нь I127C-ийн Hv1-тэй холбогдох βME-тэй эсвэл βME-гүй Хилл коэффициент нь моноцистеиноор орлуулсан димерүүдтэй холбогдохоос эрс ялгаатай байв. Хилл коэффициент нь WT-I127C-ийг ялгаж чадаагүй (Зураг 6б ба Нэмэлт зураг. 3). Үүний эсрэгээр бид GBTA-ийн дарангуйлалд аяндаа үүссэн дэд нэгж хоорондын хөндлөн холбоосын гайхалтай нөлөөг хэмжсэн. βME байхгүй үед Hv1 I127C-тэй холбогдох Хилл коэффициент (crosslink on) нь βME (crosslink off) эсвэл димерийг холбохын тулд WT-127C ашиглан (хөндлөн холбоос байхгүй үед) хэмжсэн хэмжээнээс хамаагүй өндөр байсан (Зураг 6c ба Нэмэлт зураг 4), энэ нь аллостерик холболт байгааг харуулж байна. S1 хэлтэрхийнүүдийн гаднах төгсгөлүүдийн хооронд дисульфидын холбоо үүссэнээр холболтын газруудын хоорондын холболт ихээхэн нэмэгддэг. Эдгээр үр дүн нь WT-D123R димерийн 123-р байрлалд аспартат ба аргинины цахилгаан статик харилцан үйлчлэл нь хоорондоо аллостерик холболтыг нэмэгдүүлдэг гэсэн бидний тайлбарыг дэмжиж байна. дэд нэгжүүд.
Нээлттэй төлөвийн холболт нь хоёр дэд нэгж дэх S1 сегментийн гаднах төгсгөлүүдийн хоорондох шууд физик харилцан үйлчлэлээр дамждаг.
(a) Дэд хэсэг хоорондын цистеины хөндлөн холбоос нь GBTA-г холбох хамтын ажиллагаанд хэрхэн нөлөөлж байгааг судлах зорилготой мутант Hv1 димер ба холбогч димерүүдийн бүдүүвч дүрслэл. (bd) 2GBI (b,d) болон GBTA (c, д) эсийн гаднах уусмалд 10 mM βME байгаа эсэх. Цэг бүр нь 3-10 хэмжилтийн дундаж дарангуйллыг ± SD-ийг илэрхийлнэ. Муруй нь Kd утгыг олж авахад ашигласан Hill fit (Нэмэлт Хүснэгт 1-ийг үзнэ үү). Оруулсан гистограмм дахь толгодын коэффициентийг нэмэлт 3 ба 4-р зурагт мэдээлэгдсэн тохиролоос тодорхойлсон. (c,e) дахь одууд нь статистикийн ач холбогдолтой ялгааг харуулж байна. GBTA дарангуйлах янз бүрийн нөхцлүүдийн хооронд (p 0.05).
Мөн βME байхгүй үед GBTA-ийн D112E I127C Hv1 димертэй холбогдох Хилл коэффициент нь бууруулагч бодис (Зураг 6e ба Нэмэлт зураг 4) байгаа үед хэмжсэнээс хамаагүй өндөр байсныг бид олж тогтоосон нь D112E мутаци гэсэн үг юм. цистеины 127-ийн хөндлөн холбоосын үр дүнд GBTA-г холбох хамтын ажиллагааны өсөлтийг зогсоосонгүй. D112E, I127C Hv1 димерүүдтэй холбогдох 2GBI-ийн Hill коэффициент нь мөн D112E мутацад мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлээгүй (Зураг 1). 6d ба Нэмэлт. Зураг 3).
Эдгээр олдворуудыг нэгтгэн авч үзвэл GBTA-ийн холболтыг зэргэлдээх Hv1 дэд хэсгүүдийн S1 хэлтэрхийнүүдийн гаднах төгсгөлүүдийн хоорондын харилцан үйлчлэл нь цахилгаан статик харилцан үйлчлэлээр эсвэл орлуулсан цистеины хооронд ковалент холбоо үүсэх замаар нэмэгддэг болохыг харуулж байна. D112E мутаци нь хамтын ажиллагаанд сэтгэл татам электростатик харилцан үйлчлэлийн үр нөлөөг арилгах боломжтой боловч ковалент бондын нөлөөг арилгах боломжгүй юм.
Гуанидины деривативыг Hv1 сувагт холбох химийн орон зайг судлахдаа GBTA зэрэг 2-гуанидинотиазолууд нь 2-гуанидинобензимидазолуудаас илүү өндөр концентрацитай болохыг олж мэдсэн (Зураг 1c). ба мономер сувгууд (Зураг 2a,b) ба нэг дэд нэгж нь дарангуйлагчтай урьдчилан холбогдож байсан димер суваг (Зураг 4) нь GBTA-ийн Hv1-ийг дарангуйлах нь үйл ажиллагаа нь синергетик процесс бөгөөд ба Хоёр дэд нэгж дэх нэгдлүүдийн холбох газрууд нь аллостерийн хосолсон байдаг. Өмнө нь холбогдох нэгдэл 2GBI32-д үзүүлсэн шиг GBTA нь нээлттэй сувагтай холбогддог болохыг олж мэдсэн нь аллостерийн холболтыг нээлттэй төлөвт тусгайлан үнэлэх боломжтой болохыг харуулж байна. Манай хамтын ажиллагааны загвар нь GBTA-ийн Hv1-ийн дарангуйллыг тоон хувьд тайлбарлаж чадсан (Зураг 2c) ба мембраны реполяризацийн дараа сувгийн сүүлний гүйдлийн задралд 2GBI ба GBTA-ийн янз бүрийн нөлөөг тайлбарлаж чадсан нь холбох үйл явцын талаарх бидний тайлбарыг дэмжиж байна.
Хоёр холбох газартай (Hv1 гэх мэт) аллостерик уурагт хүрч болох хамгийн их Hill коэффициент нь 2. Бид GBTA-ийг Hv1 зэрлэг төрлийн 1.31 коэффициенттэй холбохын тулд хэмжсэн бөгөөд Hv1 I127C-д 1.88 болж өссөн. синергетик чөлөөт энерги буюу хамгийн бага ба хамгийн их хамааралтай газруудын холбох чөлөөт энергийн ялгаа (Аргачлалыг үзнэ үү) Hv1 зэрлэг төрлийн хувьд 1.3 ккал/моль, Hv1 I127C-ийн хувьд 2.7 ккал/моль байв. Хүчилтөрөгчийг гемоглобинд хүргэх нь хамтын үйл явцын хамгийн алдартай бөгөөд сайн судлагдсан жишээ юм38. Хүний гемоглобины хувьд (аллостерийн хосолсон дөрвөн цэг бүхий тетрамер) Хилл коэффициент нь 2.5-3.0 хооронд хэлбэлзэж, 1.26-аас 3.64 хооронд хэлбэлздэг. Туршилтын нөхцлөөс хамааран ккал/моль38. Иймээс дэлхийн энергийн хувьд хоёр систем дэх уургийн дэд нэгжийн өөр өөр тоог авч үзвэл GBTA-ийн Hv1-тэй холбогдох хамтын ажиллагаа нь O2-ийн гемоглобинтой холбогдохоос тийм ч их ялгаатай биш юм.
Манай синергетик загварт GBTA молекулуудыг нэг дэд нэгжтэй холбосноор зэргэлдээх дэд нэгжийн холболтын хамаарал нэмэгддэг. Бид эхний холболтын үйл явдлын үр дүнд үүссэн холбох орчныг өөрчлөн зохион байгуулах үйл явцыг төсөөлж байна. Дэд хэсгүүдийн хоорондын харилцан үйлчлэлийн өөрчлөлт.Эдгээр өөрчлөлтийн хариуд зэргэлдээх дэд нэгжүүд нь холбогдох газруудаа өөрчилснөөр GBTA-г чангаруулдаг.Энэ процессын явцад S1 аспартат D112 нь холболтын ойр дотно байдал ихсэхтэй холбоотой холболтын талбайн дахин зохицуулалтыг хариуцдаг.D112 Өмнө нь Hv1 протоны нэвчүүлэх замын нэг хэсэг бөгөөд сонгомол шүүлтүүрийн үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулсан27,28. Бидний үр дүнгээс үзэхэд Hv1-ийн хоёр дэд нэгж дэх сонгомол шүүлтүүрүүд нь нээлттэй төлөвт аллостерийн хосолсон байна. Зураг 7а-д GBTA холбох талбайн ойролцоо байршил болон D112, D123, K125, I127 үлдэгдлийн байршлыг Hv1 VSD-ийн схем дээр харуулав. Hv1-CiVSP химерийн болор бүтэц дээр. S1-ийн эсийн гаднах төгсгөлийг хамарсан аллостерик холболтын санал болгож буй чиглэлийг хар сумаар харуулав.
(a) Hv1 VSD-ийн бүдүүвч. Hv1-CiVSP химерийн болор бүтэц дээр тулгуурлан мушгиа сегментүүд нь цилиндр хэлбэртэй байна. Энэ тохиргоонд S4 сегментийн дотоод төгсгөл нь CCD-тэй нийлдэг (зураг дээр харуулаагүй). Холбогдсон GBTA-ийн урьдчилан таамагласан байршлыг саарал зууван хэлбэрээр харуулав. Хар сум нь зэргэлдээ хоёр дэд нэгж дэх холбогч цэгүүдийн хоорондох аллостерийн холболтод оролцдог замыг заана. Судалгаанд хамрагдсан S1 үлдэгдлүүдийн байрлалыг өнгөт бөмбөрцөгөөр тэмдэглэв.(б) Hv1 дэд хэсгүүдийн бүдүүвч зураглалыг зохион байгуулсан мембраны хавтгайн эсийн гадна талаас харахад хоёр өөр димерийн тохиргоонд. Зүүн талын самбар дээр димерийн интерфейс нь S4 мушгиагаар үүсгэгддэг. Хоёр VSD-ийн эргэлт нь мембраны хавтгайд перпендикуляр тэнхлэгийг цагийн зүүний дагуу 20 градусаар эргүүлж, дагалддаг. Хоёр S4 мушгиа (тасархай сум)-ын гадна талын үзүүрийг салгаснаар баруун талд үзүүлсэн зохицуулалтыг бий болгоно. Энэ тохиргоонд зэргэлдээх дэд хэсгүүдийн D123 ба I127 үлдэгдэл хоорондоо ойртохыг зөвшөөрнө.(в) CiVSP VSD-ийн бүдүүвч дүрслэл 4G80 болор бүтцээс олдсон димерийн тохиргоонд. CiVSP дахь P140 байрлал нь Hv1 дэх D123 байрлалтай тохирч байна.
Бидний үр дүнгээс үзэхэд үлдэгдэл 123 (123D/123D эсвэл 123R/123R) хоорондын түлхэлтийн электростатик харилцан үйлчлэл нь нээлттэй төлөвт GBTA-тай холбогдох хамтын ажиллагааны "хэвийн" түвшинтэй холбоотой бөгөөд харилцан үйлчлэлийг түлхэлтээс татагдсан (123D/123R) рүү шилжүүлж байгааг харуулж байна. , хамтын ажиллагаа нэмэгдсэн (Зураг. 5g).Аланиныг орлуулах зэвүүн харилцан үйлчлэлийг арилгах нь хамтын ажиллагаа нэмэгдэхэд хүргэнэ гэж найдаж байна.Гэхдээ 123A/123A димерийн хамтын ажиллагаа буурсан нь ажиглагдсан (Зураг 5e). Нэг боломжтой. Тайлбар нь гидрофобик үлдэгдлийг гидрофиль орчинд байрлуулахын тогтворгүйжүүлэх нөлөө нь D123 үлдэгдэл хоорондын түлхэлтийн харилцан үйлчлэлийг арилгасны улмаас тогтворжуулах нөлөөнөөс давж, улмаар холбох хамтын ажиллагааг бүхэлд нь бууруулдаг.Mony et al.39 саяхан мэдээлсэн: Ciona gutis Ci-Hv1-ийн D171 байрлал (хүний Hv1 дэх D123-тай тохирч байна) идэвхжсэнээр нэмэгдэж, D123 нь задгай төлөвт гидрофил орчинд байрладаг гэсэн ойлголтыг дэмжиж байна.
Hv1 сувгийн гарц нь олон шилжилтээр явагддаг нь мэдэгдэж байна19,20,26,39,40,41. Qiu нар 26 мембраны деполяризаци хийх үед Ci-Hv1-ийн хүчдэлийн мэдрэгч нь конформацийн өөрчлөлтөд орж сувгийг идэвхжүүлсэн боловч хаалттай хэвээр байдгийг олж мэдсэн. , дараа нь тодорхой шилжилт хийгдэж, протонууд хоёр дэд нэгжийн замд дамжуулалтыг нээхэд хүргэдэг. Хүчдэл мэдрэгчийн конформацийн өөрчлөлтийг хүчдэлийн хавчаарт флюресценцээр хянаж, хоёр дахь шилжилтийг D171 байрлал дахь мутаци сонгон цочирдуулсан нь тогтоогдсон. Флюресцент дохионы цочрол нь конформацийн өөрчлөлтийн урвалын координатын дагуу зарим цэгт зэргэлдээх дэд нэгжүүдийн D171 үлдэгдэл хооронд электростатик харилцан үйлчлэл байгаатай нийцэж байна. Энэхүү тайлбар нь D123 үлдэгдэл нээлттэй төлөвт электростатик харилцан үйлчлэлцдэг гэсэн бидний олж мэдсэнтэй нийцэж байна. мөн GBTA холбох газруудын хоорондох аллостерийн холболтыг зуучилдаг.
Fujiwara нар 25 цитоплазмын ороомогтой ороомгийн домэйны димерийн интерфейс нь мембран руу сунаж хоёр S4 мушгиа (Зураг 7b, зүүн самбар) агуулдаг гэж санал болгосон. Энэхүү дэд нэгж хоорондын харилцан үйлчлэлийн загвар нь цистеины хөндлөн холбоосын шинжилгээнд суурилдаг. S4 спираль ба CCD-ийг холбосон бүсийн бүхэл бүтэн VSD ба функциональ шинжилгээ. Трансмембран рН градиент байхгүй тохиолдолд Hv1 сувгууд нээгдэхийн тулд мембраны деполяризаци их хэмжээгээр шаарддаг бөгөөд суваг голчлон хаалттай нөхцөлд цистеины хөндлөн холбоос үүсдэг. Тиймээс илрүүлсэн S4-S4 интерфэйс нь төлөвөөс гадуурх дэд нэгжийн тохиргоог тусгасан байх магадлалтай. Бусад судалгаанаас үзэхэд S1 ба S2-ийг хаалтын явцад дэд нэгж хоорондын харилцан үйлчлэлд оролцуулсан нотлох баримт олдсон байна17,21,26 нь сувгууд нээлттэй болон дэд нэгжийн өөр өөр тохиргоог ашиглаж болохыг харуулж байна. хаалттай мужууд, энэ санаа нь Mony et al. Хаалганы үед S1 39 хөдөлдөг.
Энд бид нээлттэй төлөвт S1 мушгиагийн эсийн гаднах төгсгөлүүд нь дэд нэгжүүдийн хоорондох аллостерийн холболтыг зуучлах шууд электростатик харилцан үйлчлэлийг дэмжихэд хангалттай ойрхон байгааг харуулж байна. Өргөтгөсөн S4-S4 харилцан үйлчлэл бүхий димерийн тохиргоонд S1 мушгиа хэт хол байна. бие биенээсээ тусад нь шууд харилцан үйлчилнэ. Гэсэн хэдий ч мембраны хавтгайд перпендикуляр тэнхлэгийн эргэн тойронд хоёр VSD дэд нэгжийг цагийн зүүний дагуу 20° эргүүлэх нь хоёр S4 мушгиауудын гадна талын төгсгөлүүдийг тусгаарлахтай хослуулан S1-S1 тохируулгатай нийцэж байна. бидний олдворуудын хамт (Зураг 7б, баруун талын самбар). Бид нээлттэй төлөвт байгаа сувагт энэ тохиргоог хийхийг зөвлөж байна.
Хэдийгээр CiVSP фермент нь мономерийн үүрэг гүйцэтгэдэг гэж үздэг ч түүний тусгаарлагдсан VSD-ийн болор бүтэц нь димер төлөвт баригдсан байдаг. Энэ димер дэх S1 мушгиауудын гаднах төгсгөлүүд нь орон зайн хувьд ойрхон бөгөөд ерөнхий тохиргоо нь санал болгож буйтай төстэй юм. Hv1-ийн хувьд (Зураг 7c). CiVSP димерт зэргэлдээх дэд нэгжээс хамгийн ойрын үлдэгдэл 140-р байрлалд пролин байсан (Зураг 7в). Сонирхолтой нь CiVSP дахь P140 нь Hv1 дэх D123 байрлалтай тохирч байна. Hv1-ийн дэд нэгжийн тохиргооны ижил төстэй байдал. болон CiVSP димерүүд эдгээр уургийн VSD нь S1-ийн эсийн гаднах төгсгөлүүд харилцан үйлчилдэг интерфэйс үүсгэх өвөрмөц хандлагатай байдаг гэж үздэг.
Эр бэлгийн эсийн идэвхжил дэх Hv1-ийн чухал үүрэг нь энэ сувгийг эр бэлгийн эсийн үржил шимийг хянах эмийн зорилтот дур булаам болгодог. Цаашилбал, микроглия дахь Hv1 идэвхжсэнээр ишемийн харвалтын эдгэрэлтийг улам дордуулдаг. хөхний 12 эсвэл бүдүүн гэдэсний хорт хавдартай өвчтөнүүдийн эсэн мэнд амьдрах чадвар 13 бөгөөд В эсийн хорт хавдар үүсэхэд хувь нэмэр оруулдаг гэж үздэг Нээлттэй Hv1 дэд нэгж нь холболтын хамаарлыг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэг бөгөөд Hv1 сувгуудад чиглэсэн илүү хүчтэй эмүүдийг бий болгоход хүргэж болзошгүй юм.
Хүний Hv1-ийн талбайд чиглэсэн мутагенезийг стандарт ПГУ-ын техник ашиглан гүйцэтгэсэн. Hv1NCCiVSP бүтцэд Hv1-ийн 1-96 ба 228-273 үлдэгдлийг CiVSP18-ийн 1-113 ба 240-576 үлдэгдэлээр сольсон. Hv1-холбогчтой, Нэг дэд нэгжийн С төгсгөл нь GGSGGSGGSGSGGSGG холбогчоор дамжуулан хоёр дахь дэд хэсгийн N төгсгөлтэй холбогддог. Төрөл бүрийн бүтцийг агуулсан pGEMHE плазмидуудыг Nhe1 эсвэл Sph1 хязгаарлах ферментүүд (New England Biolabs) шугаман болгож, РНХ-ийн нийлэгжилтийг гүйцэтгэсэн. T7 mMessage mMachine транскрипцийн иж бүрдэл (Ambion). Электрофизиологийн хэмжилт хийхээс 1-3 хоногийн өмнө cRNA-г Ксенопусын ооцитуудад тарьсан (нэг эсэд 50 нл, 0.3-1.5 мкг/мкл). Xenopus laevis-аас V ба VI үе шатны ооцитуудыг (SCO) авсан. Ecocyte Bioscience-аас. РНХ тарилгын дараа эсүүдийг 96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1.8 мМ CaCl, 1 мМ MgCl, 10 мм HEPES, 5 мМ пируват, 10 мМ ген 100 мкг, 100 мкг ген агуулсан ND96 орчинд хадгалсан. .
2-гуанидино-бензимидазол[1], 2-гуанидино-бензотиазол[2], (4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин [5], (5-бромо-4-метил-1,3) -тиазол-2-ил)гуанидин) [6], этил 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилат [8], этил 2-гуанидино-4- метил-1,3-тиазол- 5-карбоксилат [9] ба (2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)этил ацетат [10] нь Сигма-Алдрихаас гаралтай. Фамотидин [7] нь MP Biomedicals-аас байсан.1-[4 -(4-Хлорфенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин[11] ба 1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин [12] байсан Matrix Scientific-аас. Эдгээр нэгдлүүд нь худалдаанд байгаа хамгийн өндөр цэвэршилттэй байдаг. Тэдгээрийг хуурай DMSO-д уусгаад 100 мм-ийн нөөцийн уусмал үүсгэсэн бөгөөд дараа нь хүссэн эцсийн концентрацид нь бичлэгийн уусмалд шингэлсэн. 3 ба 4-р нэгдлүүдийг доор нь нийлэгжүүлсэн болно. хамгийн багадаа 99% цэвэршилттэй.
25 мл усан давсны хүчил (2.5 Н) дахь 2-амин-4-(трифторметил) бензенетиол гидрохлоридын (1.02 г, 4.5 ммоль) суспензэнд хатуу дициандиамид (380 мг, 4.5 ммоль), үүссэн гетерогенийг нэмсэн. 4 цагийн турш хүчтэй хутгах замаар буцалгана. Урвалын хольцыг тасалгааны температурт хөргөж, 10Н калийн гидроксидыг аажмаар нэмж саармагжуулна. Үүссэн цагаан тунадасыг шүүж, хүйтэн усаар (3х50 мл) угааж, зууханд хатаана. 65 ° C) хэдэн цагийн турш, дараа нь этил ацетат/нефтийн эфирээр дахин талстжуулж, цагаан өнгийн хатуу (500 мг, 48%); mp 221-222 ° C (гэрэл 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (маш өргөн s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Гц), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Гц).13C NMR (200 МГц, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Гц), 117.5 (d, J = 3.5 Гц), 121.7, 124.6 (q, J) = 272 Гц), 126.1 (q, J = 272 Гц) = 31.6 Гц), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z тооцоолсон утга. C9H8F3N4S (M + H1)+-ийн хувьд олдсон: 0 26, 016 : 261.0419.
Өмнө дурьдсанчлан нийлэгжүүлсэн нафто[1,2-д]тиазол-2-амин (300 мг, 1.5 ммоль) жижиг туршилтын хоолойд тосон ваннд 200 ° C хүртэл халаана.300 мг (их илүү) цианамид ба 1.0 мл конц. Халуун нэгдэлд давсны хүчлийг хурдан нэмж, хольцыг газрын тосны ваннд 2 минут орчим байлгасан бөгөөд энэ хугацаанд ихэнх ус ууршсан. Дараа нь урвалын хольцыг тасалгааны температурт хөргөж, үүссэн хатуурсан материал. жижиг хэсгүүдэд хувааж, усаар угааж, цайвар шар аморф хатуу (38 мг, 10%) mp 246-250 ° C; 1H NMR (500 МГц, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Гц), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Гц), 7.77 (d, 1 H) , J = 8.6 Гц), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Гц), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Гц), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Гц).13C NMR (150) МГц, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/zN14H-ийн хувьд тооцоолсон: m/z140 99 , олдсон: 243.0704.
Протоны гүйдлийг pClamp10 программ хангамжтай Axon Digidata 1440A (Молекул төхөөрөмж)-ээр удирддаг Axopatch 200B өсгөгч ашиглан янз бүрийн бүтэцтэй овоцитуудын дотоод болон гадаад хэсгүүдэд хэмжсэн. Эсийн доторх болон эсийн гаднах уусмалууд нь ижил найрлагатай: 100 мМ 2-(Н-морфолино) )этансульфоны хүчил (MES), 30 мм тетраэтиламмонийн (TEA) мезилат, 5 мм TEA хлорид, 5 мм этилен гликол-бис(2-аминоэтил)-N,N,N',N'-тетра цууны хүчил (EGTA), тохируулсан TEA гидроксидын рН 6.0. Бүх хэмжилтийг 22 ± 2 °C-т хийсэн. Пипеткийн нэвтрэх эсэргүүцэл нь 1.5–4 MΩ байна. Гүйдлийн ул мөрийг 1 кГц-т шүүж, 5 кГц-т дээж авч, Clampfit10.2 (Молекулын төхөөрөмж) -ээр шинжилсэн. ) болон Origin8.1 (OriginLab).
Төрөл бүрийн концентрацитай Hv1 дарангуйлагч, зарим тохиолдолд 10 mM βME агуулсан уусмалыг pClamp програм хангамжийн TTL (Transistor-) -ээр дамжуулсан VC-6 ус нэвтрүүлэх хавхлагын системд (Warner Instr.) холбогдсон олон талт хоолойгоор дамжуулан таталцлын хүчээр ваннд оруулсан. Транзисторын логик) дохионууд. Түргэн нэвт шингээх туршилтыг нөхөөсийн пипеткийн урд суурилуулсан 360 μм диаметртэй дамжуулах үзүүртэй олон хоолойт шингээгч харандаа (AutoMate Sci.) ашиглан гүйцэтгэсэн. Сувгийн дарангуйллыг төгсгөлийн изохрон амперометрийн хэмжилтээр тодорхойлсон. +120 мВ деполяризацийн импульс. GV хэмжилтийг өмнө тайлбарласны дагуу хийсэн18,20. Өөрөөр заагаагүй бол -20 мВ-аас +120 мВ хүртэлх янз бүрийн хүчдэлд деполяризацийн үе шатуудын дараа сүүлний гүйдлийг -40 мВ-т бүртгэсэн. Туршилтын импульсийн өмнөх жишиг импульс нь гүйдлийн задралыг засахад ашигладаг 18 .GV график нь Больцманы тэгшитгэлд тохирно:
Суваг ба дарангуйлагчдын янз бүрийн хослолын илэрхий диссоциацийн тогтмолыг (Kd) (Нэмэлт Хүснэгт 1) дарангуйллын концентрацийн хамаарлыг (дундаж %inhib утга) Хилл тэгшитгэлд тохируулан тодорхойлсон.
Энд [I] нь I дарангуйлагчийн концентраци ба h нь Хилл коэффициент юм. Хилл коэффициентийг тооцоолохын тулд (2) тэгшитгэлийг дараах байдлаар өөрчлөнө.
Шуудангийн цаг: 2022-06-07
