Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Nooca browser-ka aad isticmaalayso waxa uu leeyahay taageero xaddidan CSS. Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browserka la cusboonaysiiyay (ama dami qaabka ku habboon ee Internet Explorer) inta ka horeysa, si loo xaqiijiyo taageerada sii socota, waxaan soo bandhigi doonaa goobta iyada oo aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Kanaalka Hv1 danab-gated-proton-ka waa isku-dhafan dimeric ah oo ka kooban laba qaybood oo dareemaha danabka (VSDs), kuwaas oo mid kastaa ka kooban yahay dariiqa qulqulka proton-ka gated Xaaladda furan ee labada VSD-yada waxaa la og yahay inay u dhacaan si wadajir ah; si kastaba ha ahaatee, wax yar ayaa laga yaqaan hababka hoose. Intersubunit interfaces waxay door muhiim ah ka ciyaaraan hababka allosteric; si kastaba ha ahaatee, isdhexgalka noocan oo kale ah laguma aqoonsan kanaalka Hv1 ee furan. Halkan waxaan ku muujineynaa in 2-guanidinothiazole derivatives ay xannibaan laba Hv1 VSDs si wada jir ah oo ay isticmaalaan mid ka mid ah xeryahooda sida baaritaanka isku dhafka allosteric ee u dhexeeya qaybaha furan. Waxaan ogaanay in unugyada ka baxsan unugyada Dhammaadka jajabka transmembrane ee ugu horreeya ee VSD wuxuu sameeyaa interface intersubunit kaas oo dhexdhexaadiya isku xirka goobaha xidhitaanka, halka qaybta gariiradda-duuban aysan si toos ah ugu lug lahayn habkan. Waxaan sidoo kale helnay caddayn xooggan oo ah in kanaalka proton-selective filter uu xakameeyo iskaashiga xannibaya xannibaadda. .
Kanaalada proton-ka ee Voltage-gated ayaa door muhiim ah ka ciyaara noocyo kala duwan oo noole ah, laga bilaabo phytoplankton ilaa bini-aadmiga waa Hv1, taas oo ah sheyga HVCN1 gene2,3.Hv1 (loo yaqaan VSOP) ayaa lagu muujiyay in ay door ka ciyaarto badinta unugyada B4, soo saarista noocyada ogsijiinta falcelinta ee habka difaaca gudaha5,6,7,8, unugga shahwada dhaqdhaqaaqa9 iyo nidaaminta pH ee dareeraha hawada marinka hawada10. Kanaalkani waxa uu ku lug leeyahay dhawr xad-dhaaf ah oo noocyada kansarka ah sida B-unugyada malignancies4,11 iyo kansarka naasaha iyo mindhicirka12,13.Hawsha Hv1 ee xad dhaafka ah ayaa la ogaaday in ay kordhiso awoodda metastatic ee unugyada kansarka 11, 12. Maskaxda, Hv1 ayaa lagu muujiyay by microglia, iyo hawsheeda ayaa lagu muujiyay in ay sii xumeeyaan dhaawaca maskaxda ee moodooyinka ischaemic stroke.
borotiinka Hv1 waxa uu ka kooban yahay xayndaab-dareenka (VSD), kaas oo ka kooban afar qaybood transmembrane oo loo yaqaan S1 ilaa S414.VSD waxay u egtahay qaybaha u dhigma ee volta-gated Na+, K+ iyo Ca2+ channels iyo fosphatases danab-xasaasi ah, sida CiVSP ka Ciona gutis15.In borotiinadan kale, C-terminus ee S4 waxay ku xiran tahay moduleka saamaynta leh, domain pore ama enzyme. In Hv1, S4 waxay ku xiran tahay domain-gariiriyaha (CCD) oo ku yaal dhinaca cytoplasmic ee xuubka Kanaalka waa isku-dhafan isku-dhafan oo ka kooban laba VSD, mid kastaa wuxuu ka kooban yahay marinka gated proton permeation pathway16,17,18. Labadan qaybood ee Hv1 ayaa la ogaaday inay si wada jir ah u furan yihiin Door muhiim ah oo ku saabsan habka gating. Isdhexgalka u dhexeeya subnits gudaha domain gariiradda gariiradda ayaa si fiican loo qeexay sababtoo ah qaab-dhismeedka crystal ee labada domains ee go'doonsan waa la heli karaa22,23. Dhanka kale, interface ka dhexeeya VSDs gudaha xuubka ma aha Si fiican loo fahmay.Qaabka crystal ee borotiinka chimeric Hv1-CiVSP ma bixiyo macluumaadka ku saabsan interface this, sida ururka trimeric ee kakan channel crystallized laga yaabaa in ay ka dhalan karto beddelka Hv1 CCD hooyo by jibbaar leucine khamiir GCN424.
Daraasad dhowaan la sameeyay oo ku saabsan ururka hoose ee kanaalka Hv1 ayaa lagu soo gabagabeeyay in laba S4 helices ay u gudbaan CCD iyada oo aan carqaladeyn ba'an ee qaab dhismeedka labaad, taasoo keentay helices dheer oo ka bilaabma xuubka iyo mashruuca cytoplasm. Daraasadani waxay soo jeedinaysaa in Hv1 VSDs ay midba midka kale la xiriiraan qaybta S4. Si kastaba ha ahaatee, cilmi-baarisyo kale ayaa soo jeediyay is-dhexgalka beddelka ah ee u dhexeeya VSD-yada. Is-dhexgalkaan waxaa ka mid ah S1 qaybaha 17, 21, 26 iyo darafyada S2 qaybta 21. Sababta suurtogalka ah ee isku dhacyada Natiijooyinka daraasaddan ayaa ah in isku-xidhka allosteric ee ka dhexeeya VSD-yada la baaray iyada oo la xiriirta habka gating, taas oo ku xiran gobollada xiran iyo kuwa furan, iyo is-dhexgalka ka dhexeeya VSD-yada ayaa ku kala duwanaan kara isbeddellada kala duwan ee gobolka ee is-waafajinta.
Halkan, waxaan ku ogaanay in 2-guanidinothiazole ay joojiso kanaalka Hv1 iyagoo si isku mid ah ugu xiraya laba VSD oo furan, waxayna isticmaaleen mid ka mid ah xeryahooda, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), si loo baadho isdhexgalka ka dhexeeya subnits ee gobolka furan. interface.Waxaannu ogaannay in qalooca GBTA ee ku xidha si fiican loo sifayn karo qaab qiyaaseed kaas oo ku xidhidhiyaha inhibitor ka mid ah qayb ka mid ah natiijada kordhinta xidhiidhka xidhidhka ee hoose ee ku xiga.Waxaan sidoo kale ogaanay in haraaga D112, filtarrada xulashada ee kanaalka 27, 28 iyo qayb ka mid ah goobta xidhitaanka derivative guanidine 29 xakamaynta GBTA iskaashiga xidhidha. Waxaan tusinaynaa in isku xidhka iskaashiga lagu hayo Hv1 dimer ah, halkaas oo CCD ka sooca qaybta S4, oo soo jeedinaya in intersubunit interface ee CCD si toos ah ma aha. dhex dhexaadinta isku dhafka allosteric ee u dhexeeya GBTA-ku xidhidhiyaha. Taas bedelkeeda, waxaan ogaanay in jajabka S1 uu yahay qayb ka mid ah isdhexgalka u dhexeeya qaybaha hoose iyo soo jeedinta habaynta VSD-yada ku xiga oo leh dhamaadka ka baxsan ee S4 helix ka fog bartamaha dimer si loogu oggolaado jajabka S1 inuu ku jiro xaalad furan.
Xakamaynta molecule yar yar ee Hv1 ayaa faa'iido leh sida daawooyinka kansarka ka hortagga iyo wakiilada neuroprotective. Si kastaba ha ahaatee, ilaa maanta, xeryahooda yar ayaa awooday inay xakameeyaan kanaalka30,31,32,33. Waxaa ka mid ah, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, compound [1] ee Fig. . Horey ayaa loo muujiyey in ay joojiso Hv1 ku dhawaad si wax ku ool ah sida 2GBI marka la tijaabiyo qiyaasta 200 μM (Jaantus 1b) .Waxaan baarnay noocyada kale ee thiazole waxaana ogaanay in qaar ka mid ah ay xannibeen kanaalka oo leh awood la mid ah ama ka weyn GBTA (Jaantus 1 iyo Dheeraad ah). Waxaan go'aaminnay qalooca jawaab-celinta fiirsashada ee afar nooc oo thiazol ah (GBTA iyo xeryahooda [3], [6] iyo [11], sawirka 1c) waxaanan ogaannay inay ka dhaadheer yihiin kuwa 2GBI. The Hill coefficients (h) Noocyada thiazole waxay u dhexeeyaan 1.109 ± 0.040 ilaa 1.306 ± 0.033 (Sawir. 1c iyo Sawirka Dheeraadka ah. goobta xidhitaanka,29,32 waxa aanu u sababnay in ku xidhidhiyaha thiazol ka mid ah qayb ka mid ah ay kor u qaadi karto isku xidhka molecule inhibitor labaad ee subunit ku xiga.GBTA ahayd xarunta tijaabada leh coefficient Hill ugu sarreeya.Sidaa darteed, waxaan u dooranay xaruntan si ay u Daraasad dheeraad ah oo ku saabsan habka isku-xirnaanta isku-xirnaanta oo loo isticmaalo 2GBI tixraac ahaan xakamaynta xun.
(a) Iskudhisyada tijaabada: [1] Tixraaca Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl) guanidine, [4] naphtho[1,2-d] [1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5] (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidine, [6] (5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl) guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10] ] (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetate, [11] 1-[4- (4 -Chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine, 12] 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine .Hv1 proton currents waxaa lagu cabiray huurada gudaha ee Xenopus oocytes si ay uga jawaabto depolarization ka iman kara haynta -80 mV ilaa +120 mV. Inhibitor kasta waxaa lagu daray qubayska ee fiirsashada 200 μM.pHi = pHo = 6.0 Xogtu waa ± SEM (n≥4) ilaa 15 cabbir. Xariiqdu waa taam Hillaac ah oo loo isticmaalo in lagu helo qiimayaasha Kd ee muuqda ee lagu soo sheegay Shaxda Dheeraadka ah 0.033, h (3) = 1.25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (eeg Hababka).
(a,b) Isku-dhafka 2GBI iyo GBTA waxay joojiyeen dimeric iyo monomeric Hv1 qaab-ku-tiirsanaan ku-tiirsanaan. Dhibic kastaa wuxuu matalaa celceliska xannibaadda ± SD ee 3 ilaa 8 cabbirada iyo qalooca waa Hill fit. The Hill coefficients (h) ayaa lagu muujiyay histogaraamyada la galiyay waxaa lagu go'aamiyay taam ahaanshaha lagu sheegay Figs 3 iyo 4. Jawaabta fiirsashada ee GBTA ee lagu muujiyay (a) waxay la mid tahay tan shaxanka. Isku-xidhka iskaashiga ee GBTA ee dimeric Hv1. Xariiqda madow ee adag waxay u taagan tahay ku habboonaanta xogta tijaabada ee isla'egta (6), kaas oo qeexaya qaabka xidhitaanka ee lagu muujiyey (d) -qalloocyada isku dheelitirnaanta kala-soocidda ee dhacdooyinka xidhitaanka koowaad iyo labaad, siday u kala horreeyaan (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM (d) jaantuska jaantuska habka la soo jeediyay ee block Hv1. Xaaladda GBTA, ku xidhida hal qayb oo furan waxay kordhinaysaa xidhiidhka qaybta furan ee ku xigta (Kd2
Si aan tiro ahaan u sharaxno isku-xidhka iskaashiga GBTA ee kanaalka, waxaanu isticmaalnay qaab kaas oo mid kastaaba uu ku xidhi karo molecule hor-joogaha ka dib fal-celinta bimolecular oo leh kala-bax joogto ah Kd1 (Jaantus. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*). Ku xidhiddu waxa ay keentaa in kanaalka uu qaato xaalad ay qaybaha madhan ee soo hadhay ay ku xidhaan horjoogaha ka dib fal-celin bimolecular oo gaar ah oo leh Kd2 joogto ah, halkaas oo Kd2
Xariiqda madow ee adag ee Jaantuska 2c waa ku habboonaanta isle'egta moodeelka ee qalooca jawaab-celinta tijaabinta, taasoo keenaysa Kd1 ee ~ 290 μM iyo Kd2 ee ~ 29 μM (Qaybta Hababka, isla'egta (6)) isku xidhka 2GBI, halkaas oo Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Jaantus. 2d) .Hv1 monomeric, waxaa jira hal goob oo xidhitaan ah iyo hal Kdm (O° + B ⇆ B°).Marka laga hadlayo GBTA, Kdm waxay ku dhowdahay 54 μM, oo la mid ah Kd1 marka loo eego Kd2 (Jaantus. 2d) Si kale haddii loo dhigo, goobta xidhitaanka monomerku waxay ku jirtaa qaabaynta (O°) oo la mid ah heerka sare ee xidhiidhka (BO*) marka loo eego kuwa hoose- gobolka xidhiidhka (OO) ee dimer, oo ay u badan tahay inay sabab u tahay baabi'inta is-dhexgalka u dhexeeya qaybaha hoose.
Sida hore loogu muujiyey 2GBI32, waxaan ogaanay in GBTA ay xakamaysay qulqulka Hv1 iyada oo xannibaysa kanaalka marka ay furan tahay halkii ay ka dhigi lahayd mid adag in la furo (Jaantuska Dheeraadka ah 2a,b,d) iyada oo laga jawaabayo dib-u-soo-celinta xuubka, laakiin dhacdadan laguma arag GBTA (Jaantuska Dheeraadka ah. 2c) . Joogitaanka Hv1 inactivation ee joogitaanka 2GBI, albaabbada qayb kasta ma xiri karaan ilaa xannibaadaha ka tago goobta xiritaanka ("" Farsamada albaabka lugaha”), iyo 2GBI waxay furfuraysaa si ka gaabis ah intay albaabadu u dhow yihiin. Haddii hal qayb oo Hv1 ah la xidho oo la xidho, halka qaybta ku xigtana ay weli xanniban tahay, xidhidhaynta molecules 2GBI ee soo hadhay waxay noqotaa mid gaabis ah (qabsashada xannibaadda). Noocyada kanaalka cimri dheer Kaliya hal subunit ayaa u dhaqma protons ku meel gaadh ah ka hor inta aan la xidhin oo wax weyn ku biirin dabada si tartiib ah u qudhunaysa.
Helitaanka in qudhunka qulqulka dabada Hv1 aan si weyn hoos ugu dhicin joogitaanka GBTA (Jaantuska Dheeraadka ah. 2c) waxay la socotaa habka isku dhafka ah ee xannibaadaha (Jaantus. 2d) .Hal mar GBTA molecule uu ka furmo qaybta Hv1. , Xidhiidhka xannibaadda ee qaybta hoose ee ku xigta waxay hoos u dhigtaa qiyaastii 10-laab, taas oo door bida habka unbinding. Tani waxay ka dhigan tahay in molecule labaad ee GBTA uu leeyahay fursad aad u sarreeya oo ah inuu furo ka hor inta uusan ku dhicin kanaalka. Noocyada kanaalka dheer ee nool soo saar kaliya hal qayb oo xannibaya ayaa la filayaa inay aad uga badnaan doonto joogitaanka GBTA marka loo eego joogitaanka 2GBI, taasoo keenta suuska dabada oo degdeg ah.
Si GBTA ay si wada jir ah ugu xidho labada qaybood ee Hv1, meelaha xidhidhisku waa in si isku mid ah loo wada xidho. Goob kasta oo xidhitaanku waa inay awood u yeelataa: 1) kicinta silsilad dhacdooyin ah oo xidhiidh la leh qaybaha hoose ee ku xidhan horjoogaha, iyo 2) dhexdhexaadinta ka gudubka xidhiidh hoose ilaa xidhidh sare. Waxaanu ku sababeeyay in haddii hadhaaga gaarka ah ee goobta xidhitaanka ay gacan ka geystaan geeddi-socodka iskaashiga, isbeddelkoodu waa inuu beddelaa isku-dhafka Hill ee qalooca jawaab-celinta-fiirsashada GBTA ee Hv1. Residues D112, F150 , S181 iyo R211 ayaa hore loo muujiyay inay qayb ka yihiin deegaanka 2GBI29 ee isku xidhka waxaanan qiyaasnay inay si la mid ah ugu lug yeelan doonaan GBTA xidhitaanka (Jaantus. 3A) .Waxaan cabbirnay qalooca jawaab-celinta-celinta ee GBTA ee kanaalada mutant D112E, F150A, S181A , iyo R211S (Jaantus 3) oo la barbar dhigo iskudhafkooda Hill iyo kuwa Hv1 duurjoogta ah, iyaga oo isticmaalaya 2GBI tixraac ahaan. Residue V109 waxay ku taal isla wejiga qaybta S1 sida D112 waxayna leedahay hal wareeg oo dheeri ah gudaha unugga. V109 kuma lug lahayn xidhitaanka 2GBI29, waxaanu u isticmaalnay mutant V109A sidii kontorool (Sawir. 3b)
(a) Hadhaaga Hv1 ee la soo jeediyay ee ku lug leh guanidine derivative binding. Curyaaminta buluuga ah ee daah waxay ku wareegsan yihiin silsilado dhinac ah oo hore loo soo jeediyay kuwaas oo la falgala qaybaha kala duwan ee xarunta 2GBI29. guduud mugdi ah) Tixraaca histogram-yada waxa lagu go'aamiyay ku habboonaanta lagu sheegay Figs 3 iyo 4. Tixraaca h qiyamka Hv1 WT waxa lagu muujiyay xariiqyo la jaray .
Waxaan ogaanay in isku-beddelka D112E uu si weyn hoos ugu dhigay isku-dhafka Hill (p Helitaanka in isku-dhafka Hill ee isku-xidhka GBTA uu ka sarreeyo 1 ee dimer Hv1 oo uu noqdo ~ 1 kanaalka monomeric (Jaantus. 2b) waxay la socotaa jiritaanka isdhexgalka allosteric ee ka dhexeeya goobaha xidhitaanka ee labada qaybood. Haddii tani ay tahay Kiiska, isku-dhafka Hill ee GBTA ee ku xidhan dimer-ka kaas oo xannibayahu ku xidhan yahay hal qayb waa inuu ahaadaa ~ 1. Waxaan ku tijaabinay saadaasha Hv1 F150A-WT dimer ku xiran (Jaantus. 4a), halkaas oo xiriirka F150A Qaybta GBTA waxay ka badan tahay amarrada 2 ee cabbirka ka sarreeya kan WT (Sawirrada 1c iyo 3d) .Waxaannu markaa cabbirnay qalooca jawaab-celinta-fiirsashada ee xannibaadda qaybta WT ee qiyaasta asaasiga ah ee 2 μM GBTA. , xannibayuhu waxa la filayaa in uu xidho ku dhawaad 99% qayb hoosaadka F150A iyo (a) jaantuska jaantuska isgoysyada F150A-WT ee loo isticmaalo in lagu soo saaro hemichannel xannibaya ({F150A}b-WT/BAO*). Xidhiidhka hoose ee F150A waxa la filayaa in uu ka sarreeyo kan WT.(b) Qulqulka Proton ee kanaalka F150A-WT oo lagu cabbiro ka jawaabista isbeddelka awoodda xuubka -80 mV ilaa +120 mV.pHi = pHo = 6.0 Raadka cawlku waxay u taagan yihiin qulqulka lagu cabbiro maqnaanshaha xannibaadaha.Raadiska madow (xakamaynta) waxay u taagan tahay cabbirka hadda la cabbiray ka dib markii lagu daray 2 μM GBTA. Xakamayntan, qaybta WT si weyn looma xannibin, halka qaybta F150A ay ku xiran tahay gebi ahaanba GBTA ({F150A}b-WT) . Kordhinta dheeraadka ah ee uruurinta GBTA waxay keentay xannibaadda qaybta WT (radadka orange iyo casaanka). F150A subunit) Qalloocyada waxay ahaayeen Hill ku habboon loo adeegsaday si loo helo qiimaha Kd ee muuqda ee lagu soo sheegay Shaxda Dheeraadka ah loo muujiyey sida xariiqo jajaban. Xiddigo calaamaduhu waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah marka loo eego WT dimer Hv1 (p Maaddaama xannibaadda GBTA ee Hv1 lagu cabbiray kanaalka furan, waxaanu ku sababnay in GBTA iskaashiga xidhidha loo isticmaali karo in lagu barto habka isku xidhka isku xidhka ee gobolka furan. 22 iyo isku xirka isdhexgalka ee ku lug leh gating ayaa la soo jeediyay in lagu dhexdhexaadiyo cytoplasmic coiled-coil domain (CCD) 22,25. Sidaa darteed, waxaan waydiinay in CCD ay sidoo kale ku lug leedahay isku xirka goobaha GBTA ee gobolka furan. Triglycine isbeddellada is-dhexgalka ee u dhexeeya jajabka transmembrane S4 iyo qaybta gariiradda duuban ayaa lagu muujiyay daraasado hore si loo kala saaro qaybtan inta kale ee kanaalka iyada oo la ilaalinayo daacadnimada dimerization. Sidaa darteed, waxaan tijaabinay saameynta isbeddellada V220G, K221G iyo T222G (Sawir). .5a, GGG mutant) on GBTA ku xidhidhiyaha iskaashiga laba qaybood oo wada jira oo muhiim ah, laakiin CCD si toos ah uma dhexdhexaadiso isku-xidhka isku dhafka ah ee isku xidhka GBTA.
(a) Jaantuska jaantuska Hv1 dimer oo leh isbeddelka triglycine ee dhamaadka gudaha ee S4 oo loogu talagalay in lagu carqaladeeyo isku xidhka isku xidhka dhex dhexaadinta ee ay dhexdhexaadiyaan cytoplasmic gariiradda gariiradda leh ( fallaaro buluug ah). isbeddellada tilmaamaya, oo loogu talagalay in lagu tijaabiyo jajabyada S1 ee ku lug leh isku dhafka u dhexeeya subunits ( fallaadho buluug ah).(c-h) 2GBI (cyan) iyo GBTA (casaanka madow) waxay joojiyaan dhismooyinka la tilmaamay ee hab-ku-tiirsanaan. ± SD oo ah 3 ilaa 10 cabbir. Qaloocadu waxay ahayd taam buur ah oo loo isticmaalo in lagu helo qiyamka Kd ee muuqda (eeg Jadwalka Dheeraadka ah 1) Hv1 WT waxa loo muujiyaa sidii xariiqo jajaban. Xiddigo calaamaduhu waxay muujinayaan kala duwanaanshiyaha muhiimka ah ee u dhexeeya marinnada mutant iyo WT (p Maadaama aanu meesha ka saarnay CCD inay tahay dhexdhexaadiyaha tooska ah ee isku xidhka iskaashiga GBTA, waxaanu waydiinay in isdhexgalka VSD-yadu ay ku lug leeyihiin isku xidhka allosteric ee ka dhexeeya goobaha xidhidhiyaha ee qaybta S1 transmembrane.S1 waxa ku jira laba hadhaaga kale ee taban ee lagu soo oogay, E119 iyo D123, oo ku yaal dhinaca isku midka ah ee helix sida D112, laakiin u dhow dhammaadka dibadda 24 ee jajab. D112 iyada oo loo marayo waterlines36,37.Sidaas darteed, waxaanu tijaabinay in E119 iyo D123 ay ku lug leeyihiin isku-dhafka allosteric ee u dhexeeya goobaha GBTA-xidhitaan (Jaantus. 5b) . Sida xakamaynta taban, waxaanu tijaabinay booska si fiican loo ilaaliyo ee K125, kaas oo ku yaal meel u dhow D123 laakiin dhinaca kale ee Helix S1 (Jaantus. 5b).
Waxaan qiyaasnay xakameynta ku-tiirsanaanta ee E119A, D123A iyo K125A channels by 2GBI iyo GBTA waxaana ogaanay in E119A iyo K125A isbeddellada aysan si weyn u bedelin isku-dhafka Hill ee mid kasta oo ka mid ah inhibitor marka loo eego nooca duurjoogta ah (p> 0.05, Fig. 5d,i) ). Dhanka kale, isu beddelka D123A ayaa si weyn hoos ugu dhigay isku-dhafka Hill ee GBTA (p 0.05/14).
Tan iyo markii la dhexdhexaadiyey eedeymaha booska 123 ee labada qayboodba waxay keentay isbeddel xoog leh oo ku yimid GBTA wada shaqaynta isku xidhan, iyada oo dib u celinta kharashka labada qayboodba ay yeelatay saameyn yar oo keliya, waxaanu kordhinay falanqaynta si loogu daro hal qayb oo keliya oo leh kanaalka rogaya ee charge. soo saaray dimers-ku-xiran Hv1 oo leh beddelka D123R ee qaybta C-terminal (Jaantus. 5b) oo cabbiray ka-hortagga ka-jawaab-celinta GBTA iyo 2GBI. Waxaan ogaanay in isku-dhafka Hill ee GBTA ee ku xidhan kanaalada WT-D123R uu aad uga sarreeyay taas Hv1-nooca duurjoogta ah (p Waxaan sidoo kale ogaanay in isku-beddelka D112E uu baabi'iyay kororka isku-xidhka GBTA-binding Hill ee ay soo saartay asalka WT-D123R (Jaantus. 5b,h iyo Sawirka Dheeraadka ah. 4) Jaantuska 5h iyo Jaantuska Dheeraadka ah 3) Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in isku xidhka allosteric-ka ee la xoojiyey ee ka dhexeeya qaybaha hoose ee ay sababeen eedeymaha ka soo horjeeda ee booska 123 aanay u turjumaynin wada shaqayn adag oo adag marka goobta xidhitaanka ee booska D112 la qaso.
Waxaan u sababeynay in haddii haraaga D123 ee qaybaha furan ee ku dhow ay ku dhow yihiin inay si elektaroonik ah ula falgalaan midba midka kale, isdhexgalka nacaybka ah ee u dhexeeya eedeymaha taban ayaa loo beddeli doonaa isku-dar ah eedeymo taban iyo kuwo togan iyadoo lagu beddelayo aspartic acid arginine. is dhexgalka soo jiidashada leh ee dhexdooda.Hal hoosaad (WT-D123R dimer) .Isdhexgalka soo jiidashada leh ayaa xoojin kara isdhexgalka ka dhexeeya darafyada dibadda ee jajabka S1, taasoo horseedaysa isku-xirnaanta allosteric adag oo ka dhexeeya qaybaha hoose iyo korodhka wadashaqeynta GBTA.
Si aan u taageerno mala-awaalkan, waxaan raadinay hab lagu xoojiyo isdhexgalka u dhexeeya darafyada dibadda ee qaybta S1, taas oo ka duwan qiimaha beddelka booska 123.Lee et al.Mutation of Hv1 hadhaaga I127 ilaa cysteine ayaa hore loo helay. si ay u keento in intersubunit cross-linking17. Intaa waxaa dheer, qaab-dhismeedka crystal ee Hv1-CiVSP chimeric VSD ayaa tilmaamay in I127 waa laga soocay dhamaadka dibadda ee helix S1 hal mar oo kaliya24. Sidaa darteed waxaan weydiiyay in formation of bond covalent ka dhexeeya cysteines ee booska 127, taas oo la filayo in ay keento isdhexgalka S1-S1 xooggan, waxay saameyn ku leedahay GBTA isku-xidhka wadashaqeynta oo la mid ah tii lagu arkay iyadoo la beddelayo kharashka booska 123.
Waxaan ku qiyaasnay xakameynta ku-tiirsanaanta Hv1 I127C ee GBTA iyo 2GBI ee joogitaanka iyo maqnaanshaha 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Jaantus 6a) Wakiilka waxaa lagu daraa xalka ka baxsan unugga. Dimer ku xiran oo leh beddelka cysteine ee hal qayb oo keliya (WT-I127C) ayaa loo adeegsaday xakamaynta xun (Jaantus. 6a) Inta u dhaxaysa qaybaha I127C ee xannibaadda 2GBI, sababtoo ah isku-dhafka Hill ee I127C ee ku xidhan Hv1, oo leh ama aan lahayn βME, aad ayuu uga duwan yahay kan ku xidhka monocysteine dimers beddelka ah. Isku-dheellitirka Hill ma kala saari karo WT-I127C (Jaantus. 6b iyo Jaantuska Dheeraadka ah. 3) . Marka la barbardhigo, waxaan cabbirnay saamaynta weyn ee is-goysyada is-dhaafsiga ah ee xannibaadda GBTA. (crosslink on) aad ayuu uga sarreeyay marka loo eego joogitaanka βME (crosslink off) ama iyadoo la adeegsanayo WT-127C si loogu xidho dimer-ka (maqnaanshaha isku xirka) inta u dhaxaysa goobaha xidhitaanka ayaa si weyn loo wanaajiyey by samaynta curaarta disulfide ee u dhexeeya darafyada dibadda ee jajabyada S1. Natiijooyinkani waxay taageerayaan fasiraaddayada in isdhexgalka soo jiidashada leh ee aspartate iyo arginine ee booska 123 ee natiijooyinka WT-D123R ee natiijada isku-dhafka allosteric ee u dhexeeya qaybaha hoose.
Isku dhafka gobolka-furan waxaa dhexdhexaadiya isdhexgalka tooska ah ee jirka ee u dhexeeya darafyada dibadda ee qaybta S1 ee labada qaybood.
(a) Matalaadda qaabaysan ee mutant Hv1 dimers iyo dimers linker, oo loogu talagalay in lagu baaro sida intersubunit cysteine crosslinks u saameeyaan GBTA isku xidhka wada shaqaynta. e) joogitaanka ama maqnaanshaha 10 mM βME ee xalinta unugyada ka baxsan. Dhibic kasta waxay u taagan tahay celceliska xannibaadda ± SD ee 3 ilaa 10 cabbirada. Qaloocadu waxay ahayd taam buur ah oo loo isticmaalo in lagu helo qiyamka Kd (eeg Jadwalka Dheeraadka ah 1) inta u dhaxaysa xaaladaha kala duwan ee xannibaadda GBTA (p 0.05).
Waxaan sidoo kale ogaanay in maqnaanshaha βME, isku-dhafka Hill ee GBTA ee ku xiran D112E I127C Hv1 dimer aad ayuu uga sarreeyaa marka loo eego joogitaanka wakiilada dhimista (Jaantus. 6e iyo Sawirka Dheeraadka ah 4), taas oo muujinaysa in isbeddelka D112E ma baabi'in kororka wadashaqeynta isku xirnaanta GBTA taasoo ka dhalatay isku-xirnaanta cysteine 127. Isku-dhafka Hill ee 2GBI ee ku xiran D112E, I127C Hv1 dimers sidoo kale si weyn uma saameynin isbeddelka D112E (Jaantus 1) .6d iyo Dheeraad ah Sawirka 3).
Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in isku xidhka GBTA ay wanaajiso isdhexgalka ka dhexeeya darafyada S1 ee qaybaha Hv1 ee ku xiga iyada oo loo marayo is dhexgalka elektrostatic soo jiidasho leh ama iyada oo la samaynayo curaarta covalent ee ka dhexeeya isku dhafka cysteines Allosteric ee u dhexeeya goobuhu way kordhaan iyo natiijada wada shaqaynta. Iyadoo saamaynta soo jiidashada isdhexgalka korantada ee iskaashiga lagu baabi'in karo isbeddelka D112E, saamaynta curaarta covalent ma noqon karto.
Sahankayaga ku saabsan booska kiimikaad ee diyaar u ah in lagu xidho derajooyinka guanidine ee kanaalka Hv1, waxaan ogaanay in 2-guanidinothiazoles sida GBTA ay leeyihiin ku tiirsanaanta feejignaanta qotodheer marka loo eego 2-guanidinobenzimidazoles (Jaantus. 1c) . iyo kanaalada monomeric (Sawir 2a,b) iyo kanaalka dimeric kaas oo hal qayb oo hore loogu sii xiray xannibaadaha (Jaantus. 4) ayaa noo horseeday in aan ku soo gabagabeyno in xannibaadda Hv1 ee GBTA falku yahay habka isdhexgalka, iyo Goobaha lagu xiro xeryahooda ee labada qaybood ayaa si isku mid ah loo isku daray. Helitaanka GBTA waxay ku xiran tahay kanaalka furan, sida hore loogu muujiyay xarunta la xidhiidha 2GBI32, waxay soo jeedinaysaa in isku-xidhka allosteric-ka si gaar ah loogu qiimeeyo gobolka furan.Our iskaashiga iskaashiga wuxuu awooday in uu tiro ahaan u sharaxo xannibaadda Hv1 ee GBTA (Jaantus. 2c) oo uu sharaxo saamaynta kala duwan ee 2GBI iyo GBTA ee suuska qulqulka dabada kanaalka ka dib dib-u-soo-celinta xuubka, taas oo taageerta tarjumaadda habka isku-xidhka.
Heerarka ugu sarreeya ee Hill ee lagu gaari karo borotiinka allosteriga ah oo leh laba goobood oo isku xiran (sida Hv1) waa 2. Waxaan cabbirnay GBTA si loo xiro Hv1-nooca duurjoogta ah ee 1.31, kaas oo kordhay 1.88 ee Hv1 I127C. Tamarta xorta ah ee isku-dhafka ah, farqiga u dhexeeya tamarta xorta ah ee xidhidhiyaha ee kuwa ugu hooseeya iyo kuwa ugu sarreeya ee goobaha xidhiidhka (eeg Hababka), waxay ahayd 1.3 kcal/mole marka loo eego Hv1-nooca duurjoogta ah iyo 2.7 kcal/mole ee kiiska Hv1 I127C. Ogsajiinta ilaa hemoglobin waa tusaalaha ugu caansan uguna caansan ee habka iskaashiga ah. kcal/mol, taas oo ku xidhan xaaladaha tijaabada ah38.Sidaas darteed, marka la eego tamarta caalamiga ah, wada shaqaynta GBTA ee ku xidhan Hv1 aad ugama duwana tan O2 ee ku xidhan hemoglobin marka tirooyinka kala duwan ee borotiinka hoose ee labada nidaam la tixgeliyo.
Qaabkayaga isku-dhafka ah, isku-xidhka molecules GBTA ee hal qaybood waxay keenaysaa korodhka xidhiidhka xidhitaanka ee qaybta hoose ee ku xiga. Waxaan aragnaa habraaca dib-u-habaynta jawiga isku-xidhka ah ee ka dhalanaya dhacdadii ugu horreysay ee xidhitaanka (taam ah) waxay keenaysaa Isbeddellada isdhexgalka ka dhexeeya qayb-hoosaadka.Iyadoo laga jawaabayo isbeddelladan, qaybaha ku xiga ayaa beddela goobahooda xiritaanka, taasoo keentay in GBTA la adkeeyo. Inta lagu jiro habkan, S1 aspartate D112 ayaa mas'uul ka ah dib-u-habeynta goobta xiritaanka ee la xiriirta kororka xiritaanka.D112 ayaa hore loogu muujiyay inay qayb ka tahay dariiqa proton proton ee Hv1 iyo inuu u dhaqmo sidii filter filter27,28. Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in filtarrada xulashada ee labada qaybood ee Hv1 ay si isku mid ah ugu lamaan yihiin gobolka furan. Sawirka 7a wuxuu muujinayaa goobta ku dhow ee GBTA ee ku xiran iyo goobta haraaga D112, D123, K125 iyo I127 oo ku saabsan qaabka Hv1 VSD ee ku salaysan Tilmaamaha la soo jeediyay ee isku dhafka allosteric ee ku lug leh dhamaadka unugyada ka baxsan ee S1 ayaa lagu muujiyay fallaadho madow.
(a) Qorshaha Hv1 VSD. Iyada oo ku saleysan qaab dhismeedka crystal ee Hv1-CiVSP chimera, qaybaha helical waxaa lagu muujiyay in ay yihiin cylindrical.In qaabkan, dhamaadka gudaha ee qaybta S4 waxay ku biirtaa CCD (lama muujin). Goobaha la saadaaliyay ee GBTA ee ku xidhan waxa loo muujiyaa sida ovals cawlan in laba qaabaynta dimer kala duwan sida laga arkay dhinaca ka extracellular diyaaradda xuubka. On guddiga bidix, interface dimer waxaa sameeyay S4 helix. Rotation ee labada VSDs 20 digrii saacadda wareeg ah agagaarka dhidibka barbardhigaan diyaaradda xuubka, oo ay la socdaan Kala soocida darafyada dibadda ee labada helices S4 (falaar la jeexjeexay), waxay soo saartaa habaynta lagu muujiyay dhinaca midigta qaabeynta dimer ee laga helay qaab dhismeedka crystal 4G80. Booska P140 ee CiVSP waxay u dhigantaa booska D123 ee Hv1.
Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in is-dhexgalka elektrostatic-ga nacaybka ah ee u dhexeeya haraaga 123 (123D / 123D ama 123R / 123R) ay la xiriirto "caadi" heerka "caadiga ah" ee GBTA-ku-xidhka iskaashiga ee gobolka furan wuxuuna ka beddelaa isdhexgalka ka soo celinta dib u soo jiidashada (123D/123R) , Kordhinta iskaashiga (Jaantus. 5g) .Waxaa la filayaa in meesha laga saaro isdhexgalka nacaybka leh ee beddelka alanine ay sidoo kale horseedi doonto wadashaqeyn kordhin. Si kastaba ha ahaatee, hoos u dhaca wadashaqeynta 123A / 123A dimer ayaa la arkay (Jaantus. 5e) . sharraxaadda ayaa ah in saameynta xasilloonida gelinta hadhaaga hydrophobic ee deegaanka hydrophilic ay ka miisaan badnaan karto saameynta xasilinta sababtoo ah ciribtirka isdhexgalka nacaybka ah ee u dhexeeya hadhaaga D123, taasoo keentay hoos u dhaca guud ee iskaashiga isku xirnaanta.Mony et al.39 dhawaan ayaa sheegay in gelitaanka dareeraha ee booska D171 ee Ciona gutis Ci-Hv1 (oo u dhiganta D123 ee Hv1 bini'aadamka) ayaa kor u kacaya marka la dhaqaajiyo, taageeraya fikradda ah in D123 ay ku taal jawiga hydrophilic ee gobolka furan.
Gating of Hv1 channels waxaa la og yahay inuu ku dhaco iyada oo loo marayo kala-guuro badan19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 ogaaday in marka xuub-depolarization, dareemaha danab ee Ci-Hv1 maro isbedel conformal ka tago kanaalka firfircoon laakiin weli xiran. , oo ay ku xigto isbeddel kala duwan oo keena protons si ay u furto socodka labada qaybood ee hoose. Isbeddelka is-beddelka ee dareemaha korantada ayaa lagu kormeeray fluorescence-xajinta, waxaana la ogaaday in kala-guurka labaad uu si xushmad leh u khalkhaliyay isbeddelka booska D171. Qalalaasaha calaamadda fluorescent waxay la socotaa joogitaanka isdhexgalka elektrostatic ee ka dhexeeya hadhaaga D171 ee qaybaha hoose ee ku xiga mar marka qaar ay weheliyaan isku-duwayaasha falcelinta isbeddelka is-beddelka. wuxuuna dhexdhexaadiyaa isku dhafka allosteric ee ka dhexeeya goobaha isku xidhka GBTA.
Fujiwara et al25 waxay soo jeedisay in is-dhexgalka dimer-ka ee cytoplasmic coiled-coil domain uu ku fido xuubka si uu ugu jiro laba helices S4 (Jaantus. 7b, guddiga bidix) .Habka is dhexgalka intersubunit wuxuu ku salaysan yahay falanqaynta isku dhafka ah ee cysteine. VSD oo dhan iyo falanqaynta shaqeynta ee gobolka isku xira helix S4 iyo CCD. Maqnaanshaha pH gradient transmembrane, kanaalka Hv1 waxay u baahan yihiin depolarization xuub weyn si loo furo, iyo cysteine crosslinking waxay ku dhacdaa xaaladaha halka kanaalka uu inta badan xiran yahay. Sidaa darteed, interface-ka S4-S4 ee la ogaaday waxay u badan tahay inuu ka tarjumayo qaabeynta qaybta hoose ee ka baxsan gobolka. Daraasado kale ayaa helay caddayn ku lug leh S1 iyo S2 ee isdhexgalka isdhexgalka inta lagu jiro gating17,21,26 oo soo jeedinaya in kanaalada laga yaabo inay qaataan habab hoosaadyo kala duwan oo furan iyo gobolada xiran, fikrad la socota natiijooyinka Mony et al. S1 dhaqaaqa 39 inta lagu jiro gating.
Halkan, waxaan ku tusineynaa in, gobolka furan, cidhifyada ka baxsan ee S1 helix ayaa ku filan si ay u taageeraan isdhexgalka tooska ah ee elektrostatic kaas oo dhexdhexaadinaya isku-xirnaanta isku-dhafka ah ee u dhexeeya qaybaha hoose. Si kastaba ha ahaatee, wareegtada 20 ° saacadda ee labada qaybood ee VSD ee ku wareegsan dhidibka ku habboon diyaaradda xuubka, oo ay weheliso kala soocida darafyada dibadda ee labada helices S4, waxay keentay qaabeynta S1-S1 oo joogto ah. natiijooyinkayaga (Jaantus. 7b, guddiga saxda ah) Waxaan kugula talineynaa qaabeynta kanaalka ee gobolka furan.
Inkasta oo enzyme CiVSP loo maleynayo inuu u shaqeeyo sidii monomer, qaab dhismeedka kristanta ee VSD ee go'doonsan waxaa lagu qabtaa xaalad dimer ah. Cidhifyada dibedda ee helices S1 ee dimer-kan ayaa si siman isugu dhow, qaabka guudna wuxuu la mid yahay kan la soo jeediyay. loogu talagalay Hv1 (Jaantus. 7c) .CiVSP dimer, hadhaaga ugu dhow ee qaybta hoose ee ku xiga waxay ahayd proline booska 140 (Jaantus. 7c). Waxa xiiso leh, P140 ee CiVSP waxay u dhigantaa booska D123 ee Hv1. Isku ekaanshaha qaabeynta hoose ee u dhexeeya Hv1 iyo CiVSP dimers waxay soo jeedinayaan in VSD-yada borotiinnadan ay leeyihiin u janjeero gudaha ah si ay u sameeyaan is-dhexgal halkaasoo darafyada unugyada ka baxsan ee S1 ay is dhexgalaan.
Doorka muhiimka ah ee Hv1 ee firfircoonida unugyada shahwada waxay ka dhigaysaa kanaalkan bartilmaameed daroogo soo jiidasho leh oo lagu xakameynayo bacriminta ragga. Intaa waxaa dheer, firfircoonida Hv1 ee microglia ayaa la muujiyay inay ka sii dari doonto soo kabashada ischaemic. badbaadada bukaanada qaba naasaha 12 ama kansarka mindhicirka 13 waxaana loo maleynayaa inay gacan ka geystaan malignanciyada unugyada B-unugyada Hv1-hoosaadka furan, taasoo horseedaysa isu-xidhnaanta korodhka, waxay horseedi kartaa horumarinta dawooyin awood badan oo lagu beegsanayo kanaalada Hv1.
Mutagenesis-ku hagayo ee Hv1 ee bini'aadamka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo farsamooyinka PCR ee caadiga ah. Dhismaha Hv1NCCiVSP, hadhaaga 1-96 iyo 228-273 ee Hv1 waxaa lagu bedelay hadhaaga 1-113 iyo 240-576 ee CiVSP18. Gudaha Hv1-linked dimer, C-terminus ee hal qeybood ayaa ku xiran N-terminus ee qaybta labaad iyada oo loo marayo isku xirka GGSGGSGGSGSGGSGG. Plasmaidyada pGEMHE ee ka kooban dhismooyinka kala duwan ayaa lagu dhejiyay Nhe1 ama Sph1 enzymes xaddidan (New England Biolabs) iyo isku-darka RNA ayaa lagu sameeyay T7 mMessage mMachine qalab qoraal ah (Ambion) .1-3 maalmood ka hor cabbirada elektiroonigga ah, cRNA waxaa lagu duray Xenopus oocytes (50 nl halkii unug, 0.3-1.5 μg / μl) .Marxaladda V iyo VI oocytes ee Xenopus laevis (NASCO) ayaa la helay. Laga soo bilaabo Ecocyte Bioscience.Ka dib duritaanka RNA, unugyada waxaa lagu hayaa ND96 dhexdhexaad ah oo ka kooban 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gent . .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl) guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- 5-carboxylate [9] iyo (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetate [10] waxay ka socdeen Sigma-Aldrich.Famotidine [7] waxay ka socotay MP Biomedicals.1-[4] -(4-Chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl]guanidine [11] iyo 1-[4- (3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-yl]guanidine [12] wuxuu ahaa Laga soo bilaabo Matrix Scientific. Xeryahooda ayaa ah kuwa ugu nadiifsan ee ugu sarreeya ee ganacsi ahaan la heli karo. Waxay ku milmeen DMSO qalalan si ay u soo saaraan 100 mM xal kayd ah, ka dibna lagu qasi jiray xalka duubista ee dareenka kama dambaysta ah ee la rabo. ugu yaraan 99% daahirnimo.
Joojinta 2-amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) ee 25 mL ee aqueous hydrochloric acid (2.5 N) ayaa lagu daray dicyandiamide adag (380 mg, 4.5 mmol), iyo natiijada isku dhafka ah ee heterogeneous. waxaa lagu soo celiyay kicin xoog leh oo loogu talagalay saacadaha 4. Isku-darka falcelinta ayaa la qaboojiyey heerkulka qolka waxayna dhexdhexaadisay si tartiib tartiib ah 10N potassium hydroxide. Da'da cad ee la sameeyay ayaa la sifeeyay, lagu dhaqay biyo qabow (3 × 50 ml), oo la qalajiyey foornada ( 65 °C) dhowr saacadood, ka dibna dib loo soo celiyay ethyl acetate / petroleum ether si loo siiyo cad cad (500 mg, 48%); mp 221–222 °C (iftiin 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (aad u ballaaran s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d) , 1 H, J = 8.1 Hz) = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z la xisaabiyay.C9H8F3N4S (M + H)+: 261. : 261.0419.
Naphtho[1,2-d] thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), oo la soo saaray sidii hore loo sharraxay, ayaa lagu kululeeyay 200 °C ee qubeyska saliidda ee tuubo yar oo tijaabo ah.300 mg (dhaaf weyn) cyanamide iyo 1.0 ml conc.To xarunta kulul waxaa lagu daray hydrochloric acid si degdeg ah iyo isku dar ah waxaa lagu hayaa qubeyska saliidda ilaa 2 daqiiqo, inta lagu guda jiro waqtiga inta lagu guda jiro inta badan oo biyo ah. waa la jejebiyey oo la jarjaray oo lagu maydhay biyo si ay u noqoto midab huruud ah oo adag.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H). , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d , 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150) MHZ, DMSO-D6): Δ Δast = 122.7, 123.7, 123.7, 122.7, 122.7, 122.7, 132.7, 132.7, 132.7, 132.7, , helay: 243.0704.
Qulqulka Proton-ka waxaa lagu cabbiray balastar gudaha iyo dibadda ah ee oocytes oo muujinaya dhismayaal kala duwan iyadoo la adeegsanayo cod-weyneeye Axopatch 200B ah oo ay maamusho Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) oo leh software pClamp10. Intracellular iyo xalalka unugyada ka baxsan waxay leeyihiin isku mid ah: 100 mM 2-(N-morpholino ethanesulfonic acid (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM shaaha chloride, 5 mM ethylene glycol-bis (2-aminoethyl) -N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA), hagaajin pH 6.0 oo leh TEA hydroxide. Dhammaan cabbirada waxaa lagu sameeyay 22 ± 2 ° C. pipette wuxuu leeyahay caabbinta gelitaanka ee 1.5-4 MΩ. Raad-raacyada hadda ayaa lagu sifeeyay 1 kHz, laga soo qaaday 5 kHz waxaana lagu falanqeeyay Clampfit10.2 (Aaladaha Molecular ) iyo Asalka8.1 (Asal Lab).
Xalalka ay ku jiraan uruurinta kala duwan ee Hv1 inhibitor iyo xaaladaha qaarkood 10 mM βME ayaa lagu soo galiyay qubeyska cuf-jiidadka iyada oo loo marayo kala duwanaansho ku xiran nidaamka valve perfusion VC-6 (Warner Instr.), kaas oo la sii maray pClamp software TTL (Transistor- Transistor Logic) calaamadaha. Tijaabooyin dhiigkar ah oo degdeg ah ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo qalin qalimaan tuubo badan ah (AutoMate Sci.) oo leh caarada gaarsiinta dhexroor 360 μm ah oo lagu dhejiyay pipette balastar ah. Xakamaynta kanaalka waxaa lagu go'aamiyay cabbirada amperometric isochronal dhamaadka + 120 mV garaaca garaaca wadnaha.Cabbirada GV ayaa la sameeyay sidii hore loogu sharraxay18,20.Xubabka dabada ayaa lagu duubay -40 mV ka dib markii tallaabooyinka depolarization ee danab kala duwan laga bilaabo -20 mV ilaa +120 mV haddii aan si kale loo sheegin. loo isticmaalo in lagu saxo qudhunka hadda jira 18
Joogteynta kala-baxa ee muuqda (Kd) ee isku dhafka kala duwan ee kanaalada iyo horjoogayaasha (Shaxda Dheeraadka ah 1) waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la waafajinayo ku-tiirsanaanta ku-tiirsanaanta xannibaadda (macnaha% qiyamka xannibaadda) oo leh isla'egta Hill:
Meesha [I] ay tahay fiirsashada inhibitor I iyo h waa iskuxiraha Hill. Si loo xisaabiyo iskuxiraha Hill, isla'egta (2) ayaa dib loo habeeyey sida:
Waqtiga boostada: Jun-07-2022
