திறந்த Hv1 புரோட்டான் சேனலின் இடைமுக இடைமுகத்தின் விசாரணை

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவிப் பதிப்பில் CSS க்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்ட ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்காக, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் பொருந்தக்கூடிய பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், உறுதிசெய்ய தொடர்ந்து ஆதரவு, பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காண்பிப்போம்.
Hv1 வோல்டேஜ்-கேட்டட் புரோட்டான் சேனல் என்பது இரண்டு மின்னழுத்த உணர்திறன் டொமைன்களை (VSDs) கொண்ட ஒரு டைமெரிக் காம்ப்ளக்ஸ் ஆகும், ஒவ்வொன்றும் ஒரு கேட் புரோட்டான் ஊடுருவல் பாதையைக் கொண்டுள்ளது. டைமரைசேஷன் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சுருள்-சுருள் டொமைனால் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. மூடிய நிலையில் இருந்து மாற்றம் இரண்டு VSDகளிலும் திறந்த நிலை கூட்டுறவாக நிகழ்கிறது; இருப்பினும், அடிப்படை வழிமுறைகள் பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை. அலோஸ்டெரிக் செயல்முறைகளில் இன்டர்சபுனிட் இடைமுகங்கள் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன; எவ்வாறாயினும், திறந்த Hv1 சேனல்களில் அத்தகைய இடைமுகங்கள் அடையாளம் காணப்படவில்லை. 2-குவானிடினோதியாசோல் வழித்தோன்றல்கள் இரண்டு Hv1 VSDகளை கூட்டுறவு முறையில் தடுப்பதையும், திறந்த துணைக்குழுக்களுக்கு இடையில் அலோஸ்டெரிக் இணைப்பிற்கான ஆய்வாக இந்த சேர்மங்களில் ஒன்றைப் பயன்படுத்துவதையும் இங்கே நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். VSD இன் முதல் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் துண்டின் முடிவு, பிணைப்புத் தளங்களுக்கிடையே இணைப்பிற்கு மத்தியஸ்தம் செய்யும் ஒரு இடைமுக இடைமுகத்தை உருவாக்குகிறது, அதேசமயம் சுருள்-சுருள் டொமைன் நேரடியாக இந்தச் செயல்பாட்டில் ஈடுபடவில்லை. .
வோல்டேஜ்-கேட்டட் புரோட்டான் சேனல்கள் பைட்டோபிளாங்க்டன் முதல் மனிதர்கள் வரை பல்வேறு உயிரினங்களில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன Hv1, இது HVCN1 மரபணு2,3.Hv1 (அக்கா VSOP) இன் தயாரிப்பு ஆகும் காற்றுப்பாதை மேற்பரப்பு திரவத்தின் இயக்கம்9 மற்றும் pH ஒழுங்குமுறை10. இந்த சேனல், பி-செல் வீரியம் 4,11 மற்றும் மார்பக மற்றும் பெருங்குடல் புற்றுநோய்கள்12,13 போன்ற புற்றுநோய் வகைகளில் அதிகப்படியான அழுத்தத்தில் ஈடுபட்டுள்ளது.அதிகப்படியான Hv1 செயல்பாடு புற்றுநோய் செல்கள் 11, 12 மெட்டாஸ்டேடிக் திறனை அதிகரிப்பதாக கண்டறியப்பட்டது.மூளையில், Hv1 வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. மைக்ரோக்லியா மூலம், மற்றும் அதன் செயல்பாடு இஸ்கிமிக் ஸ்ட்ரோக்கின் மாதிரிகளில் மூளை பாதிப்பை அதிகப்படுத்துவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது.
Hv1 புரதமானது மின்னழுத்த உணர்திறன் டொமைனை (VSD) கொண்டுள்ளது, இது S1 முதல் S414 வரை எனப்படும் நான்கு டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் பிரிவுகளைக் கொண்டுள்ளது. VSD ஆனது மின்னழுத்தம்-கேட்டட் Na+, K+ மற்றும் Ca2+ சேனல்கள் மற்றும் CiVSP போன்ற மின்னழுத்த-உணர்திறன் பாஸ்பேடேஸ்களின் தொடர்புடைய டொமைன்களை ஒத்திருக்கிறது. Ciona gutis15. இந்த மற்ற புரதங்களில், S4 இன் சி-டெர்மினஸ் ஒரு செயல்திறன் தொகுதி, துளை டொமைன் அல்லது என்சைம் ஆகியவற்றுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது. Hv1 இல், S4 சவ்வின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்தில் அமைந்துள்ள சுருள்-சுருள் டொமைனுடன் (CCD) இணைக்கப்பட்டுள்ளது. .சேனல் இரண்டு VSDகளைக் கொண்ட ஒரு டைமெரிக் காம்ப்ளக்ஸ் ஆகும், ஒவ்வொன்றும் ஒரு கேடட் புரோட்டான் ஊடுருவல் பாதை16,17,18 ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது. இந்த இரண்டு Hv1 துணைக்குழுக்களும் 19,20,21,22 ஒத்துழைப்பாகத் திறப்பது கண்டறியப்பட்டது, இது அலோஸ்டெரிக் கப்ளிங் மற்றும் இன்டர்-சப்யூனிட் இன்டராக்ஷன்ஸ் விளையாடுவதைக் குறிக்கிறது. கேட்டிங் செயல்பாட்டில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது. சுருள் சுருள் டொமைனில் உள்ள துணை அலகுகளுக்கு இடையே உள்ள இடைமுகம் நன்கு வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது, ஏனெனில் இரண்டு தனிமைப்படுத்தப்பட்ட களங்களின் படிக கட்டமைப்புகள் உள்ளன. Hv1-CiVSP சிமெரிக் புரதத்தின் படிக அமைப்பு இந்த இடைமுகத்தைப் பற்றிய தகவலை வழங்கவில்லை, ஏனெனில் படிகப்படுத்தப்பட்ட சேனல் வளாகத்தின் ட்ரைமெரிக் அமைப்பு, ஈஸ்ட் லியூசின் ஜிப்பர் GCN424 மூலம் நேட்டிவ் Hv1 CCD ஐ மாற்றுவதால் ஏற்படலாம்.
Hv1 சேனலின் சப்யூனிட் அமைப்பின் சமீபத்திய ஆய்வில், இரண்டு S4 ஹெலிகள் CCD க்குள் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பின் கடுமையான இடையூறு இல்லாமல் மாறுகின்றன, இதன் விளைவாக நீண்ட ஹெலிகள் மென்படலத்திலிருந்து தொடங்கி சைட்டோபிளாஸிற்குள் நுழைகின்றன. சிஸ்டைன் கிராஸ்லிங்க்கிங் பகுப்பாய்வு அடிப்படையில் இந்த ஆய்வு Hv1 VSDகள் S4 பிரிவில் ஒருவரையொருவர் தொடர்பு கொள்ள வேண்டும் என்று முன்மொழிகிறது. இருப்பினும், மற்ற ஆய்வுகள் VSDகளுக்கு இடையே மாற்று இடைமுகங்களை முன்மொழிந்துள்ளன. இந்த இடைமுகங்களில் S1 பிரிவுகள் 17, 21, 26 மற்றும் S2 பிரிவின் வெளிப்புற முனைகள் 21. முரண்படுவதற்கான சாத்தியமான காரணம் ஆகியவை அடங்கும். இந்த ஆய்வுகளின் முடிவுகள் என்னவென்றால், VSD களுக்கு இடையேயான அலோஸ்டெரிக் இணைப்பு கேட்டிங் செயல்முறை தொடர்பாக ஆராயப்பட்டது, இது மூடிய மற்றும் திறந்த நிலைகளைப் பொறுத்தது, மேலும் VSD களுக்கு இடையிலான இடைமுகம் இணக்கத்தில் வெவ்வேறு நிலை மாற்றங்களில் மாறுபடலாம்.
இங்கே, 2-குவானிடினோதியாசோல் Hv1 சேனல்களை இரண்டு திறந்த VSDகளுடன் ஒருங்கிணைந்த முறையில் பிணைப்பதன் மூலம் தடுக்கிறது என்பதைக் கண்டறிந்தோம், மேலும் திறந்த நிலையில் உள்ள துணைக்குழுக்களுக்கு இடையேயான தொடர்புகளை ஆராய 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) கலவைகளில் ஒன்றைப் பயன்படுத்தினோம். இடைமுகம். GBTA பிணைப்பு வளைவை ஒரு அளவு மாதிரியின் மூலம் நன்கு விவரிக்க முடியும் என்பதைக் கண்டறிந்தோம், இதில் ஒரு துணை அலகுக்கு தடுப்பானை பிணைப்பதன் விளைவாக அருகிலுள்ள துணைக்குழுவின் பிணைப்பு உறவில் அதிகரிப்பு ஏற்படுகிறது. எச்சங்கள் D112, தேர்ந்தெடுக்கும் வடிகட்டிகள் சேனல் 27, 28 மற்றும் குவானிடைன் டெரிவேடிவ் பைண்டிங் தளம் 29 இன் பகுதி GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பைக் கட்டுப்படுத்துகிறது. Hv1 டைமரில் கூட்டுறவு பிணைப்பு பராமரிக்கப்படுவதை நாங்கள் காட்டுகிறோம், அங்கு CCD S4 பிரிவில் இருந்து பிரிகிறது, CCD இல் உள்ள இடைமுகம் நேரடியாக இல்லை என்று பரிந்துரைக்கிறது. GBTA-பைண்டிங் தளங்களுக்கிடையில் அலோஸ்டெரிக் கப்ளிங்கை மத்தியஸ்தம் செய்கிறோம். இதற்கு மாறாக, S1 துண்டானது துணைக்குழுக்களுக்கு இடையே உள்ள இடைமுகத்தின் ஒரு பகுதியாக இருப்பதைக் கண்டறிந்து, டைமரின் மையத்திலிருந்து விலகி S4 ஹெலிக்ஸின் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் முனையுடன் அருகில் உள்ள VSDகளின் ஏற்பாட்டைச் செய்ய முன்மொழிகிறோம். S1 துண்டு திறந்த நிலையில் இருக்க வேண்டும்.
Hv1 இன் சிறிய மூலக்கூறு தடுப்பான்கள் புற்றுநோய் எதிர்ப்பு மருந்துகள் மற்றும் நரம்பியல் தடுப்பு முகவர்கள் எனப் பயன்படுகின்றன. இருப்பினும், இன்றுவரை, சில சேர்மங்கள் சேனலைத் தடுக்கின்றன 1a) மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்கள் சேனல் மூலம் புரோட்டான்களின் VSD29,32 ஊடுருவலைத் தடுக்கின்றன 200 μM (படம் 1b) செறிவில் சோதனை செய்தபோது Hv1 ஐ கிட்டத்தட்ட 2GB ஐத் தடுப்பதாகக் காட்டப்பட்டது (படம் 1b). நாங்கள் மற்ற தியாசோல் வழித்தோன்றல்களை ஆய்வு செய்தோம், அவற்றில் சில GBTA ஐ விட ஒத்த அல்லது அதிக ஆற்றலுடன் சேனலைத் தடுப்பதைக் கண்டறிந்தது (படம். 1 மற்றும் துணை. நான்கு தியாசோல் வழித்தோன்றல்களின் (GBTA மற்றும் கலவைகள் [3], [6] மற்றும் [11], படம். 1c) செறிவு மறுமொழி வளைவுகளை நாங்கள் தீர்மானித்தோம், மேலும் அவை 2GBI ஐ விட செங்குத்தாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். தி ஹில் குணகங்கள் (h) தியாசோல் வழித்தோன்றல்கள் 1.109 ± 0.040 இலிருந்து 1.306 ± 0.033 (படம். 1c மற்றும் துணை படம். 1).மாறாக, 2GBIக்கான ஹில் குணகம் 0.975 ± 0.024 29, படம் 2a மற்றும் துணை படம் 1).ஒரு மலை குணகம் 1 க்கு மேல் பிணைப்பு ஒத்துழைப்பைக் குறிக்கிறது.ஏனென்றால் ஒவ்வொரு Hv1 உட்பிரிவிலும் அதன் சொந்த Hv1 துணைக்குழு உள்ளது. பைண்டிங் தளம், 29,32, தியாசோல் வழித்தோன்றலை ஒரு துணை அலகுடன் பிணைப்பது இரண்டாவது தடுப்பான் மூலக்கூறை அருகிலுள்ள துணை அலகுடன் பிணைப்பதை மேம்படுத்தலாம் என்று நாங்கள் நியாயப்படுத்தினோம். ஜிபிடிஏ மிக உயர்ந்த ஹில் குணகம் கொண்ட சோதனை கலவையாகும். எனவே, இந்த கலவையை நாங்கள் தேர்வு செய்தோம். பிணைப்பு சினெர்ஜியின் பொறிமுறையை மேலும் ஆய்வு செய்து 2ஜிபிஐ ஒரு குறிப்பு எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தியது.
(அ) ​​சோதனை கலவைகள்: [1] குறிப்பு Hv1 இன்ஹிபிட்டர் 2-குவானிடினோ-பென்சிமிடாசோல் (2ஜிபிஐ).[2] 2-குவானிடினோ-பென்சோதியாசோல் (GBTA), [3] (5-ட்ரைபுளோரோமெதில்-1,3-பென்சோதியாசோல்-2-yl)குவானிடின், [4] நாப்தோ[1,2-d][1, 3] தியாசோல்-2-யில் -குவானிடின், [5](4-மெத்தில்-1,3-தியாசோல்-2-யில்)குவானிடைன், [6](5-புரோமோ-4-மெத்தில்-1,3-தியாசோல்- 2-யில்)குவானிடைன், [7] ஃபமோடிடின், [8] 2-குவானிடினோ-5-மெத்தில்-1,3-தியாசோல்-4-கார்பாக்சிலிக் அமிலம் எத்தில் எஸ்டர், [9] 2-குவானிடினோ-4-மெத்தில் எத்தில்-1,3-தியாசோல்-5-கார்பாக்சிலேட், [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)எத்தில் அசிடேட், [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட guanidinothiazoles மற்றும் குறிப்பு கலவை 2GBI (நீல-பச்சை பட்டைகள்) மூலம் மனித Hv1 செயல்பாட்டை தடுப்பது .Hv1 புரோட்டான் மின்னோட்டங்கள் -80 mV முதல் +120 mV வரையிலான டிப்போலரைசேஷனுக்கு பதிலளிக்கும் வகையில் Xenopus oocytes இன் உள்ளே-வெளியே பிளேக்குகளில் அளவிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு தடுப்பானும் 200 μM செறிவில் குளியல் சேர்க்கப்பட்டது.pHi = pHo = 6.0 .தரவு என்பது சராசரி ±SEM (n≥4).(c) சேர்மங்கள் [2], [3], [6] மற்றும் [11] மனித Hv1 இன் செறிவு-சார்ந்த தடுப்பான். ஒவ்வொரு புள்ளியும் சராசரி தடுப்பான ± SD 3 15 அளவீடுகள் வரை. துணை அட்டவணை 1 இல் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ள வெளிப்படையான Kd மதிப்புகளைப் பெறுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு மலைப் பொருத்தம். 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (முறைகளைப் பார்க்கவும்).
(a,b) 2GBI மற்றும் GBTA கலவைகள் டைமெரிக் மற்றும் மோனோமெரிக் Hv1 ஐ செறிவு சார்ந்த முறையில் தடுக்கின்றன. ஒவ்வொரு புள்ளியும் 3 முதல் 8 அளவீடுகளின் சராசரி தடுப்பான ± SD ஐக் குறிக்கிறது மற்றும் வளைவு ஒரு ஹில் பொருத்தமாக இருக்கும். மலை குணகங்கள் (h) காட்டப்பட்டுள்ளது. இன்செட் ஹிஸ்டோகிராம்கள் துணை அத்தி 3 மற்றும் 4 இல் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ள பொருத்தங்களில் இருந்து தீர்மானிக்கப்பட்டது. (a) இல் காட்டப்பட்டுள்ள GBTA இன் செறிவு பதில் படம் 1c இல் உள்ளதைப் போன்றது. வெளிப்படையான Kd மதிப்புகளுக்கு துணை அட்டவணை 1 ஐப் பார்க்கவும்.(c) மாடலிங் டிமெரிக் Hv1 உடன் GBTA வின் கூட்டுப் பிணைப்பு. திடமான கருப்புக் கோடு சமன்பாடு (6) மூலம் சோதனைத் தரவுகளைப் பொருத்துவதைக் குறிக்கிறது. -முறையே முதல் மற்றும் இரண்டாவது பிணைப்பு நிகழ்வுகளின் விலகல் சமநிலை வளைவுகள் (துணை 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; துணை 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 ).(d) Hv1 பிளாக்கின் முன்மொழியப்பட்ட பொறிமுறையின் திட்ட வரைபடம். GBTA விஷயத்தில், ஒரு திறந்த துணை அலகுடன் பிணைப்பது, அருகில் உள்ள திறந்த துணைக்குழுவின் (Kd2 Hv1 சேனல்களை அவற்றின் N- மற்றும் C-டெர்மினல் சைட்டோபிளாஸ்மிக் டொமைன்களை Ciona Intestinalis மின்னழுத்த உணர்திறன் பாஸ்பேடேஸ் CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 இன் தொடர்புடைய பகுதிகளுடன் மாற்றுவதன் மூலம் மோனோமரைஸ் செய்ய முடியும். அவற்றை டைமெரிக் சேனல் (வைல்ட்-டைப்) தடுப்பானுடன் ஒப்பிடும்போது (படம். 2a,b).இரண்டு சேர்மங்களுக்கிடையேயான பிணைப்பு ஒத்துழைப்பில் உள்ள வேறுபாடு மோனோமெரிக் Hv1 இல் நீக்கப்பட்டதைக் கண்டறிந்தோம், GBTA ஒரு துணை அலகுக்கு பிணைப்பு அதிகரிக்கிறது என்ற விளக்கத்தை ஆதரிக்கிறது. இன்ஹிபிட்டருக்கான மற்ற துணைக்குழுவின் தொடர்பு. ஒரு Hv1 துணைக்குழுவுடன் GBTA பிணைப்பு பிணைப்பு தளத்தின் மறுசீரமைப்பிற்கு வழிவகுக்கலாம் (fit35 ஐத் தூண்டுகிறது), இது அருகிலுள்ள துணைக்குழுவின் காலியான பிணைப்பு தளத்தின் மறுசீரமைப்பைத் தூண்டும், இது பிணைப்பு அதிகரிப்புக்கு வழிவகுக்கும். தொடர்பு.
சேனலுடன் GBTA வின் கூட்டுப் பிணைப்பை அளவுரீதியாக விவரிக்க, நாம் ஒரு மாதிரியைப் பயன்படுத்தினோம், அதில் ஏதேனும் ஒரு துணைக்குழுவானது முதல் தடுப்பான் மூலக்கூறை ஒரு விலகல் மாறிலி Kd1 (படம் 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*) உடன் இரு மூலக்கூறு வினையைத் தொடர்ந்து பிணைக்க முடியும். பிணைப்பு, ஒரு விலகல் மாறிலி Kd2 உடன் ஒரு தனித்துவமான இருமூலக்கூறு எதிர்வினையைத் தொடர்ந்து, மீதமுள்ள வெற்று துணைக்குழுக்கள் தடுப்பானுடன் பிணைக்கப்படும் நிலையை சேனலுக்கு ஏற்படுத்துகிறது, இங்கு Kd2 படம் 2c இல் உள்ள திடமான கருப்பு கோடு என்பது மாதிரி சமன்பாட்டின் சோதனை செறிவு-மறுமொழி வளைவின் பொருத்தமாகும், இது ~290 μM இன் Kd1 மற்றும் ~29 μM இன் Kd2 ஐ அளிக்கிறது (முறைகள் பிரிவு, சமன்பாடு (6)) மாதிரியும் விவரிக்கிறது. 2GBI இன் பிணைப்பு, இதில் Kd2 ≈ Kd1 = Kd (படம் 2d). மோனோமெரிக் Hv1 இல், ஒரே ஒரு பிணைப்பு தளம் மற்றும் ஒரு Kdm (O° + B ⇆ B°) உள்ளது. GBTA விஷயத்தில், Kdm சுமார் 54 ஆகும். μM, இது Kd2 ஐ விட Kd1 ஐப் போன்றது (படம். 2d).வேறுவிதமாகக் கூறினால், மோனோமரின் பிணைப்புத் தளமானது குறைந்த-ஐ விட உயர்-தொடர்பு நிலை (BO*) போன்ற உள்ளமைவில் (O°) உள்ளது. டைமரின் தொடர்பு நிலை (OO), பெரும்பாலும் துணைக்குழுக்களுக்கு இடையிலான இடைமுகத்தை நீக்குவதன் காரணமாக இருக்கலாம்.
முன்பு 2GBI32 க்காகக் காட்டப்பட்டதைப் போல, GBTA ஆனது Hv1 மின்னோட்டங்களைத் திறந்து விடுவதைக் காட்டிலும், திறந்திருக்கும் போது அதைத் தடுப்பதன் மூலம் அதைத் தடுப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (துணை படம். 2a,b,d).2GBI ஆனது மெதுவாக அழுகும் வால் நீரோட்டங்களைத் தூண்டுவதாகவும் அறியப்படுகிறது. சவ்வு மறுதுருவப்படுத்துதலுக்கு விடையிறுக்கும் வகையில், ஆனால் இந்த நிகழ்வு GBTA இல் காணப்படவில்லை (துணை படம். 2c). 2GBI முன்னிலையில் Hv1 செயலிழக்கத்தின் முன்னிலையில், தடுப்பான் பிணைப்பு தளத்தை விட்டு வெளியேறும் வரை ஒவ்வொரு துணைப் பிரிவிலும் உள்ள வாயில்களை மூட முடியாது (தி " ஃபுட் கேட்” மெக்கானிசம்), மற்றும் 2ஜிபிஐ வாயில்களை மூடுவதை விட மெதுவாக பிணைக்கிறது. ஒரு எச்வி1 துணைக்குழு தடைநீக்கப்பட்டு மூடப்பட்டால், அருகில் உள்ள துணைக்குழு தடுக்கப்பட்ட நிலையில், மீதமுள்ள 2ஜிபிஐ மூலக்கூறுகளின் பிணைப்பு மெதுவாக மாறும் (தடுப்பான் பிடிப்பு). ஒரே ஒரு தடுக்கப்பட்ட துணைக்குழு மட்டுமே புரோட்டான்களை மூடுவதற்கு முன் தற்காலிகமாக நடத்துகிறது மற்றும் மெதுவாக அழுகும் வால் மின்னோட்டத்திற்கு குறிப்பிடத்தக்க பங்களிப்பை செய்கிறது.
GBTA (துணை படம். 2c) முன்னிலையில் Hv1 வால் நீரோட்டங்களின் சிதைவு கணிசமாகக் குறையவில்லை என்பதைக் கண்டறிவது, இந்தத் தடுப்பானுக்கான (படம். 2d) ஒருங்கிணைந்த பிணைப்பு பொறிமுறையுடன் ஒத்துப்போகிறது. , பிளாக்கரின் அருகாமையில் உள்ள துணைக்குழுவின் தொடர்பு சுமார் 10 மடங்கு குறைகிறது, இது பிணைக்கப்படாத செயல்முறைக்கு சாதகமாக உள்ளது. இதன் பொருள் GBTA இன் இரண்டாவது மூலக்கூறு சேனலில் சிக்குவதற்கு முன் அவிழ்க்க அதிக வாய்ப்பு உள்ளது. நீண்ட காலம் வாழும் சேனல் இனங்கள் 2ஜிபிஐயை விட GBTA முன்னிலையில் ஒரே ஒரு தடுக்கும் துணைப்பிரிவை உற்பத்தி செய்வது மிக அதிகமாக இருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது, இதன் விளைவாக வேகமாக வால் தற்போதைய சிதைவு ஏற்படுகிறது.
GBTA இரண்டு Hv1 துணைக்குழுக்களுடன் இணைந்து பிணைக்க, பிணைப்பு தளங்கள் அலோஸ்டெரிகலாக இணைக்கப்பட வேண்டும். ஒவ்வொரு பிணைப்பு தளமும் திறன் கொண்டதாக இருக்க வேண்டும்: 1) தடுப்பானுடன் பிணைக்கப்பட்ட அருகிலுள்ள துணைக்குழுக்களுடன் தொடர்பு கொள்ளும் நிகழ்வுகளின் சங்கிலியைத் தூண்டுவது மற்றும் 2) மத்தியஸ்தம் குறைந்த பிணைப்பிலிருந்து உயர்-தொடர்பு பிணைப்புக்கு மாறுதல். பிணைப்பு தளத்தில் உள்ள குறிப்பிட்ட எச்சங்கள் கூட்டுறவு செயல்முறைக்கு பங்களித்தால், அவற்றின் பிறழ்வு Hv1 இன் GBTA தடுப்பின் செறிவு-பதில் வளைவின் ஹில் குணகத்தை மாற்ற வேண்டும் என்று நாங்கள் நியாயப்படுத்தினோம். எச்சங்கள் D112, F150 , S181 மற்றும் R211 ஆகியவை முன்பு 2GBI29 பிணைப்பு சூழலின் ஒரு பகுதியாகக் காட்டப்பட்டன, மேலும் அவை GBTA பிணைப்பில் (படம் 3A) ஈடுபடும் என்று நாங்கள் அனுமானித்தோம். பிறழ்ந்த சேனல்களான D112E, F1810A, S1810A, GBTA இன் தடுப்பு செறிவு-பதில் வளைவுகளை அளந்தோம். , மற்றும் R211S (படம் 3) மற்றும் அவற்றின் ஹில் குணகங்களை Hv1 வைல்டு-வகையுடன் ஒப்பிட்டு, 2GBI ஐ ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்துகிறது. எச்சம் V109 D112 போன்ற S1 பிரிவின் அதே முகத்தில் உள்ளது மற்றும் கலத்தின் உள்ளே ஒரு கூடுதல் ஹெலிகல் திருப்பத்தைக் கொண்டுள்ளது. V109 2GBI29 இன் பிணைப்பில் ஈடுபடவில்லை, V109A விகாரியை ஒரு கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தினோம் (படம். 3b).
(அ) ​​குவானிடைன் வழித்தோன்றல் பிணைப்பில் ஈடுபட்டுள்ள பரிந்துரைக்கப்பட்ட Hv1 எச்சங்கள். கோடு நீல வளைவுகள் முன்பு முன்மொழியப்பட்ட பக்கச் சங்கிலிகளைச் சுற்றி 2GBI29 கலவையின் வெவ்வேறு பகுதிகளுடன் தொடர்பு கொள்கின்றன.(bf) 2GBI (சியான்) மற்றும் GBTA சேர்மங்களால் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட Hv1 மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் செறிவு சார்ந்த தடுப்பு அடர் சிவப்பு).ஒவ்வொரு புள்ளியும் 3 முதல் 12 அளவீடுகளின் சராசரி தடுப்பை ± SD V109 எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகக் குறிக்கிறது. வளைவுகள் என்பது வெளிப்படையான Kd மதிப்புகளைப் பெறுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஹில் பொருத்தங்கள் (துணை அட்டவணை 1 ஐப் பார்க்கவும்) மலை குணகங்கள் (h) காட்டப்பட்டுள்ளது. இன்செட் ஹிஸ்டோகிராம்கள் துணை அத்தி 3 மற்றும் 4 இல் பதிவாகியுள்ள பொருத்தங்களில் இருந்து தீர்மானிக்கப்பட்டது. Hv1 WTக்கான குறிப்பு h மதிப்புகள் கோடு கோடுகளாகக் காட்டப்படுகின்றன. நட்சத்திரக் குறியீடுகள் பிறழ்ந்த மற்றும் WT பத்திகளுக்கு இடையே புள்ளியியல் ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p D112E பிறழ்வு ஹில் குணகத்தை கணிசமாகக் குறைத்ததைக் கண்டறிந்தோம் (p GBTA பிணைப்புக்கான ஹில் குணகம் Hv1 டைமரில் 1 ஐ விட அதிகமாக உள்ளது மற்றும் மோனோமெரிக் சேனலில் ~1 ஆக மாறுகிறது (படம். 2b) இரண்டு துணைக்குழுக்களில் உள்ள பிணைப்பு தளங்களுக்கிடையேயான அலோஸ்டெரிக் இடைவினைகளின் இருப்புடன் ஒத்துப்போகிறது. வழக்கில், GBTA இன் ஹில் குணகம், பிளாக்கர் ஒரு துணை அலகுடன் பிணைக்கப்பட்ட இருமருடன் பிணைக்கப்பட வேண்டும் ~1. இந்த கணிப்பை நாங்கள் Hv1 F150A-WT இணைக்கப்பட்ட டைமரில் (படம் 4a) சோதித்தோம், அங்கு F150A இன் தொடர்பு GBTAக்கான துணை அலகு WT துணைக்குழுவை விட 2 ஆர்டர்கள் அதிகமாக இருந்தது (படம். 1c மற்றும் 3d). பிறகு 2 μM GBTA இன் அடித்தள செறிவில் WT துணைக்குழுவை தடுப்பதற்கான செறிவு-பதில் வளைவுகளை அளந்தோம். இந்த செறிவில் , தடுப்பான் தோராயமாக 99% F150A துணைக்குழுவையும் (அ) ​​F150A-WT சந்தி டைமரின் திட்ட வரைபடம் தடுக்கும் ஹெமிகேனலை உருவாக்கப் பயன்படுகிறது ({F150A}b-WT/BAO*).வெள்ளை வைரங்கள் பிறழ்வின் இருப்பிடத்தைக் காட்டுகின்றன. BAO* மற்றும் BA*B* மாநிலங்களில், F150A துணைக்குழுவின் தொடர்பு WT துணைக்குழுவை விட அதிகமாக இருக்கும் என எதிர்பார்க்கப்படுகிறது.(b) F150A-WT சேனல்களிலிருந்து புரோட்டான் நீரோட்டங்கள் -80 mV இலிருந்து +120 mV வரையிலான சவ்வு திறனில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்கு பதிலளிக்கும் வகையில் அளவிடப்படுகிறது.pHi = pHo = 6.0 .சாம்பல் தடயங்கள் தடுப்பான் இல்லாத நிலையில் அளவிடப்படும் நீரோட்டங்களைக் குறிக்கின்றன. கருப்பு ட்ரேஸ் (கட்டுப்பாடு) என்பது 2 μM GBTA ஐச் சேர்த்த பிறகு அளவிடப்படும் மின்னோட்டத்தைக் குறிக்கிறது. இந்த செறிவில், WT துணைக்குழு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் தடுக்கப்படவில்லை, அதேசமயம் F150A துணைக்குழு GBTA க்கு முற்றிலும் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது. ({F150A}b-WT).ஜிபிடிஏ செறிவு மேலும் அதிகரித்ததன் விளைவாக, டபிள்யூடி துணைப்பிரிவின் (ஆரஞ்சு மற்றும் சிவப்பு தடயங்கள்) அடைப்பு ஏற்பட்டது.(சி) செறிவு சார்ந்த {F150A}b-WT டைமரின் (இன்ஹிபிட்டர் முன் பிணைக்கப்பட்ட) F150A துணைக்குழு).ஒவ்வொரு புள்ளியும் 3 முதல் 7 அளவீடுகளின் சராசரி தடுப்பு ± SD ஐக் குறிக்கிறது. வளைவுகள் துணை அட்டவணை 1 இல் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ள வெளிப்படையான Kd மதிப்புகளைப் பெறுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஹில் பொருத்தங்களாகும். இன்செட் ஹிஸ்டோகிராம்களில் காட்டப்பட்டுள்ள ஹில் குணகங்கள் துணைப் படம் 3 மற்றும் 4 இல் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ள பொருத்தங்களிலிருந்து தீர்மானிக்கப்பட்டது. Hv1 WT இன் h மதிப்புகள் கோடு கோடுகளாகக் காட்டப்பட்டுள்ளன. WT டைமர் Hv1 (p Hv1 இன் GBTA தடுப்பானது ஓப்பன் சேனலில் அளவிடப்பட்டதால், GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பை திறந்த நிலையில் இன்டர்ஸுபியூனிட் இணைப்பின் பொறிமுறையை ஆய்வு செய்யப் பயன்படுத்தலாம் என்று நாங்கள் கருதினோம். இந்த இரண்டு Hv1 துணைக்குழுக்களும் 19,20,21 உடன் ஒத்துழைக்கப்பட்டதாக முன்பு கண்டறியப்பட்டது 22 மற்றும் கேடிங்கில் ஈடுபட்டுள்ள இன்டர்சுபியூனிட் இணைப்பு சைட்டோபிளாஸ்மிக் சுருள்-சுருள் டொமைன் (சிசிடி) 22,25 மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்ய முன்மொழியப்பட்டது. எனவே, திறந்த நிலையில் உள்ள ஜிபிடிஏ-பைண்டிங் தளங்களுக்கு இடையே இணைப்பதில் சிசிடியும் ஈடுபட்டுள்ளதா என்று கேட்டோம். ட்ரைகிளைசின் S4 டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் துண்டு மற்றும் சுருள்-சுருள் டொமைன் இடையே உள்ள இடைமுகத்தில் உள்ள பிறழ்வுகள், டைமரைசேஷன் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிக்கும் போது, ​​இந்த டொமைனை மீதமுள்ள சேனலில் இருந்து துண்டிக்க முந்தைய ஆய்வுகளில் காட்டப்பட்டது. எனவே, V220G, K221G மற்றும் T222G பிறழ்வுகளின் விளைவை நாங்கள் சோதித்தோம் (படம்). 5a, GGG mutant) GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பில் இரண்டு துணைக்குழுக்கள் ஒன்றாக முக்கியமானவை, ஆனால் CBTA பைண்டிங் தளங்களுக்கு இடையே இன்டர்சபுனிட் அலோஸ்டெரிக் இணைப்பிற்கு CCD நேரடியாக மத்தியஸ்தம் செய்யாது.
(அ) ​​சைட்டோபிளாஸ்மிக் சுருள்-சுருள் டொமைன் (நீல அம்புகள்) மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட இன்டர்சுபியூனிட் இணைப்பிற்கு இடையூறு விளைவிக்க வடிவமைக்கப்பட்ட S4 இன் உள் முனையில் ட்ரைகிளைசின் பிறழ்வு கொண்ட Hv1 டைமரின் திட்ட வரைபடம். துணைக்குழுக்கள் (நீல அம்புகள்) இடையே இணைப்பதில் ஈடுபட்டுள்ள S1 துண்டுகளை சோதிக்க வடிவமைக்கப்பட்ட குறிப்பிடப்பட்ட பிறழ்வுகள்.(c-h) 2GBI (சியான்) மற்றும் GBTA (அடர் சிவப்பு) ஆகியவை செறிவு சார்ந்த முறையில் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட கட்டமைப்பைத் தடுக்கின்றன. ஒவ்வொரு புள்ளியும் சராசரி தடுப்பைக் குறிக்கிறது. ± SD 3 முதல் 10 அளவீடுகள். வளைவானது வெளிப்படையான Kd மதிப்புகளைப் பெறுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு மலைப் பொருத்தமாகும் (துணை அட்டவணை 1ஐப் பார்க்கவும்). இடைக்கணிக்கப்பட்ட ஹிஸ்டோகிராம்களில் உள்ள ஹில் குணகங்கள் முறைகள் பிரிவில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தீர்மானிக்கப்படுகின்றன (துணை அத்தி 3 மற்றும் 4 ஐப் பார்க்கவும்) குறிப்பு h மதிப்புகள் Hv1 WT கோடு கோடுகளாகக் காட்டப்படுகின்றன. நட்சத்திரக் குறியீடுகள் பிறழ்ந்த மற்றும் WT பத்திகளுக்கு இடையே புள்ளியியல் ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p GBTA கூட்டுறவு பிணைப்பின் நேரடி மத்தியஸ்தராக CCDயை நாங்கள் நிராகரித்ததால், VSDகளுக்கிடையேயான தொடர்புகள் பிணைப்பு தளங்களுக்கிடையேயான அலோஸ்டெரிக் இணைப்பில் உள்ளதா என்று நாங்கள் கேட்டோம். GBTA-பிணைப்பு கூட்டுறவு என்பது எச்சம் D112 (படம். 3c) இன் பழமைவாத மாற்றத்தால் அகற்றப்பட்டதைக் கண்டறிந்தோம். S1 டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் பிரிவில். S1 ஆனது, E119 மற்றும் D123 ஆகிய இரண்டு எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்களைக் கொண்டுள்ளது, D112 போன்ற ஹெலிக்ஸின் அதே பக்கத்தில் அமைந்துள்ளது, ஆனால் துண்டின் வெளிப்புற முனை 24 க்கு அருகில் உள்ளது. ஆரம்பகால மூலக்கூறு இயக்கவியல் உருவகப்படுத்துதல்கள் இந்த எச்சங்கள் இணைக்கப்பட்டிருப்பதைக் குறிப்பிட்டன. வாட்டர்லைன்ஸ்36,37 வழியாக D112 க்கு.எனவே, GBTA-பைண்டிங் தளங்களுக்கு இடையே அலோஸ்டெரிக் இணைப்பில் E119 மற்றும் D123 ஈடுபட்டுள்ளதா என்பதை நாங்கள் சோதித்தோம் (படம். 5b).எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாக, D123க்கு அருகில் அமைந்துள்ள பாதுகாக்கப்பட்ட நேர்மறை சார்ஜ் நிலை K125ஐச் சோதித்தோம். ஆனால் S1 ஹெலிக்ஸின் மறுபுறம் (படம் 5b).
E119A, D123A மற்றும் K125A சேனல்களின் செறிவு-சார்ந்த தடுப்பை 2GBI மற்றும் GBTA மூலம் அளந்தோம், மேலும் E119A மற்றும் K125A பிறழ்வுகள், காட்டு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது இரண்டு தடுப்பானின் ஹில் குணகத்தை கணிசமாக மாற்றவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (p > 0.05, படம். 5d,i) ) மறுபுறம், பிறழ்வு D123A GBTA இன் ஹில் குணகத்தை கணிசமாகக் குறைத்தது (p 0.05/14).
இரண்டு துணைக்குழுக்களிலும் 123 ஆம் நிலையில் உள்ள கட்டணத்தை நடுநிலையாக்குவது GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பில் வலுவான மாற்றத்தை ஏற்படுத்தியதால், இரண்டு துணைக்குழுக்களிலும் கட்டணத்தை மாற்றியமைப்பது ஒரு சிறிய விளைவை மட்டுமே ஏற்படுத்தியது, நாங்கள் ஒரே ஒரு துணைக்குழுவை மட்டும் சார்ஜ் சேனலுடன் சேர்க்க பகுப்பாய்வை நீட்டித்தோம். சி-டெர்மினல் சப்யூனிட்டில் (படம் 5 பி) D123R மாற்றுடன் Hv1-இணைக்கப்பட்ட டைமர்களை உருவாக்கியது மற்றும் GBTA மற்றும் 2GBI மூலம் செறிவு-பதில் தடுப்பை அளந்தோம். WT-D123R சேனல்களுடன் பிணைக்கும் GBTA இன் ஹில் குணகம் அதை விட கணிசமாக அதிகமாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். காட்டு-வகை Hv1 (p D112E பிறழ்வு WT-D123R பின்னணியால் உருவாக்கப்பட்ட GBTA-பைண்டிங் ஹில் குணகத்தின் அதிகரிப்பை நீக்கியது என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம். 5b,h மற்றும் துணை படம். 4). 2GBI பிணைப்பின் ஹில் குணகத்தின் மீதான விளைவும் நீக்கப்பட்டது ( படம். 5h மற்றும் துணை படம். 3).இந்த கண்டுபிடிப்புகள், நிலை 123 இல் உள்ள எதிர் மின்னூட்டங்களால் ஏற்படும் துணைக்குழுக்களுக்கு இடையே மேம்படுத்தப்பட்ட அலோஸ்டெரிக் இணைப்பு, D112 நிலையில் உள்ள பிணைப்பு தளம் தொந்தரவு செய்யப்படும்போது வலுவான பிணைப்பு ஒத்துழைப்பாக மொழிபெயர்க்காது.
அருகிலுள்ள திறந்த துணைக்குழுக்களில் உள்ள D123 எச்சங்கள் மின்னியல் ரீதியாக ஒன்றோடொன்று தொடர்பு கொள்ளும் அளவுக்கு நெருக்கமாக இருந்தால், எதிர்மறைக் கட்டணங்களுக்கிடையே உள்ள விரட்டும் தொடர்பு, அஸ்பார்டிக் அமிலத்தை அர்ஜினைனுக்கு மாற்றுவதன் மூலம் எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறை கட்டணங்களின் கலவையாக மாற்றப்படும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். அவற்றுக்கிடையேயான கவர்ச்சிகரமான தொடர்பு. ஒரு துணைக்குழு (WT-D123R டைமர்).கவர்ச்சிகரமான இடைவினைகள் S1 துண்டின் வெளிப்புற முனைகளுக்கு இடையே உள்ள இடைமுகத்தை வலுப்படுத்தலாம், இது துணைக்குழுக்களுக்கு இடையே வலுவான அலோஸ்டெரிக் இணைப்பு மற்றும் அதிகரித்த GBTA-பைண்டிங் ஒத்துழைப்புக்கு வழிவகுக்கும்.
இந்த கருதுகோளை ஆதரிக்க, S1 பிரிவின் வெளிப்புற முனைகளுக்கு இடையே உள்ள இடைமுகத்தை வலுப்படுத்துவதற்கான வழியை நாங்கள் தேடினோம், இது 123 இல் சார்ஜ் மாறுதலில் இருந்து வேறுபட்டது. லீ மற்றும் பலர். Hv1 எச்சம் I127 ஐ சிஸ்டைனாக மாற்றுவது முன்பு கண்டறியப்பட்டது. தன்னிச்சையான இன்டர்சுபியூனிட் குறுக்கு-இணைப்பை விளைவிப்பதற்காக நிலை 127 இல் உள்ள சிஸ்டைன்கள், வலுவான S1-S1 தொடர்புகளை விளைவிக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது, 123 இல் கட்டணத்தை மாற்றுவதன் மூலம் கவனிக்கப்பட்டதைப் போன்றே GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பில் விளைவைக் கொண்டுள்ளது.
10 mM β-mercaptoethanol (βME) (படம். 6a) முன்னிலையில் மற்றும் இல்லாத நிலையில் GBTA மற்றும் 2GBI மூலம் Hv1 I127C இன் செறிவு சார்ந்த தடுப்பை அளந்தோம். எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் கரைசலில் முகவர் சேர்க்கப்படுகிறது. ஒரே ஒரு துணைக்குழுவில் (WT-I127C) சிஸ்டைன் மாற்றுடன் இணைக்கப்பட்ட டைமர் எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 6a). தன்னிச்சையான இன்டர்சுபியூனிட் குறுக்கு இணைப்பின் எந்த விளைவையும் எங்களால் அளவிட முடியவில்லை. 2GBI இன்ஹிபிஷனில் I127C துணைக்குழுக்களுக்கு இடையில், Hv1 உடன் I127C பிணைப்புக்கான ஹில் குணகம், βME உடன் அல்லது இல்லாமல், மோனோசைஸ்டீன் மாற்று டைமர்களுடன் பிணைப்பதில் இருந்து கணிசமாக வேறுபட்டது. ஹில் குணகம் WT-I127C (படம். 6b மற்றும் துணை படம் 3) வேறுபடுத்த முடியவில்லை. இதற்கு முற்றிலும் மாறாக, GBTA தடுப்பில் தன்னிச்சையான இன்டர்சுபியூனிட் குறுக்கு இணைப்பின் வியத்தகு விளைவை அளந்தோம். βME இல்லாத நிலையில் Hv1 I127C உடன் பிணைப்பதற்கான ஹில் குணகம் (கிராஸ்லிங்க் ஆன்) βME முன்னிலையில் அளவிடப்பட்டதை விட அதிகமாக இருந்தது (கிராஸ்லிங்க் ஆஃப்) அல்லது டைமரை இணைக்க WT-127C ஐப் பயன்படுத்துகிறது (கிராஸ்லிங்க் இல்லாத நிலையில்) (படம். 6c மற்றும் துணை படம். 4), இது அலோஸ்டெரிக் இணைப்பு என்பதைக் குறிக்கிறது. பிணைப்பு தளங்களுக்கிடையில் S1 துண்டுகளின் வெளிப்புற முனைகளுக்கு இடையில் டிஸல்பைட் பிணைப்புகள் உருவாக்கம் மூலம் பெரிதும் மேம்படுத்தப்படுகிறது. WT-D123R டைமரில் 123 ஆம் இடத்தில் உள்ள அஸ்பார்டேட் மற்றும் அர்ஜினைனின் கவர்ச்சிகரமான மின்னியல் தொடர்புகள் இடையே அலோஸ்டெரிக் இணைப்பின் அதிகரிப்புக்கு வழிவகுக்கிறது என்ற எங்கள் விளக்கத்தை இந்த முடிவுகள் ஆதரிக்கின்றன. துணை அலகுகள்.
திறந்த நிலை இணைப்பு என்பது இரண்டு துணைக்குழுக்களில் உள்ள S1 பிரிவின் வெளிப்புற முனைகளுக்கு இடையே நேரடி உடல் தொடர்புகளால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது.
(அ) ​​பிறழ்ந்த Hv1 டைமர்கள் மற்றும் லிங்கர் டைமர்களின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம், இன்டர்சபுனிட் சிஸ்டைன் கிராஸ்லிங்க்ஸ் GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பை எவ்வாறு பாதிக்கிறது என்பதை ஆராய வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது.(bd) 2GBI (b,d) மற்றும் GBTA (c, e) எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் கரைசலில் 10 mM βME முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில். ஒவ்வொரு புள்ளியும் 3 முதல் 10 அளவீடுகளின் சராசரி தடுப்பு ± SD ஐக் குறிக்கிறது. வளைவு என்பது Kd மதிப்புகளைப் பெறுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு மலைப் பொருத்தமாகும் (துணை அட்டவணை 1ஐப் பார்க்கவும்).இன்செட் ஹிஸ்டோகிராம்களில் உள்ள ஹில் குணகங்கள் துணை அத்தி 3 மற்றும் 4 இல் பதிவாகியுள்ள பொருத்தங்களில் இருந்து தீர்மானிக்கப்பட்டது. (c,e) இல் உள்ள நட்சத்திரங்கள் புள்ளியியல் ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிப்பிடுகின்றன வெவ்வேறு GBTA தடுப்பு நிலைகளுக்கு இடையே (p 0.05).
βME இல்லாத நிலையில், D112E I127C Hv1 டைமருடன் பிணைக்கும் GBTA இன் ஹில் குணகம், குறைக்கும் முகவர்கள் (படம். 6e மற்றும் துணைப் படம் 4) முன்னிலையில் அளவிடப்பட்டதை விட கணிசமாக அதிகமாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது D112E பிறழ்வைக் குறிக்கிறது. சிஸ்டைன் 127 இன் குறுக்கு-இணைப்பின் விளைவாக GBTA பிணைப்பு ஒத்துழைப்பின் அதிகரிப்பை ஒழிக்கவில்லை. D112E, I127C Hv1 டைமர்களுடன் 2GBI பிணைப்பின் ஹில் குணகம் D112E பிறழ்வால் கணிசமாக பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 1).6d மற்றும் துணை. படம் 3).
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், கவர்ச்சிகரமான மின்னியல் இடைவினைகள் மூலமாகவோ அல்லது மாற்று சிஸ்டைன்களுக்கு இடையே கோவலன்ட் பிணைப்புகளை உருவாக்குவதன் மூலமாகவோ அருகிலுள்ள Hv1 துணைக்குழுக்களில் உள்ள S1 துண்டுகளின் வெளிப்புற முனைகளுக்கு இடையேயான தொடர்பு மூலம் GBTA பிணைப்பு மேம்படுத்தப்படுகிறது என்று இந்த கண்டுபிடிப்புகள் தெரிவிக்கின்றன. கூட்டுறவு மீதான கவர்ச்சிகரமான மின்னியல் இடைவினைகளின் விளைவை பிறழ்வு D112E மூலம் ஒழிக்க முடியும், கோவலன்ட் பிணைப்புகளின் விளைவு முடியாது.
குவானிடைன் வழித்தோன்றல்களை Hv1 சேனல்களுடன் பிணைப்பதற்கான வேதியியல் இடத்தை நாங்கள் ஆராய்ந்ததில், GBTA போன்ற 2-guanidinothiazoles 2-guanidinobenzimidazoles (படம். 1c) ஐ விட செங்குத்தான செறிவு சார்ந்திருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். மற்றும் மோனோமெரிக் சேனல்கள் (படம். 2a,b) மற்றும் டிமெரிக் சேனலில் ஒரு துணைக்குழு தடுப்பானுடன் (படம். 4) முன் பிணைக்கப்பட்டிருந்ததால், GBTA மூலம் Hv1-ஐ தடுப்பது ஒரு ஒருங்கிணைந்த செயல்முறையாகும், மேலும் இரண்டு துணைக்குழுக்களில் உள்ள சேர்மங்களின் பிணைப்புத் தளங்கள் அலோஸ்டெரிக் முறையில் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. GBTA ஆனது திறந்த சேனலுடன் பிணைக்கிறது என்பதைக் கண்டறிந்தது, தொடர்புடைய கலவை 2GBI32 க்கு முன்பு காட்டப்பட்டது, அலோஸ்டெரிக் இணைப்பை குறிப்பாக திறந்த நிலையில் மதிப்பிடலாம் என்று அறிவுறுத்துகிறது. நமது கூட்டுறவு பிணைப்பு மாதிரி GBTA (படம் 2c) மூலம் Hv1 இன் தடுப்பை அளவுரீதியாக விவரிக்க முடிந்தது மற்றும் சவ்வு மறுமுனைப்படுத்தலுக்குப் பிறகு சேனல் டெயில் நீரோட்டங்களின் சிதைவின் மீது 2GBI மற்றும் GBTA இன் வெவ்வேறு விளைவுகளை விளக்க முடிந்தது, இது பிணைப்பு செயல்முறையின் எங்கள் விளக்கத்தை ஆதரிக்கிறது.
இரண்டு பிணைப்பு தளங்கள் (Hv1 போன்றவை) கொண்ட அலோஸ்டெரிக் புரதத்தில் அடையக்கூடிய அதிகபட்ச ஹில் குணகம் 2. 1.31 குணகத்துடன் Hv1 காட்டு-வகையை பிணைக்க GBTA ஐ அளந்தோம், இது Hv1 I127C இல் 1.88 ஆக அதிகரித்தது. சினெர்ஜிஸ்டிக் ஃப்ரீ எனர்ஜி, குறைந்த மற்றும் அதிக இணைப்புத் தளங்களின் பிணைப்பு இலவச ஆற்றல்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடு (முறைகளைப் பார்க்கவும்), Hv1 காட்டு-வகையில் 1.3 கிலோகலோரி/மோல் மற்றும் Hv1 I127C விஷயத்தில் 2.7 கிலோகலோரி/மோல். ஹீமோகுளோபினுக்கு ஆக்ஸிஜன் என்பது கூட்டுச் செயல்முறையின் மிகவும் பிரபலமான மற்றும் நன்கு ஆய்வு செய்யப்பட்ட எடுத்துக்காட்டு. kcal/mol, சோதனை நிலைமைகளைப் பொறுத்து
எங்கள் சினெர்ஜி மாதிரியில், GBTA மூலக்கூறுகளை ஒரு துணைக்குழுவுடன் பிணைப்பதால், அருகிலுள்ள துணைக்குழுவின் பிணைப்புத் தொடர்பை அதிகரிக்கிறது. முதல் பிணைப்பு நிகழ்வின் (தூண்டப்பட்ட பொருத்தம்) விளைவாக பிணைப்பு சூழலின் மறுசீரமைப்பு ஒரு செயல்முறையை நாங்கள் கற்பனை செய்கிறோம். துணைக்குழுக்களுக்கு இடையிலான தொடர்புகளில் ஏற்படும் மாற்றங்கள். இந்த மாற்றங்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, அருகில் உள்ள துணைக்குழுக்கள் தங்கள் பிணைப்பு தளங்களை மாற்றுகின்றன, இதன் விளைவாக இறுக்கமான GBTA பிணைப்பு ஏற்படுகிறது. இந்த செயல்பாட்டின் போது, ​​S1 அஸ்பார்டேட் D112 ஆனது பிணைப்புத் தளத்தின் மறுசீரமைப்பிற்கு பொறுப்பாகும். Hv1 புரோட்டான் ஊடுருவல் பாதையின் ஒரு பகுதியாகவும், தேர்ந்தெடுக்கும் வடிகட்டி 27,28 ஆக செயல்படுவதாகவும் முன்பு காட்டப்பட்டது. இரண்டு Hv1 துணைப்பிரிவுகளில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வடிகட்டிகள் திறந்த நிலையில் இணைக்கப்பட்டுள்ளன என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. படம் 7a ஆனது GBTA பிணைப்பு தளத்தின் தோராயமான இருப்பிடத்தையும், Hv1 VSD அடிப்படையிலான திட்டத்தில் D112, D123, K125 மற்றும் I127 எச்சங்களின் இருப்பிடத்தையும் காட்டுகிறது. Hv1-CiVSP கைமேராவின் படிக அமைப்பில். S1 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் முனையை உள்ளடக்கிய அலோஸ்டெரிக் இணைப்பிற்கான பரிந்துரைக்கப்பட்ட திசைகள் கருப்பு அம்புகளுடன் காட்டப்பட்டுள்ளன.
(a) Hv1 VSD இன் திட்டவட்டம். Hv1-CiVSP கைமராவின் படிகக் கட்டமைப்பின் அடிப்படையில், ஹெலிகல் பிரிவுகள் உருளையாகக் காட்டப்படுகின்றன. இந்த கட்டமைப்பில், S4 பிரிவின் உள் முனை CCD உடன் இணைகிறது (காட்டப்படவில்லை). பிணைக்கப்பட்ட GBTAவின் கணிக்கப்பட்ட இடங்கள் சாம்பல் நிற ஓவல்களாகக் காட்டப்படுகின்றன.கருப்பு அம்புகள் இரண்டு அருகிலுள்ள துணைக்குழுக்களில் பிணைப்பு தளங்களுக்கு இடையே அலோஸ்டெரிக் இணைப்பில் ஈடுபடும் பாதைகளைக் குறிக்கின்றன. ஆய்வு செய்யப்பட்ட S1 எச்சங்களின் நிலைகள் வண்ணக் கோளங்களால் குறிக்கப்பட்டுள்ளன.(b) Hv1 துணைக்குழுக்களின் திட்ட விளக்கப்படம் ஏற்பாடு செய்யப்பட்டுள்ளது. சவ்வு விமானத்தின் புற-செல்லுலார் பக்கத்திலிருந்து பார்க்கப்படும் இரண்டு வெவ்வேறு டைமர் உள்ளமைவுகளில். இடது பேனலில், டைமர் இடைமுகம் S4 ஹெலிக்ஸ் மூலம் உருவாகிறது. இரண்டு VSDகளின் சுழற்சி 20 டிகிரி கடிகார திசையில் சவ்வு விமானத்திற்கு செங்குத்தாக ஒரு அச்சைச் சுற்றி, அதனுடன் இரண்டு S4 ஹெலிகளின் வெளிப்புற முனைகளை (கோடு அம்புகள்) பிரிப்பது, வலதுபுறத்தில் காட்டப்படும் அமைப்பை உருவாக்குகிறது. இந்த கட்டமைப்பில், அருகிலுள்ள துணைக்குழுக்களில் இருந்து D123 மற்றும் I127 எச்சங்கள் ஒன்றாக வர அனுமதிக்கப்படுகிறது.(c) CiVSP VSD இன் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம் 4G80 படிக அமைப்பில் காணப்படும் டைமர் கட்டமைப்பில். CiVSP இல் P140 நிலை Hv1 இல் D123 நிலைக்கு ஒத்துள்ளது.
எச்சம் 123 (123D/123D அல்லது 123R/123R) ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான விரட்டும் மின்னியல் தொடர்பு, திறந்த நிலையில் GBTA-பிணைப்பு ஒத்துழைப்பின் "சாதாரண" நிலையுடன் தொடர்புடையது மற்றும் ஊடாடலை விரட்டலில் இருந்து ஈர்க்கப்பட்ட (123D/123R) க்கு மாற்றுகிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. , அதிகரித்த ஒத்துழைப்பு (படம். 5g).அலனைன் பதிலீடு உடனான வெறுப்பூட்டும் இடைவினையை அகற்றுவதும் கூடுதலான ஒத்துழைப்பிற்கு வழிவகுக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. இருப்பினும், 123A/123A டைமரின் ஒத்துழைப்பில் குறைவு காணப்பட்டது (படம். 5e).ஒன்று சாத்தியமானது. விளக்கம் என்னவென்றால், ஹைட்ரோஃபிலிக் சூழலில் ஹைட்ரோஃபோபிக் எச்சங்களை வைப்பதன் சீர்குலைக்கும் விளைவு, D123 எச்சங்களுக்கிடையில் உள்ள விரட்டும் இடைவினைகளை நீக்குவதன் காரணமாக உறுதிப்படுத்தும் விளைவை விட அதிகமாக இருக்கலாம், இதன் விளைவாக பிணைப்பு ஒத்துழைப்பில் ஒட்டுமொத்த குறைப்பு ஏற்படுகிறது. மோனி மற்றும் பலர் சமீபத்தில் கரைப்பான் அணுகலைப் புகாரளித்தனர் Ciona gutis Ci-Hv1 இன் D171 நிலை (மனித Hv1 இல் D123 உடன் தொடர்புடையது) செயல்படுத்தப்படும் போது அதிகரிக்கப்படுகிறது, D123 திறந்த நிலையில் ஹைட்ரோஃபிலிக் சூழலில் அமைந்துள்ளது என்ற கருத்தை ஆதரிக்கிறது.
Hv1 சேனல்களின் கேட்டிங் பல மாற்றங்கள் மூலம் நிகழ்கிறது என்று அறியப்படுகிறது19,20,26,39,40,41. Qiu et al26, சவ்வு நீக்கத்தின் போது, ​​Ci-Hv1 இன் மின்னழுத்த சென்சார் ஒரு இணக்கமான மாற்றத்திற்கு உள்ளாகிறது, இது சேனலை செயல்படுத்தினாலும் மூடியிருக்கும். , இரண்டு துணை அலகுகளின் பாதையிலும் புரோட்டான்கள் திறந்த கடத்துத்திறனை ஏற்படுத்தும் ஒரு தனித்துவமான மாற்றத்தைத் தொடர்ந்து மின்னழுத்த சென்சாரின் இணக்கமான மாற்றம் மின்னழுத்த-கிளாம்ப் ஃப்ளோரசன்ஸால் கண்காணிக்கப்பட்டது, மேலும் D171 நிலையில் உள்ள பிறழ்வு மூலம் இரண்டாவது மாற்றம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டதாகக் கண்டறியப்பட்டது. ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலின் குழப்பமானது, இணக்கமான மாற்றத்தின் எதிர்வினை ஆயத்தொலைவுகளுடன் ஒரு கட்டத்தில் அருகிலுள்ள துணைக்குழுக்களின் D171 எச்சங்களுக்கிடையில் மின்னியல் தொடர்புகளின் இருப்புடன் ஒத்துப்போகிறது. இந்த விளக்கம் D123 எச்சம் திறந்த நிலையில் மின்னியல் ரீதியாக தொடர்பு கொள்கிறது என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்ததுடன் ஒத்துப்போகிறது. மற்றும் GBTA பிணைப்பு தளங்களுக்கு இடையே அலோஸ்டெரிக் இணைப்பிற்கு மத்தியஸ்தம் செய்கிறது.
ஃபுஜிவாரா மற்றும் பலர், சைட்டோபிளாஸ்மிக் சுருள்-சுருள் டொமைனின் டைமர் இடைமுகம் இரண்டு S4 ஹெலிகள் (படம். 7b, இடது குழு) சவ்வுக்குள் நீண்டுள்ளது என்று முன்மொழிந்தனர். இந்த இன்டர்சபுனிட் தொடர்புகளின் மாதிரியானது சிஸ்டைன் குறுக்கு-இணைக்கும் பகுப்பாய்வு உறையை அடிப்படையாகக் கொண்டது. S4 ஹெலிக்ஸ் மற்றும் CCD ஐ இணைக்கும் பகுதியின் முழு VSD மற்றும் செயல்பாட்டு பகுப்பாய்வு. ஒரு டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் pH சாய்வு இல்லாத நிலையில், Hv1 சேனல்கள் திறக்க கணிசமான சவ்வு டிபோலரைசேஷன் தேவைப்படுகிறது, மேலும் சேனல் முக்கியமாக மூடப்பட்டிருக்கும் சூழ்நிலையில் சிஸ்டைன் கிராஸ்லிங்க்கிங் ஏற்படுகிறது. எனவே, கண்டறியப்பட்ட S4-S4 இடைமுகமானது ஆஃப்-ஸ்டேட் சப்யூனிட் உள்ளமைவைப் பிரதிபலிக்கும். மற்ற ஆய்வுகள், கேட்டிங்17,21,26 இன் போது இன்டர்ஸுபியூனிட் தொடர்புகளில் S1 மற்றும் S2 ஈடுபடுவதற்கான ஆதாரங்களைக் கண்டறிந்துள்ளன. மூடிய நிலைகள், மோனி மற்றும் பலரின் கண்டுபிடிப்புகளுடன் ஒத்துப்போகும் ஒரு யோசனை. கேட்டிங் போது S1 39 நகரும்.
இங்கே, திறந்த நிலையில், S1 ஹெலிக்ஸின் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் முனைகள், துணைக்குழுக்களுக்கு இடையே அலோஸ்டெரிக் இணைப்பிற்கு மத்தியஸ்தம் செய்யும் நேரடி மின்னியல் இடைவினைகளை ஆதரிக்கும் அளவுக்கு நெருக்கமாக இருப்பதைக் காட்டுகிறோம். நீட்டிக்கப்பட்ட S4-S4 இடைவினைகளுடன் கூடிய டைமர் உள்ளமைவில், S1 ஹெலிகள் மிகவும் தொலைவில் உள்ளன. ஒருவரையொருவர் நேரடியாக தொடர்பு கொள்ளாமல். இருப்பினும், சவ்வுத் தளத்திற்கு செங்குத்தாக ஒரு அச்சைச் சுற்றி இரண்டு VSD துணைக்குழுக்களின் 20° கடிகாரச் சுழற்சியானது, இரண்டு S4 ஹெலிகளின் வெளிப்புற முனைகளின் பிரிப்புடன் இணைந்து, S1-S1 உள்ளமைவை சீரானதாக அளித்தது. எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளுடன் (படம். 7b, வலது குழு). திறந்த நிலையில் உள்ள சேனலுக்கான இந்த உள்ளமைவை நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம்.
CiVSP என்சைம் ஒரு மோனோமராக செயல்படுவதாகக் கருதப்பட்டாலும், அதன் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட VSD இன் படிக அமைப்பு ஒரு டைமர் நிலையில் படம்பிடிக்கப்படுகிறது. இந்த டைமரில் உள்ள S1 ஹெலிகளின் வெளிப்புற முனைகள் இடஞ்சார்ந்த அளவில் நெருக்கமாக உள்ளன, மேலும் ஒட்டுமொத்த உள்ளமைவு முன்மொழியப்பட்டதைப் போன்றது. Hv1 க்கு (படம். 7c).CiVSP டைமரில், அருகில் உள்ள துணைக்குழுவில் இருந்து மிக நெருக்கமான எச்சம் 140 இல் புரோலைன் (படம். 7c) இருந்தது. சுவாரஸ்யமாக, CiVSP இல் P140 Hv1 இல் D123 நிலைக்கு ஒத்துள்ளது. மற்றும் CiVSP டைமர்கள் இந்த புரதங்களின் VSD கள் S1 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் முனைகள் தொடர்பு கொள்ளும் ஒரு இடைமுகத்தை உருவாக்கும் உள்ளார்ந்த போக்கைக் கொண்டுள்ளன.
விந்தணு செல் செயல்படுத்துவதில் Hv1 இன் முக்கிய பங்கு இந்த சேனலை ஆண் கருவுறுதலைக் கட்டுப்படுத்துவதற்கான கவர்ச்சிகரமான மருந்து இலக்காக ஆக்குகிறது. மேலும், மைக்ரோக்லியாவில் Hv1 ஐ செயல்படுத்துவது இஸ்கிமிக் ஸ்ட்ரோக்கிலிருந்து மோசமடைவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது. மேம்படுத்தப்பட்ட Hv1 செயல்பாடு குறைந்த அளவோடு தொடர்புடையதாகக் கண்டறியப்பட்டது. மார்பக 12 அல்லது பெருங்குடல் புற்றுநோயால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளின் உயிர்வாழ்வு 13 மற்றும் பி-செல் வீரியம் 11 க்கு பங்களிக்கும் என்று கருதப்படுகிறது .எனவே, Hv1 ஐ இலக்காகக் கொண்ட சிறிய மூலக்கூறு மருந்துகள் நரம்பியல் தடுப்பு முகவர்களாக அல்லது புற்றுநோய் எதிர்ப்பு சிகிச்சைகளாகப் பயன்படுத்தப்படலாம். திறந்த Hv1 துணைக்குழு, அதிகரித்த பிணைப்புத் தொடர்பை ஏற்படுத்துகிறது, Hv1 சேனல்களை இலக்காகக் கொண்ட அதிக சக்திவாய்ந்த மருந்துகளின் வளர்ச்சிக்கு வழிவகுக்கும்.
நிலையான PCR நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி மனித Hv1 இன் தளம் சார்ந்த பிறழ்வு உருவாக்கம் செய்யப்பட்டது. Hv1NCCiVSP கட்டமைப்பில், Hv1 இன் 1-96 மற்றும் 228-273 எச்சங்கள் CiVSP18 இன் 1-113 மற்றும் 240-576 எச்சங்களால் மாற்றப்பட்டன. Hv1-இணைக்கப்பட்ட dimer ஒரு துணைக்குழுவின் சி-டெர்மினஸ் GGSGGSGGSGSGGSGG இணைப்பான் மூலம் இரண்டாவது துணைக்குழுவின் N-டெர்மினஸுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது.பல்வேறு கட்டமைப்புகளைக் கொண்ட pGEMHE பிளாஸ்மிட்கள் Nhe1 அல்லது Sph1 கட்டுப்பாடு என்சைம்கள் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) மூலம் நேர்கோட்டானது மற்றும் ஆர்என்ஏ தொகுப்புடன் செய்யப்பட்டது. T7 mMessage mMachine டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் கிட் (Ambion).1-3 நாட்களுக்கு முன்பு மின் இயற்பியல் அளவீடுகளுக்கு, cRNA ஆனது Xenopus oocytes (50 nl per cell, 0.3-1.5 μg/μl) Xenopus laevis இலிருந்து பெறப்பட்ட V மற்றும் VI ஓசைட்டுகள் (NASCO) Ecocyte Bioscience இலிருந்து. RNA உட்செலுத்தலைத் தொடர்ந்து, செல்கள் 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM பைருவேட், 100 μg/ml °C ஜென்டாமிசின் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ND96 ஊடகத்தில் பராமரிக்கப்பட்டது. .
2-குவானிடினோ-பென்சிமிடாசோல்[1], 2-குவானிடினோ-பென்சோதியாசோல்[2], (4-மெத்தில்-1,3-தியாசோல்-2-யில்)குவானிடைன் [5], (5-புரோமோ-4 -மெத்தில்-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- 5-கார்பாக்சிலேட் [9] மற்றும் (2-குவானிடினோ-4-மெத்தில்-1,3-தியாசோல்-5-யில்)எத்தில் அசிடேட் [10] சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்சில் இருந்து வந்தவை. ஃபாமோடிடின் [7] எம்பி பயோமெடிக்கல்ஸில் இருந்து வந்தது.1-[4 -(4-குளோரோபீனைல்)-1,3-தியாசோல்-2-யில்]குவானிடைன்[11] மற்றும் 1-[4-(3,4-டைமெத்தாக்ஸிஃபீனைல்)-1,3- தியாசோல்-2-யில்]குவானிடைன் [12] Matrix Scientific இலிருந்து.இந்த சேர்மங்கள் வணிக ரீதியாக கிடைக்கக்கூடிய மிக உயர்ந்த தூய்மையானவை. 100 mM இருப்பு கரைசலை உருவாக்க உலர் DMSO இல் கரைத்து, பின்னர் விரும்பிய இறுதி செறிவில் பதிவு கரைசலில் நீர்த்தப்பட்டது. கலவைகள் 3 மற்றும் 4 கீழே ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. குறைந்தபட்சம் 99% தூய்மை.
25 மிலி அக்வஸ் ஹைட்ரோகுளோரிக் அமிலத்தில் (2.5 என்) 2-அமினோ-4-(ட்ரைஃப்ளூரோமெதில்) பென்சினெதியோல் ஹைட்ரோகுளோரைடு (1.02 கிராம், 4.5 மிமீல்) இடைநிறுத்தப்படுவதற்கு திடமான டையான்டியாமைடு (380 மி.கி., 4.5 மிமீல்) சேர்க்கப்பட்டது. 4 மணி நேரம் தீவிரமாகக் கிளறவும். எதிர்வினைக் கலவை அறை வெப்பநிலையில் குளிர்ந்து, 10N பொட்டாசியம் ஹைட்ராக்சைடை படிப்படியாகச் சேர்ப்பதன் மூலம் நடுநிலைப்படுத்தப்பட்டது. உருவான வெள்ளை படிவு வடிகட்டி, குளிர்ந்த நீரில் (3 × 50 மில்லி) கழுவப்பட்டு, ஒரு அடுப்பில் உலர்த்தப்பட்டது ( 65 °C) பல மணிநேரங்களுக்கு, பின்னர் எத்தில் அசிடேட்/பெட்ரோலியம் ஈதரில் இருந்து மீண்டும் படிகப்படுத்தப்பட்டு ஒரு வெள்ளை திடப்பொருளை (500 மி.கி., 48 %); mp 221-222 °C (ஒளி 225-226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (மிகப் பரந்த கள், 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 ஹெர்ட்ஸ்), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z கணக்கிடப்பட்ட மதிப்பு. C9H8F3N4Sக்கு (M, 1) : 261.0419.
Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி, ஒரு சிறிய சோதனைக் குழாயில் எண்ணெய் குளியலில் 200 °C க்கு சூடேற்றப்பட்டது. 300 mg (பெரிய அதிகப்படியான) சயனமைடு மற்றும் 1.0 மி.லி. சூடான கலவையில் ஹைட்ரோகுளோரிக் அமிலம் விரைவாகச் சேர்க்கப்பட்டு, கலவையை எண்ணெய்க் குளியலில் சுமார் 2 நிமிடங்கள் வைத்திருந்தனர், அந்த நேரத்தில் பெரும்பாலான நீர் ஆவியாகிவிட்டது. எதிர்வினை கலவையானது அறை வெப்பநிலையில் குளிர்விக்கப்பட்டது மற்றும் அதன் விளைவாக திடப்படுத்தப்பட்ட பொருள் சிறிய துண்டுகளாக உடைக்கப்பட்டு, ஒரு வெளிர் மஞ்சள் நிற உருவமற்ற திடத்தை வழங்க தண்ணீரால் கழுவப்பட்டது.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d , 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI) (ESI) 1 699 , கண்டறியப்பட்டது: 243.0704.
pClamp10 மென்பொருளைக் கொண்டு Axon Digidata 1440A (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படும் Axopatch 200B பெருக்கியைப் பயன்படுத்தி வெவ்வேறு கட்டுமானங்களை வெளிப்படுத்தும் ஓசைட்டுகளின் உள் மற்றும் வெளிப்புறத் திட்டுகளில் புரோட்டான் மின்னோட்டங்கள் அளவிடப்பட்டன. உள்செல்லுலார் மற்றும் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் தீர்வுகள் ஒரே கலவையைக் கொண்டுள்ளன: 2-100 mMpholi )எத்தனெசல்போனிக் அமிலம் (MES), 30 mM டெட்ராஎதிலாமோனியம் (TEA) மெசிலேட், 5 mM TEA குளோரைடு, 5 mM எத்திலீன் கிளைக்கால்-பிஸ்(2-அமினோஎத்தில்)-N,N,N',N'-டெட்ராசெட்டிக் அமிலம் (EGTA), சரிசெய்யப்பட்டது TEA ஹைட்ராக்சைடுடன் pH 6.0. அனைத்து அளவீடுகளும் 22 ± 2 °C இல் செய்யப்பட்டன. பைப்பேட்டின் அணுகல் எதிர்ப்பானது 1.5-4 MΩ. தற்போதைய தடயங்கள் 1 kHz இல் வடிகட்டப்பட்டு, 5 kHz இல் மாதிரி செய்யப்பட்டு, Clampfit10.2 (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ) மற்றும் Origin8.1 (OriginLab).
Hv1 இன்ஹிபிட்டரின் பல்வேறு செறிவுகளைக் கொண்ட தீர்வுகள் மற்றும் சில சந்தர்ப்பங்களில் 10 mM βME ஆகியவை புவியீர்ப்பு விசையால் குளியலில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன, இது ஒரு VC-6 பெர்ஃப்யூஷன் வால்வு அமைப்புடன் (வார்னர் இன்ஸ்ட்ர.) இணைக்கப்பட்டுள்ளது, இது pClamp மென்பொருள் TTL (டிரான்சிஸ்டர்-) மூலம் அனுப்பப்பட்டது. டிரான்சிஸ்டர் லாஜிக்) சிக்னல்கள். பேட்ச் பைபெட்டின் முன் பொருத்தப்பட்ட 360 μm விட்டம் கொண்ட டெலிவரி முனையுடன் கூடிய மல்டி டியூப் பெர்ஃப்யூஷன் பென்சில் (ஆட்டோமேட் சயின்ஸ்) பயன்படுத்தி விரைவான பெர்ஃப்யூஷன் பரிசோதனைகள் செய்யப்பட்டது. +120 mV depolarizing pulse.GV அளவீடுகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி நிகழ்த்தப்பட்டன. தற்போதைய சிதைவை சரிசெய்யப் பயன்படுகிறது 18 .GV வரைபடம் போல்ட்ஸ்மேன் சமன்பாட்டுடன் பொருந்துகிறது:
சேனல்கள் மற்றும் தடுப்பான்களின் வெவ்வேறு சேர்க்கைகளுக்கான (துணை அட்டவணை 1) வெளிப்படையான விலகல் மாறிலிகள் (துணை அட்டவணை 1) தடையின் செறிவு சார்புநிலையை (சராசரி % inhib மதிப்புகள்) ஹில் சமன்பாட்டுடன் பொருத்துவதன் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது:
இதில் [I] தடுப்பானின் செறிவு I மற்றும் h என்பது மலை குணகம் ஆகும். மலை குணகத்தை கணக்கிட, சமன்பாடு (2) இவ்வாறு மறுசீரமைக்கப்படுகிறது: