ತೆರೆದ Hv1 ಪ್ರೋಟಾನ್ ಚಾನೆಲ್‌ನ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್‌ನ ವಿಚಾರಣೆ ಮತ್ತು ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕಲಿ ಕಪಲ್ಡ್ ಪ್ರೋಬ್

Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯು CSS ಗೆ ಸೀಮಿತ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ Internet Explorer ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ಆಫ್ ಮಾಡಿ). ಈ ಮಧ್ಯೆ, ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಮುಂದುವರಿದ ಬೆಂಬಲ, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ.
Hv1 ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಗೇಟೆಡ್ ಪ್ರೋಟಾನ್ ಚಾನಲ್ ಎರಡು ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಸೆನ್ಸಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು (VSDs) ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಡೈಮೆರಿಕ್ ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಗೇಟೆಡ್ ಪ್ರೋಟಾನ್ ಪರ್ಮಿಯೇಶನ್ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಕಾಯಿಲ್ಡ್-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್‌ನಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮುಚ್ಚಿದ ಸ್ಥಿತಿಯಿಂದ ಪರಿವರ್ತನೆ ಎರಡೂ VSD ಗಳಲ್ಲಿನ ಮುಕ್ತ ಸ್ಥಿತಿಯು ಸಹಕಾರಿಯಾಗಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ; ಆದಾಗ್ಯೂ, ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ವಲ್ಪ ತಿಳಿದಿದೆ. ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್‌ಗಳು ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವಹಿಸುತ್ತವೆ; ಆದಾಗ್ಯೂ, ತೆರೆದ Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಂತಹ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. 2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೋಥಿಯಾಜೋಲ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಸಹಕಾರಿ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ ಎರಡು Hv1 VSD ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ತೆರೆದ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಗಾಗಿ ಈ ಸಂಯುಕ್ತಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದನ್ನು ತನಿಖೆಯಾಗಿ ಬಳಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ. VSD ಯ ಮೊದಲ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ತುಣುಕಿನ ಅಂತ್ಯವು ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ, ಅದು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್ ನೇರವಾಗಿ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಭಾಗಿಯಾಗಿಲ್ಲ. ಚಾನಲ್‌ನ ಪ್ರೋಟಾನ್-ಆಯ್ದ ಫಿಲ್ಟರ್ ಬ್ಲಾಕರ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನಾವು ಬಲವಾದ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. .
ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಗೇಟೆಡ್ ಪ್ರೋಟಾನ್ ಚಾನಲ್‌ಗಳು ಫೈಟೊಪ್ಲಾಂಕ್ಟನ್‌ನಿಂದ ಮಾನವರವರೆಗಿನ ವಿವಿಧ ಜೀವಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ Hv1 ಆಗಿದೆ, ಇದು HVCN1 ಜೀನ್2,3.Hv1 (ಅಕಾ VSOP) ನ ಉತ್ಪನ್ನವಾಗಿದೆ. B ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣದಲ್ಲಿ ಒಂದು ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಚಲನಶೀಲತೆ 9 ಮತ್ತು ವಾಯುಮಾರ್ಗದ ಮೇಲ್ಮೈ ದ್ರವದ pH ನಿಯಂತ್ರಣ 10. ಈ ವಾಹಿನಿಯು B-ಕೋಶದ ಮಾರಕತೆಗಳು4,11 ಮತ್ತು ಸ್ತನ ಮತ್ತು ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ 12,13 ನಂತಹ ಹಲವಾರು ಅತಿಯಾಗಿ ಒತ್ತಡಕ್ಕೊಳಗಾದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ವಿಧಗಳಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ.ಅತಿಯಾದ Hv1 ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ 11, 12 ಮೆಟಾಸ್ಟಾಟಿಕ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ .ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ, Hv1 ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮೈಕ್ರೊಗ್ಲಿಯಾದಿಂದ, ಮತ್ತು ಅದರ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ರಕ್ತಕೊರತೆಯ ಸ್ಟ್ರೋಕ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೆದುಳಿನ ಹಾನಿಯನ್ನು ಉಲ್ಬಣಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
Hv1 ಪ್ರೊಟೀನ್ ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಸೆನ್ಸಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್ (VSD) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಇದು S1 ನಿಂದ S414 ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ನಾಲ್ಕು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ. VSD ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಗೇಟೆಡ್ Na+, K+ ಮತ್ತು Ca2+ ಚಾನಲ್‌ಗಳ ಅನುಗುಣವಾದ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಮತ್ತು CiVSP ಯಂತಹ ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಸೆನ್ಸಿಟಿವ್ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಹೋಲುತ್ತದೆ. Ciona gutis15. ಈ ಇತರ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, S4 ನ C-ಟರ್ಮಿನಸ್ ಎಫೆಕ್ಟರ್ ಮಾಡ್ಯೂಲ್, ಪೋರ್ ಡೊಮೇನ್ ಅಥವಾ ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ಲಗತ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ. Hv1 ನಲ್ಲಿ, S4 ಪೊರೆಯ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಭಾಗದಲ್ಲಿ ಇರುವ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್ (CCD) ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ .ಚಾನೆಲ್ ಎರಡು VSD ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಡೈಮೆರಿಕ್ ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಗೇಟೆಡ್ ಪ್ರೋಟಾನ್ ಪರ್ಮಿಯೇಶನ್ ಪಾಥ್‌ವೇ 16,17,18 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ. ಈ ಎರಡು Hv1 ಉಪಘಟಕಗಳು ಸಹಕಾರಿಯಾಗಿ 19,20,21,22 ತೆರೆಯಲು ಕಂಡುಬಂದಿವೆ, ಇದು ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಕಪ್ಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಇಂಟರ್-ಸಬ್ಯುನಿಟ್ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಪ್ಲೇ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಗೇಟಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ. ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಸುರುಳಿ ಡೊಮೇನ್‌ನ ಒಳಗಿನ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಎರಡು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಗಳು ಲಭ್ಯವಿವೆ22,23. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಪೊರೆಯೊಳಗೆ VSD ಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅಲ್ಲ. Hv1-CiVSP ಚೈಮೆರಿಕ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ನ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯು ಈ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಬಗ್ಗೆ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಸ್ಫಟಿಕೀಕರಿಸಿದ ಚಾನಲ್ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಟ್ರಿಮೆರಿಕ್ ಸಂಘಟನೆಯು ಸ್ಥಳೀಯ Hv1 CCD ಅನ್ನು ಯೀಸ್ಟ್ ಲ್ಯೂಸಿನ್ ಝಿಪ್ಪರ್ GCN424 ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸುವುದರಿಂದ ಉಂಟಾಗಬಹುದು.
Hv1 ಚಾನೆಲ್‌ನ ಉಪಘಟಕ ಸಂಘಟನೆಯ ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನವು ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ತೀವ್ರ ಅಡಚಣೆಯಿಲ್ಲದೆ CCD ಗೆ ಎರಡು S4 ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಪರಿವರ್ತನೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೀರ್ಮಾನಿಸಿದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪೊರೆಯಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂಗೆ ಯೋಜಿಸುವ ದೀರ್ಘ ಹೆಲಿಕ್ಸ್. ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಕ್ರಾಸ್ಲಿಂಕಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ಈ ಅಧ್ಯಯನವು Hv1 VSD ಗಳು S4 ವಿಭಾಗದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಪರ್ಕಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇತರ ಅಧ್ಯಯನಗಳು VSD ಗಳ ನಡುವೆ ಪರ್ಯಾಯ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಿವೆ. ಈ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್‌ಗಳು S1 ವಿಭಾಗಗಳು 17, 21, 26 ಮತ್ತು S2 ವಿಭಾಗದ ಹೊರ ತುದಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ 21. ಸಂಘರ್ಷಕ್ಕೆ ಸಂಭವನೀಯ ಕಾರಣ ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೆಂದರೆ VSD ಗಳ ನಡುವಿನ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಗೇಟಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಮುಚ್ಚಿದ ಮತ್ತು ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಗಳ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು VSD ಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ವಿಭಿನ್ನ ಸ್ಥಿತಿಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳಲ್ಲಿ ಬದಲಾಗಬಹುದು.
ಇಲ್ಲಿ, 2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೋಥಿಯಾಜೋಲ್ ಎರಡು ತೆರೆದ VSD ಗಳಿಗೆ ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕ್ ಆಗಿ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮುಕ್ತ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) ಸಂಯುಕ್ತಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಇಂಟರ್ಫೇಸ್. GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಮಾದರಿಯಿಂದ ಚೆನ್ನಾಗಿ ವಿವರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಒಂದು ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದರಿಂದ ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಾಂಧವ್ಯವು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ. ಚಾನಲ್ 27, 28 ಮತ್ತು ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಉತ್ಪನ್ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ 29 ರ ಭಾಗವು GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ. ನಾವು Hv1 ಡೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಹಕಾರ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತೇವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ, ಅಲ್ಲಿ CCD S4 ವಿಭಾಗದಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, CCD ಯಲ್ಲಿನ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ನೇರವಾಗಿ ಇರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ GBTA-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸಿ. ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, S1 ತುಣುಕು ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್‌ನ ಭಾಗವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಳ್ಳುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಡೈಮರ್‌ನ ಮಧ್ಯಭಾಗದಿಂದ S4 ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನ ಬಾಹ್ಯಕೋಶದ ತುದಿಯೊಂದಿಗೆ ಪಕ್ಕದ VSD ಗಳ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತೇವೆ. S1 ತುಣುಕು ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿರಬೇಕು.
Hv1 ನ ಸಣ್ಣ ಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ಗಳು ಆಂಟಿಕಾನ್ಸರ್ ಔಷಧಿಗಳು ಮತ್ತು ನರಪ್ರೊಟೆಕ್ಟಿವ್ ಏಜೆಂಟ್ಗಳಾಗಿ ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಿವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ, ಕೆಲವು ಸಂಯುಕ್ತಗಳು ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ. 1a) ಮತ್ತು ಅದರ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಚಾನಲ್‌ನ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಟಾನ್‌ಗಳ VSD29,32 ವ್ಯಾಪಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ. ಅಂತಹ ಸಂಯುಕ್ತಗಳ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಎರಡು ತೆರೆದ ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ. 2-guanidinobenzothiazole (GBTA, ಸಂಯುಕ್ತ [2] ಚಿತ್ರ 1a) 200 μM (ಚಿತ್ರ 1b) ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದಾಗ Hv1 ಅನ್ನು 2GBI ಯಷ್ಟು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಾವು ಇತರ ಥಿಯಾಜೋಲ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು GBTA ಗಿಂತ ಸಮಾನವಾದ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಪಠ್ಯ).ನಾವು ನಾಲ್ಕು ಥಿಯಾಜೋಲ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ (GBTA ಮತ್ತು ಸಂಯುಕ್ತಗಳು [3], [6] ಮತ್ತು [11], ಚಿತ್ರ 1c) ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅವು 2GBI ಗಿಂತ ಕಡಿದಾದವು ಎಂದು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ದಿ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕಗಳು (h) ಥಿಯಾಜೋಲ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು 1.109 ± 0.040 ರಿಂದ 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1).ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, 2GBI ಗಾಗಿ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು 0.975 ± 0.024 29, ಚಿತ್ರ 2a ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1) ಆಗಿತ್ತು. 1 ಮೇಲಿನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು ಬಂಧಕ ಸಹಕಾರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಏಕೆಂದರೆ ಪ್ರತಿ Hv1 ಉಪಘಟಕದಲ್ಲಿ ತನ್ನದೇ ಆದ Hv1 ಗುಣಾಂಕವಿದೆ. ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್, 29,32 ಒಂದು ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಥಿಯಾಜೋಲ್ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದರಿಂದ ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಎರಡನೇ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಅಣುವಿನ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ತರ್ಕಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಜಿಬಿಟಿಎ ಅತ್ಯಧಿಕ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕದೊಂದಿಗೆ ಪರೀಕ್ಷಾ ಸಂಯುಕ್ತವಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಈ ಸಂಯುಕ್ತವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ್ದೇವೆ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಿನರ್ಜಿಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು 2GBI ಅನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖ ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
(a) ಪರೀಕ್ಷಾ ಸಂಯುಕ್ತಗಳು: [1] ಉಲ್ಲೇಖ Hv1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ 2-ಗುವಾನಿಡಿನೊ-ಬೆಂಜಿಮಿಡಾಜೋಲ್ (2GBI).[2] 2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೊ-ಬೆಂಜೊಥಿಯಾಜೋಲ್ (GBTA), [3] (5-ಟ್ರೈಫ್ಲೋರೋಮೆಥೈಲ್-1,3-ಬೆಂಜೊಥಿಯಾಜೋಲ್-2-yl)ಗ್ವಾನಿಡಿನ್, [4] ನಾಫ್ಥೋ[1,2-d][1, 3] ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-yl -ಗ್ವಾನಿಡಿನ್, [5](4-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-ಐಎಲ್)ಗ್ವಾನಿಡಿನ್, [6](5-ಬ್ರೋಮೋ-4-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್- 2-ಐಎಲ್)ಗ್ವಾನಿಡಿನ್, [7] ಫಾಮೊಟಿಡಿನ್, [8] 2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೊ-5-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-4-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಈಥೈಲ್ ಎಸ್ಟರ್, [9] 2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೊ-4-ಮೀಥೈಲ್ ಇಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-5-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಟ್, [10 ](2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೋ-4-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-5-ಐಎಲ್) ಈಥೈಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್, [11]1-[4-(4-ಕ್ಲೋರೋಫೆನಿಲ್)-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-ಐಎಲ್]ಗ್ವಾನಿಡಿನ್, [ 12]1-[4-(3,4-ಡೈಮೆಥಾಕ್ಸಿಫೆನಿಲ್)-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-ಐಎಲ್]ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ .(ಬಿ) ಸೂಚಿಸಲಾದ ಗ್ವಾನಿಡಿನೋಥಿಯಾಜೋಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖ ಸಂಯುಕ್ತ 2GBI (ನೀಲಿ-ಹಸಿರು ಬಾರ್‌ಗಳು) ಮೂಲಕ ಮಾನವ Hv1 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧ .Hv1 ಪ್ರೋಟಾನ್ ಪ್ರವಾಹಗಳನ್ನು -80 mV ಯಿಂದ +120 mV ವರೆಗಿನ ಡಿಪೋಲರೈಸೇಶನ್‌ಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಕ್ಸೆನೋಪಸ್ ಓಸೈಟ್‌ಗಳ ಒಳ-ಹೊರಗಿನ ಪ್ಲೇಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು 200 μM.pHi = pHo = 6.0 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ನಾನಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. .ದತ್ತಾಂಶವು ಸರಾಸರಿ ± SEM (n≥4).(c) ಸಂಯುಕ್ತಗಳ ಮೂಲಕ ಮಾನವ Hv1 ನ ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ [2], [3], [6] ಮತ್ತು [11].ಪ್ರತಿ ಬಿಂದುವು 3 ರ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ 15 ಅಳತೆಗಳಿಗೆ. ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಸ್ಪಷ್ಟ Kd ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಲೈನ್ ಹಿಲ್ ಫಿಟ್ ಆಗಿದೆ. ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಫಿಟ್‌ಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ).
(a,b) ಸಂಯುಕ್ತಗಳು 2GBI ಮತ್ತು GBTA ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಡೈಮರಿಕ್ ಮತ್ತು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ Hv1 ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಪಾಯಿಂಟ್ 3 ರಿಂದ 8 ಅಳತೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕರ್ವ್ ಹಿಲ್ ಫಿಟ್ ಆಗಿದೆ. ಬೆಟ್ಟದ ಗುಣಾಂಕಗಳು (h) ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು 3 ಮತ್ತು 4 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಫಿಟ್‌ಗಳಿಂದ ಇನ್‌ಸೆಟ್ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (a) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ GBTA ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಚಿತ್ರ 1c ನಲ್ಲಿನಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ. ಸ್ಪಷ್ಟ Kd ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗಾಗಿ ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ಅನ್ನು ನೋಡಿ.(c) ಮಾಡೆಲಿಂಗ್ ಡೈಮೆರಿಕ್ Hv1 ಗೆ GBTA ಯ ಸಹಕಾರ ಬಂಧ. ಘನ ಕಪ್ಪು ರೇಖೆಯು ಸಮೀಕರಣ (6) ಮೂಲಕ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ದತ್ತಾಂಶಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವುದನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು (d) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ. ಉಪ 1 ಮತ್ತು ಉಪ 2 ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಗಳು ಬೈಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್ ​​ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ಕ್ರಮವಾಗಿ ಮೊದಲ ಮತ್ತು ಎರಡನೆಯ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಘಟನೆಗಳ ವಿಘಟನೆಯ ಸಮತೋಲನ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು (ಉಪ 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; ಉಪ 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 ).(d) Hv1 ಬ್ಲಾಕ್‌ನ ಪ್ರಸ್ತಾವಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. GBTA ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಒಂದು ತೆರೆದ ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಪಕ್ಕದ ತೆರೆದ ಉಪಘಟಕದ (Kd2 Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ N- ಮತ್ತು C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು Ciona Intestinalis ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಸೆನ್ಸಿಟಿವ್ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 ನ ಅನುಗುಣವಾದ ಭಾಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮೊನೊಮರೈಸ್ ಮಾಡಬಹುದು. ಅವುಗಳನ್ನು ಡೈಮೆರಿಕ್ ಚಾನೆಲ್ (ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್) ಪ್ರತಿಬಂಧ (Fig. 2a,b) ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದೆವು. ಎರಡು ಸಂಯುಕ್ತಗಳ ನಡುವಿನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರದ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ Hv1 ನಲ್ಲಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಒಂದು ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ GBTA ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ ಎಂಬ ವಿವರಣೆಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಬಂಧಕಕ್ಕಾಗಿ ಇತರ ಉಪಘಟಕದ ಸಂಬಂಧ. ಒಂದು Hv1 ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ GBTA ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನ ಮರುಜೋಡಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು (fit35 ಅನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುವುದು), ಇದು ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕದ ಖಾಲಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನ ಮರುಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿದ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಬಾಂಧವ್ಯ.
ಚಾನೆಲ್‌ಗೆ GBTA ಯ ಸಹಕಾರ ಬಂಧವನ್ನು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ವಿವರಿಸಲು, ವಿಘಟನೆಯ ಸ್ಥಿರ Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*) ನೊಂದಿಗೆ ಬೈಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ ಉಪಘಟಕವು ಮೊದಲ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಅಣುವನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಾವು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುವಂತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಉಳಿದ ಖಾಲಿ ಉಪಘಟಕಗಳು ವಿಘಟನೆಯ ಸ್ಥಿರ Kd2 ನೊಂದಿಗೆ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಬೈಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ ಪ್ರತಿಬಂಧಕಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ, ಅಲ್ಲಿ Kd2 ಚಿತ್ರ 2c ಯಲ್ಲಿನ ಘನ ಕಪ್ಪು ರೇಖೆಯು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಕರ್ವ್‌ಗೆ ಮಾದರಿ ಸಮೀಕರಣದ ಫಿಟ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ~290 μM ನ Kd1 ಮತ್ತು ~29 μM ನ Kd2 ಅನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ (ವಿಧಾನಗಳ ವಿಭಾಗ, ಸಮೀಕರಣ (6)).ಮಾದರಿಯು ಸಹ ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ. 2GBI ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್, ಅಲ್ಲಿ Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ Hv1 ನಲ್ಲಿ, ಕೇವಲ ಒಂದು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಮತ್ತು ಒಂದು Kdm (O° + B ⇆ B°) ಇರುತ್ತದೆ. GBTA ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, Kdm ಸುಮಾರು 54 ಆಗಿದೆ. μM, ಇದು Kd2 ಗಿಂತ Kd1 ಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಹೋಲುತ್ತದೆ (Fig. 2d). ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಮಾನೋಮರ್‌ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿದೆ (O°) ಕಡಿಮೆ-ಅಭಿಮಾನದ ಸ್ಥಿತಿಗೆ (BO*) ಹೆಚ್ಚು ಹೋಲುತ್ತದೆ. ಡೈಮರ್‌ನ ಅಫಿನಿಟಿ ಸ್ಟೇಟ್ (OO), ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್‌ನ ನಿರ್ಮೂಲನೆಯಿಂದಾಗಿ.
ಹಿಂದೆ 2GBI32 ಗಾಗಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, GBTA ಚಾನೆಲ್ ತೆರೆದಿರುವಾಗ ಅದನ್ನು ತಡೆಯುವ ಮೂಲಕ Hv1 ಕರೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2a,b,d).2GBI ನಿಧಾನವಾಗಿ ಕೊಳೆಯುತ್ತಿರುವ ಬಾಲ ಪ್ರವಾಹಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ. ಮೆಂಬರೇನ್ ಮರುಧ್ರುವೀಕರಣಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ, ಆದರೆ ಈ ವಿದ್ಯಮಾನವನ್ನು GBTA (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2c) ನಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. 2GBI ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ Hv1 ನಿಷ್ಕ್ರಿಯತೆಯ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, ಬ್ಲಾಕರ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನಿಂದ ಹೊರಡುವವರೆಗೆ ಪ್ರತಿ ಉಪಘಟಕದಲ್ಲಿನ ಗೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಮುಚ್ಚಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ (" ಫೂಟ್ ಗೇಟ್” ಮೆಕ್ಯಾನಿಸಂ), ಮತ್ತು 2GBI ಗೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಮುಚ್ಚುವುದಕ್ಕಿಂತ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಅನ್‌ಬೈಂಡ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಒಂದು Hv1 ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಅನಿರ್ಬಂಧಿಸಿದರೆ ಮತ್ತು ಮುಚ್ಚಿದರೆ, ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕವನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಿದರೆ, ಉಳಿದ 2GBI ಅಣುಗಳ ಅನ್‌ಬೈಂಡಿಂಗ್ ನಿಧಾನವಾಗುತ್ತದೆ (ಬ್ಲಾಕರ್ ಕ್ಯಾಪ್ಚರ್).ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಚಾನಲ್ ಪ್ರಭೇದಗಳು ಕೇವಲ ಒಂದು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಿದ ಉಪಘಟಕವು ಪ್ರೋಟಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಮುಚ್ಚುವ ಮೊದಲು ಅಸ್ಥಿರವಾಗಿ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಕೊಳೆಯುತ್ತಿರುವ ಬಾಲ ಪ್ರವಾಹಕ್ಕೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ.
GBTA (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 2c) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ Hv1 ಟೈಲ್ ಪ್ರವಾಹಗಳ ಕೊಳೆತವು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ನಿಧಾನಗೊಂಡಿಲ್ಲ ಎಂಬ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಈ ಬ್ಲಾಕರ್‌ಗೆ (Fig. 2d) ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ. ಒಮ್ಮೆ GBTA ಅಣುವು Hv1 ಉಪಘಟಕದಿಂದ ಅನ್ಬೌಂಡ್ ಆಗಿರುತ್ತದೆ. , ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಬ್ಲಾಕರ್‌ನ ಬಾಂಧವ್ಯವು ಸುಮಾರು 10-ಪಟ್ಟು ಇಳಿಯುತ್ತದೆ, ಇದು ಅನ್‌ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ. ಇದರರ್ಥ GBTA ಯ ಎರಡನೇ ಅಣುವು ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಕ್ಕಿಹಾಕಿಕೊಳ್ಳುವ ಮೊದಲು ಬಿಚ್ಚಿಡುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಚಾನಲ್ ಜಾತಿಗಳು ಕೇವಲ ಒಂದು ತಡೆಯುವ ಉಪಘಟಕವನ್ನು 2GBI ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ GBTA ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಹೇರಳವಾಗಿ ನಿರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ವೇಗವಾಗಿ ಟೈಲ್ ಕರೆಂಟ್ ಕೊಳೆಯುತ್ತದೆ.
GBTA ಎರಡೂ Hv1 ಉಪಘಟಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಹಕಾರಿಯಾಗಿ ಬಂಧಿಸಲು, ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕಲಿ ಕಪಿಲ್ಡ್ ಮಾಡಬೇಕು. ಪ್ರತಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು: 1) ಪ್ರತಿಬಂಧಕಕ್ಕೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವ ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ಮಾಡುವ ಘಟನೆಗಳ ಸರಪಳಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುವುದು ಮತ್ತು 2) ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಕಡಿಮೆ-ಸಂಬಂಧದಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಸಂಬಂಧದ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಪರಿವರ್ತನೆ. ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನೊಳಗಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅವಶೇಷಗಳು ಸಹಕಾರಿ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡಿದರೆ, ಅವುಗಳ ರೂಪಾಂತರವು Hv1. ರೆಸಿಡ್ಯೂಸ್ D112, F150 ನ GBTA ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಸಾಂದ್ರತೆಯ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಕರ್ವ್‌ನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಬೇಕು ಎಂದು ನಾವು ತರ್ಕಿಸಿದ್ದೇವೆ , S181 ಮತ್ತು R211 ಅನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ 2GBI29 ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪರಿಸರದ ಭಾಗವೆಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅವರು GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ (Fig. 3A) ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದ್ದಾರೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು ರೂಪಾಂತರಿತ ಚಾನಲ್‌ಗಳು D112E, F1810A, S1810A, GBTA ಯ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತೇವೆ. , ಮತ್ತು R211S (ಚಿತ್ರ 3) ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕಗಳನ್ನು Hv1 ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದೆ, 2GBI ಅನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸುತ್ತದೆ. ರೆಸಿಡ್ಯೂ V109 D112 ನಂತೆ S1 ವಿಭಾಗದ ಅದೇ ಮುಖದಲ್ಲಿದೆ ಮತ್ತು ಕೋಶದೊಳಗೆ ಒಂದು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಹೆಲಿಕಲ್ ತಿರುವು ಹೊಂದಿದೆ. V109 2GBI29 ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಭಾಗಿಯಾಗಿಲ್ಲ, ನಾವು V109A ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (Fig. 3b).
(a) ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಉತ್ಪನ್ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸೂಚಿಸಲಾದ Hv1 ಉಳಿಕೆಗಳು. 2GBI29 ಸಂಯುಕ್ತದ ವಿವಿಧ ಭಾಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ಮಾಡುವ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾದ ಅಡ್ಡ ಸರಪಳಿಗಳನ್ನು ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ಡ್ಯಾಶ್ಡ್ ನೀಲಿ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು. ಗಾಢ ಕೆಂಪು).ಪ್ರತಿ ಬಿಂದುವು 3 ರಿಂದ 12 ಅಳತೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ ± SD V109 ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ. ಕರ್ವ್ಗಳು ಸ್ಪಷ್ಟ Kd ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಹಿಲ್ ಫಿಟ್ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಅನುಬಂಧ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ನೋಡಿ). ಬೆಟ್ಟದ ಗುಣಾಂಕಗಳು (h) ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಪೂರಕ ಫಿಗ್ಸ್ 3 ಮತ್ತು 4 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಫಿಟ್‌ಗಳಿಂದ ಇನ್‌ಸೆಟ್ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. Hv1 WT ಗಾಗಿ ಉಲ್ಲೇಖ h ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ಗೆರೆಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ರೂಪಾಂತರಿತ ಮತ್ತು WT ಹಾದಿಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p D112E ರೂಪಾಂತರವು ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (p GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು Hv1 ಡೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿ 1 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ (Fig. 2b) ~1 ಆಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವುದು ಎರಡು ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಅಸ್ತಿತ್ವದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಒಂದು ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಬ್ಲಾಕರ್ ಬಂಧಿಸಿರುವ ಡೈಮರ್‌ಗೆ GBTA ಬಂಧಿಸುವ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು ~ 1 ಆಗಿರಬೇಕು. ನಾವು ಈ ಮುನ್ಸೂಚನೆಯನ್ನು Hv1 F150A-WT ಲಿಂಕ್ಡ್ ಡೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿ (Fig. 4a) ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅಲ್ಲಿ F150A ನ ಸಂಬಂಧ GBTA ಗಾಗಿ ಉಪಘಟಕವು WT ಉಪಘಟಕ (Fig. 1c ಮತ್ತು 3d) ಗಿಂತ 2 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರ್ಡರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ನಂತರ ನಾವು 2 μM GBTA ಯ ತಳದ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ WT ಉಪಘಟಕದ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ್ಕಾಗಿ ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಅಳತೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ , ಬ್ಲಾಕರ್ ಸರಿಸುಮಾರು 99% F150A ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಮತ್ತು (a) ತಡೆಯುವ ಹೆಮಿಚಾನಲ್ ({F150A}b-WT/BAO*) ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುವ F150A-WT ಜಂಕ್ಷನ್ ಡೈಮರ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. ಬಿಳಿ ವಜ್ರಗಳು ರೂಪಾಂತರದ ಸ್ಥಳವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. BAO* ಮತ್ತು BA*B* ರಾಜ್ಯಗಳಲ್ಲಿ, F150A ಉಪಘಟಕದ ಬಾಂಧವ್ಯವು WT ಉಪಘಟಕಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ.(b) F150A-WT ಚಾನಲ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರೋಟಾನ್ ಪ್ರವಾಹಗಳು −80 mV ನಿಂದ +120 mV ಗೆ ಮೆಂಬರೇನ್ ವಿಭವದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.pHi = pHo = 6.0 .ಗ್ರೇ ಕುರುಹುಗಳು ಪ್ರತಿಬಂಧಕದ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾದ ಪ್ರವಾಹಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ಕಪ್ಪು ಜಾಡಿನ (ನಿಯಂತ್ರಣ) 2 μM GBTA ಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ ಅಳತೆ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರವಾಹವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ, WT ಉಪಘಟಕವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲ, ಆದರೆ F150A ಉಪಘಟಕವು GBTA ಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬಂಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ. ({F150A}b-WT).ಜಿಬಿಟಿಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಮತ್ತಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವು WT ಉಪಘಟಕದ (ಕಿತ್ತಳೆ ಮತ್ತು ಕೆಂಪು ಕುರುಹುಗಳು) ತಡೆಗಟ್ಟುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು.(c) {F150A}b-WT ಡೈಮರ್‌ನ ಸಾಂದ್ರತೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವು F150A ಉಪಘಟಕ).ಪ್ರತಿ ಬಿಂದುವು 3 ರಿಂದ 7 ಅಳತೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಸ್ಪಷ್ಟ Kd ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಕರ್ವ್‌ಗಳು ಹಿಲ್ ಫಿಟ್‌ಗಳಾಗಿವೆ. ಇನ್‌ಸೆಟ್ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು 3 ಮತ್ತು 4 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಫಿಟ್‌ಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. Hv1 WT ಯ h ಮೌಲ್ಯಗಳು ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಗಳಂತೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. WT ಡೈಮರ್ Hv1 ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p Hv1 ನ GBTA ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ತೆರೆದ ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಮುಕ್ತ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಜೋಡಣೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರವನ್ನು ಬಳಸಬಹುದೆಂದು ನಾವು ತರ್ಕಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಎರಡು Hv1 ಉಪಘಟಕಗಳು 19,20,21 ಸಹಕಾರದಿಂದ ಗೇಟ್ ಆಗಿರುವುದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. 22 ಮತ್ತು ಗೇಟಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಕಾಯಿಲ್ಡ್-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್ (CCD) 22,25 ನಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸಲು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ GBTA- ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ CCD ಸಹ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ಕೇಳಿದ್ದೇವೆ. ಟ್ರೈಗ್ಲೈಸಿನ್ S4 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ತುಣುಕು ಮತ್ತು ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಾಗ ಈ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ಉಳಿದ ಚಾನಲ್‌ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ರೂಪಾಂತರಗಳ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ V220G, K221G ಮತ್ತು T222G (Fig. 5a, GGG ಮ್ಯುಟೆಂಟ್) GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರ. ವೈಲ್ಡ್ ಟೈಪ್ (Fig. 5c) ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕದಲ್ಲಿ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಅತ್ಯಲ್ಪ (p > 0.05) ಇಳಿಕೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಎರಡು ಉಪಘಟಕಗಳು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಮುಖ್ಯ, ಆದರೆ CBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು CCD ನೇರವಾಗಿ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.
(a) ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಕಾಯಿಲ್ಡ್-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್ (ನೀಲಿ ಬಾಣಗಳು) ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ S4 ನ ಒಳ ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಟ್ರೈಗ್ಲೈಸಿನ್ ರೂಪಾಂತರದೊಂದಿಗೆ Hv1 ಡೈಮರ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. ಸೂಚಿಸಲಾದ ರೂಪಾಂತರಗಳು, ಉಪಘಟಕಗಳ (ನೀಲಿ ಬಾಣಗಳ) ನಡುವಿನ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ S1 ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.(c-h) 2GBI (ಸಯಾನ್) ಮತ್ತು GBTA (ಕಡು ಕೆಂಪು) ಸೂಚಿಸಲಾದ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಪಾಯಿಂಟ್ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. 3 ರಿಂದ 10 ಅಳತೆಗಳ ± SD. ಕರ್ವ್ ಸ್ಪಷ್ಟ Kd ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಬಳಸಲಾಗುವ ಹಿಲ್ ಫಿಟ್ ಆಗಿತ್ತು (ಅನುಬಂಧ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ನೋಡಿ). ಇಂಟರ್ಪೋಲೇಟೆಡ್ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕಗಳನ್ನು ವಿಧಾನಗಳ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಅನುಬಂಧ ಅಂಜೂರ 3 ಮತ್ತು 4 ನೋಡಿ).ಇದಕ್ಕಾಗಿ ಉಲ್ಲೇಖ h ಮೌಲ್ಯಗಳು Hv1 WT ಅನ್ನು ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ರೂಪಾಂತರಿತ ಮತ್ತು WT ಹಾದಿಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p ನಾವು CBTA ಸಹಕಾರಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ನೇರ ಮಧ್ಯವರ್ತಿಯಾಗಿ CCD ಅನ್ನು ತಳ್ಳಿಹಾಕಿದ್ದರಿಂದ, VSD ಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಕೊಂಡಿವೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ಕೇಳಿದ್ದೇವೆ. ಶೇಷ D112 (Fig. 3c) ಯ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ರೂಪಾಂತರದಿಂದ GBTA- ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರವನ್ನು ರದ್ದುಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. S1 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ.S1 ಇತರ ಎರಡು ಋಣಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, E119 ಮತ್ತು D123, ಇದು D112 ನಂತೆ ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನ ಅದೇ ಬದಿಯಲ್ಲಿದೆ, ಆದರೆ ತುಣುಕಿನ 24 ರ ಹೊರ ತುದಿಗೆ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆ. ಆರಂಭಿಕ ಆಣ್ವಿಕ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಸಿಮ್ಯುಲೇಶನ್‌ಗಳು ಈ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಿರುವುದನ್ನು ಸೂಚಿಸಿವೆ. ವಾಟರ್‌ಲೈನ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ D112 ಗೆ 36,37. ಆದ್ದರಿಂದ, GBTA-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ (Fig. 5b) ನಡುವಿನ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ E119 ಮತ್ತು D123 ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ, ನಾವು D123 ಬಳಿ ಇರುವ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಧನಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಸ್ಥಾನ K125 ಅನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಆದರೆ S1 ಹೆಲಿಕ್ಸ್ (Fig. 5b) ನ ಇನ್ನೊಂದು ಬದಿಯಲ್ಲಿ.
ನಾವು 2GBI ಮತ್ತು GBTA ಮೂಲಕ E119A, D123A ಮತ್ತು K125A ಚಾನಲ್‌ಗಳ ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವನ್ನು ಅಳೆಯಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು E119A ಮತ್ತು K125A ರೂಪಾಂತರಗಳು ವೈಲ್ಡ್ ಟೈಪ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಬದಲಾಯಿಸಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (p > 0.05, Fig. 5d,i) ) ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ರೂಪಾಂತರದ D123A GBTA ಯ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ (p 0.05/14).
ಎರಡೂ ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ 123 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಚಾರ್ಜ್ ಅನ್ನು ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸುವುದರಿಂದ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರದಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಬದಲಾವಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು, ಆದರೆ ಎರಡೂ ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿನ ಚಾರ್ಜ್ ಅನ್ನು ಹಿಮ್ಮುಖಗೊಳಿಸುವುದು ಕೇವಲ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿದೆ, ನಾವು ಚಾರ್ಜ್ನ ವಿಲೋಮ ಚಾನಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಕೇವಲ ಒಂದು ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಿದ್ದೇವೆ. C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಉಪಘಟಕದಲ್ಲಿ (Fig. 5b) D123R ಪರ್ಯಾಯದೊಂದಿಗೆ Hv1-ಸಂಯೋಜಿತ ಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು GBTA ಮತ್ತು 2GBI ಮೂಲಕ ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗಿದೆ. WT-D123R ಚಾನೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ GBTA ಬಂಧಿಸುವ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು ಅದಕ್ಕಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ Hv1 (p D112E ರೂಪಾಂತರವು WT-D123R ಹಿನ್ನೆಲೆಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ GBTA-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕದ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ರದ್ದುಗೊಳಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (Fig. 5b,h ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ. 4). 2GBI ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕದ ಮೇಲಿನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಸಹ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ( Fig. 5h ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ. 3).ಈ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು 123 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ವಿರುದ್ಧ ಚಾರ್ಜ್‌ಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ವರ್ಧಿತ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯು D112 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿರುವ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ತೊಂದರೆಗೊಳಗಾದಾಗ ಬಲವಾದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರಕ್ಕೆ ಅನುವಾದಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಪಕ್ಕದ ತೆರೆದ ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿರುವ D123 ಅವಶೇಷಗಳು ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದ್ದರೆ, ಋಣಾತ್ಮಕ ಶುಲ್ಕಗಳ ನಡುವಿನ ವಿಕರ್ಷಣ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಆಸ್ಪರ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಅರ್ಜಿನೈನ್ಗೆ ಬದಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ಋಣಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಧನಾತ್ಮಕ ಶುಲ್ಕಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತರ್ಕಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅವುಗಳ ನಡುವಿನ ಆಕರ್ಷಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆ.ಒಂದು ಉಪಘಟಕ (WT-D123R ಡೈಮರ್).ಆಕರ್ಷಕ ಸಂವಹನಗಳು S1 ತುಣುಕಿನ ಹೊರ ತುದಿಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಲಪಡಿಸಬಹುದು, ಇದು ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ ಬಲವಾದ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು GBTA-ಬಂಧಿಸುವ ಸಹಕಾರವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಈ ಊಹೆಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸಲು, ನಾವು S1 ವಿಭಾಗದ ಹೊರ ತುದಿಗಳ ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಲಪಡಿಸುವ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಹುಡುಕಿದ್ದೇವೆ, ಇದು 123 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಚಾರ್ಜ್ ಸ್ವಿಚಿಂಗ್‌ನಿಂದ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ. Hv1 ಶೇಷ I127 ಗೆ ಸಿಸ್ಟೈನ್‌ಗೆ ರೂಪಾಂತರವು ಹಿಂದೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಕ್ರಾಸ್-ಲಿಂಕಿಂಗ್17.ಇದಲ್ಲದೆ, Hv1-CiVSP ಚಿಮೆರಿಕ್ VSD ಯ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯು I127 ಅನ್ನು S1 ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನ ಹೊರ ತುದಿಯಿಂದ ಕೇವಲ ಒಂದು ಶೇಷದಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸಿದೆ 127 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿರುವ ಸಿಸ್ಟೈನ್‌ಗಳು, ಇದು ಬಲವಾದ S1-S1 ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ, 123 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಚಾರ್ಜ್ ಅನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಗಮನಿಸಿದಂತೆಯೇ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.
10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fig. 6a) ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಮತ್ತು ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ GBTA ಮತ್ತು 2GBI ಯಿಂದ ನಾವು Hv1 I127C ಯ ಏಕಾಗ್ರತೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತೇವೆ. ಏಜೆಂಟ್ ಅನ್ನು ಬಾಹ್ಯಕೋಶದ ಪರಿಹಾರಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೇವಲ ಒಂದು ಉಪಘಟಕದಲ್ಲಿ (WT-I127C) ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಪರ್ಯಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲಿಂಕ್ಡ್ ಡೈಮರ್ ಅನ್ನು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ (Fig. 6a). ನಮಗೆ ಸ್ವಾಭಾವಿಕ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಕ್ರಾಸ್-ಲಿಂಕಿಂಗ್‌ನ ಯಾವುದೇ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಅಳೆಯಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ. 2GBI ಪ್ರತಿಬಂಧದ I127C ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ, ಏಕೆಂದರೆ I127C ಗಾಗಿ Hv1 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕ, βME ಜೊತೆಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆ, ಮೊನೊಸಿಸ್ಟೀನ್ ಬದಲಿ ಡೈಮರ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಲು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ. ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು WT-I127C (Fig. 6b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3) ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ. ಇದಕ್ಕೆ ತದ್ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, ನಾವು GBTA ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಮೇಲೆ ಸ್ವಾಭಾವಿಕ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕಿಂಗ್‌ನ ನಾಟಕೀಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತೇವೆ. βME ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ Hv1 I127C ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕ (ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್ ಆನ್) βME (ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್ ಆಫ್) ಅಥವಾ ಡೈಮರ್ ಅನ್ನು ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲು WT-127C ಅನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ (ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ) (Fig. 6c ಮತ್ತು ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 4) ಅಳೆಯುವುದಕ್ಕಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ, ಇದು ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. S1 ತುಣುಕುಗಳ ಹೊರ ತುದಿಗಳ ನಡುವಿನ ಡೈಸಲ್ಫೈಡ್ ಬಂಧಗಳ ರಚನೆಯಿಂದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಹೆಚ್ಚು ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು WT-D123R ಡೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿ 123 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಆಸ್ಪರ್ಟೇಟ್ ಮತ್ತು ಅರ್ಜಿನೈನ್‌ನ ಆಕರ್ಷಕ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ನಡುವೆ ಹೆಚ್ಚಿದ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂಬ ನಮ್ಮ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ. ಉಪಘಟಕಗಳು.
ಎರಡು ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ S1 ವಿಭಾಗದ ಹೊರ ತುದಿಗಳ ನಡುವಿನ ನೇರ ಭೌತಿಕ ಸಂವಹನಗಳಿಂದ ಮುಕ್ತ-ಸ್ಥಿತಿಯ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
(a) ರೂಪಾಂತರಿತ Hv1 ಡೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಲಿಂಕರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ, ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್‌ಗಳು GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರದ ಮೇಲೆ ಹೇಗೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇ) ಬಾಹ್ಯಕೋಶದ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ 10 mM βME ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ. ಪ್ರತಿ ಪಾಯಿಂಟ್ 3 ರಿಂದ 10 ಅಳತೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಕರ್ವ್ Kd ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಬಳಸಲಾಗುವ ಹಿಲ್ ಫಿಟ್ ಆಗಿತ್ತು (ಅನುಬಂಧ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ನೋಡಿ).ಇನ್‌ಸೆಟ್ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು 3 ಮತ್ತು 4 ರಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಫಿಟ್‌ಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (c,e) ನಲ್ಲಿನ ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ವಿಭಿನ್ನ GBTA ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ನಡುವೆ (p 0.05).
βME ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, D112E I127C Hv1 ಡೈಮರ್‌ಗೆ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (Fig. 6e ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4) ಅಳೆಯುವುದಕ್ಕಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು D112E ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಸಿಸ್ಟೀನ್ 127 ನ ಅಡ್ಡ-ಸಂಪರ್ಕದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಹಕಾರದ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ರದ್ದುಗೊಳಿಸಲಿಲ್ಲ. D112E, I127C Hv1 ಡೈಮರ್‌ಗಳಿಗೆ 2GBI ಬಂಧಿಸುವ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು D112E ರೂಪಾಂತರದಿಂದ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 1).6d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3).
ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಆಕರ್ಷಕ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂವಹನಗಳ ಮೂಲಕ ಪಕ್ಕದ Hv1 ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿನ S1 ತುಣುಕುಗಳ ಹೊರ ತುದಿಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಬದಲಿ ಸಿಸ್ಟೀನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಬಂಧಗಳ ರಚನೆಯ ಮೂಲಕ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಹಕಾರವನ್ನು ಬಂಧಿಸುವಲ್ಲಿ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಈ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಸಹಕಾರದ ಮೇಲಿನ ಆಕರ್ಷಕ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ರೂಪಾಂತರ D112E ಮೂಲಕ ರದ್ದುಗೊಳಿಸಬಹುದು, ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಬಂಧಗಳ ಪರಿಣಾಮವು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.
ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಲು ಲಭ್ಯವಿರುವ ರಾಸಾಯನಿಕ ಸ್ಥಳದ ನಮ್ಮ ಅನ್ವೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ, GBTA ನಂತಹ 2-ಗುವಾನಿಡಿನೋಥಿಯಾಜೋಲ್‌ಗಳು 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c) ಗಿಂತ ಕಡಿದಾದ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಮತ್ತು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಚಾನೆಲ್‌ಗಳು (Fig. 2a,b) ಮತ್ತು ಒಂದು ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಪ್ರತಿರೋಧಕಕ್ಕೆ (Fig. 4) ಪೂರ್ವ-ಬಂಧಿತವಾಗಿರುವ ಡೈಮೆರಿಕ್ ಚಾನಲ್‌ಗೆ GBTA ಯಿಂದ Hv1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಕ್ರಿಯೆಯು ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಎಂದು ತೀರ್ಮಾನಿಸಲು ನಮಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಎರಡು ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿನ ಸಂಯುಕ್ತಗಳ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳು ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕಲಿಯಾಗಿ ಜೋಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ. GBTA ತೆರೆದ ಚಾನಲ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಆವಿಷ್ಕಾರವು, ಸಂಬಂಧಿತ ಸಂಯುಕ್ತ 2GBI32 ಗಾಗಿ ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ಣಯಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ನಮ್ಮ ಸಹಕಾರಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮಾದರಿ GBTA (Fig. 2c) ಮೂಲಕ Hv1 ನ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ವಿವರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೆಂಬರೇನ್ ಮರುಧ್ರುವೀಕರಣದ ನಂತರ ಚಾನಲ್ ಟೈಲ್ ಪ್ರವಾಹಗಳ ಕೊಳೆಯುವಿಕೆಯ ಮೇಲೆ 2GBI ಮತ್ತು GBTA ಯ ವಿವಿಧ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಇದು ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ನಮ್ಮ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ.
ಎರಡು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ Hv1) ​​ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಾಧಿಸಬಹುದಾದ ಗರಿಷ್ಠ ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವು 2. ನಾವು Hv1 ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಅನ್ನು 1.31 ರ ಗುಣಾಂಕದೊಂದಿಗೆ ಬಂಧಿಸಲು GBTA ಅನ್ನು ಅಳತೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು Hv1 I127C ನಲ್ಲಿ 1.88 ಕ್ಕೆ ಏರಿತು. ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕ್ ಮುಕ್ತ ಶಕ್ತಿ, ಕಡಿಮೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಫಿನಿಟಿ ಸೈಟ್‌ಗಳ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮುಕ್ತ ಶಕ್ತಿಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸ (ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ), Hv1 ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ 1.3 kcal/ಮೋಲ್ ಮತ್ತು Hv1 I127C ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ 2.7 kcal/ಮೋಲ್. ಹಿಮೋಗ್ಲೋಬಿನ್‌ಗೆ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಸಹಕಾರಿ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಅತ್ಯಂತ ಪ್ರಸಿದ್ಧ ಮತ್ತು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾದ ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿದೆ. kcal/mol, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ 38. ಹೀಗಾಗಿ, ಜಾಗತಿಕ ಶಕ್ತಿಯ ಪರಿಭಾಷೆಯಲ್ಲಿ, Hv1 ಗೆ GBTA ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯ ಸಹಕಾರವು O2 ಹಿಮೋಗ್ಲೋಬಿನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಎರಡು ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿನ ವಿಭಿನ್ನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿದಾಗ ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ.
ನಮ್ಮ ಸಿನರ್ಜಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ, GBTA ಅಣುಗಳನ್ನು ಒಂದು ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವುದರಿಂದ ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಾಂಧವ್ಯ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು. ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ, ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಗಳು ತಮ್ಮ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತವೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬಿಗಿಯಾದ GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಆಗುತ್ತದೆ. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, S1 ಆಸ್ಪರ್ಟೇಟ್ D112 ಹೆಚ್ಚಿದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಂಬಂಧದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನ ಮರುಜೋಡಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ.D112 ಹಿಂದೆ Hv1 ಪ್ರೋಟಾನ್ ಪರ್ಮಿಯೇಷನ್ ​​ಪಾಥ್‌ವೇ ಭಾಗವಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸೆಲೆಕ್ಟಿವಿಟಿ ಫಿಲ್ಟರ್27,28 ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಎರಡು Hv1 ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿನ ಸೆಲೆಕ್ಟಿವಿಟಿ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. ಚಿತ್ರ 7a GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನ ಅಂದಾಜು ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು Hv1 VSD ಆಧಾರಿತ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್‌ನಲ್ಲಿ D112, D123, K125 ಮತ್ತು I127 ಶೇಷಗಳ ಸ್ಥಳವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. Hv1-CiVSP ಚೈಮೆರಾದ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯ ಮೇಲೆ. S1 ನ ಬಾಹ್ಯಕೋಶದ ಅಂತ್ಯವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಗೆ ಸೂಚಿಸಲಾದ ನಿರ್ದೇಶನಗಳನ್ನು ಕಪ್ಪು ಬಾಣಗಳೊಂದಿಗೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
(a) Hv1 VSD ಯ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್. Hv1-CiVSP ಚೈಮೆರಾದ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಭಾಗಗಳನ್ನು ಸಿಲಿಂಡರಾಕಾರದಂತೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ಸಂರಚನೆಯಲ್ಲಿ, S4 ವಿಭಾಗದ ಒಳ ತುದಿಯು CCD ಯೊಂದಿಗೆ ವಿಲೀನಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (ತೋರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ). ಬೌಂಡ್ GBTA ಯ ಊಹಿಸಲಾದ ಸ್ಥಳಗಳನ್ನು ಬೂದು ಅಂಡಾಕಾರಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕಪ್ಪು ಬಾಣಗಳು ಎರಡು ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ S1 ಅವಶೇಷಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳನ್ನು ಬಣ್ಣದ ಗೋಳಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. (b) Hv1 ಉಪಘಟಕಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ವಿವರಣೆಯನ್ನು ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಡೈಮರ್ ಸಂರಚನೆಗಳಲ್ಲಿ ಪೊರೆಯ ಸಮತಲದ ಬಾಹ್ಯ ಕೋಶದಿಂದ ನೋಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಡ ಫಲಕದಲ್ಲಿ, ಡೈಮರ್ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅನ್ನು S4 ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನಿಂದ ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎರಡು VSD ಗಳನ್ನು 20 ಡಿಗ್ರಿಗಳಷ್ಟು ಪ್ರದಕ್ಷಿಣಾಕಾರವಾಗಿ ಮೆಂಬರೇನ್ ಪ್ಲೇನ್‌ಗೆ ಲಂಬವಾಗಿರುವ ಅಕ್ಷದ ಸುತ್ತ ತಿರುಗುತ್ತದೆ. ಎರಡು S4 ಹೆಲಿಸ್‌ಗಳ (ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ಬಾಣಗಳು) ಹೊರ ತುದಿಗಳ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯು ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂರಚನೆಯಲ್ಲಿ, ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಗಳಿಂದ D123 ಮತ್ತು I127 ಅವಶೇಷಗಳು ಹತ್ತಿರ ಬರಲು ಅನುಮತಿಸಲಾಗಿದೆ.(c) CiVSP VSD ಯ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ 4G80 ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಡೈಮರ್ ಸಂರಚನೆಯಲ್ಲಿ. CiVSP ನಲ್ಲಿ P140 ಸ್ಥಾನವು Hv1 ರಲ್ಲಿ D123 ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ.
ಶೇಷ 123 (123D/123D ಅಥವಾ 123R/123R) ನಡುವಿನ ವಿಕರ್ಷಣ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ GBTA-ಬಂಧಿಸುವ ಸಹಕಾರದ "ಸಾಮಾನ್ಯ" ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಕರ್ಷಣೆಯಿಂದ ಆಕರ್ಷಿತ (123D/123R) ಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. , ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಹಕಾರ (Fig. 5g).ಅಲನೈನ್ ಪರ್ಯಾಯದೊಂದಿಗೆ ವಿಕರ್ಷಣೆಯ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದು ಸಹ ಸಹಕಾರದ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, 123A/123A ಡೈಮರ್‌ನ ಸಹಕಾರದಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ (Fig. 5e).ಒಂದು ಸಾಧ್ಯ. ವಿವರಣೆಯೆಂದರೆ, ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಇರಿಸುವ ಅಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುವ ಪರಿಣಾಮವು D123 ಅವಶೇಷಗಳ ನಡುವಿನ ವಿಕರ್ಷಣೆಯ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ನಿರ್ಮೂಲನೆಯಿಂದಾಗಿ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುವ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಮೀರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಬಂಧಿಸುವ ಸಹಕಾರದಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟಾರೆ ಕಡಿತಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. Mony et al.39 ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ವರದಿ ಮಾಡಿದೆ Ciona gutis Ci-Hv1 ನ ಸ್ಥಾನ D171 (ಮಾನವ Hv1 ನಲ್ಲಿ D123 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ) ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, D123 ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿದೆ ಎಂಬ ಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ.
Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳ ಗೇಟಿಂಗ್ ಅನೇಕ ಪರಿವರ್ತನೆಗಳ ಮೂಲಕ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ19,20,26,39,40,41.ಕ್ವಿಯು ಮತ್ತು ಇತರರು ಮೆಂಬರೇನ್ ಡಿಪೋಲರೈಸೇಶನ್‌ನ ಮೇಲೆ, Ci-Hv1 ನ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಸಂವೇದಕವು ಚಾನೆಲ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಆದರೆ ಇನ್ನೂ ಮುಚ್ಚಿರುವ ಒಂದು ಸಂರಚನಾ ಬದಲಾವಣೆಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ. , ಎರಡೂ ಉಪಘಟಕಗಳ ಹಾದಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟಾನ್‌ಗಳು ತೆರೆದ ವಹನಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಒಂದು ವಿಭಿನ್ನವಾದ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ. ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್‌ನಿಂದ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಸಂವೇದಕದ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು D171 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿನ ರೂಪಾಂತರದಿಂದ ಎರಡನೇ ಪರಿವರ್ತನೆಯು ಆಯ್ದವಾಗಿ ವಿಚಲಿತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ಪ್ರಕ್ಷುಬ್ಧತೆಯು ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕಗಳ D171 ಅವಶೇಷಗಳ ನಡುವಿನ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಈ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನವು ಅನುರೂಪ ಬದಲಾವಣೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಇರುತ್ತದೆ. ಮತ್ತು GBTA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.
Fujiwara et al25 ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಕಾಯಿಲ್ಡ್-ಕಾಯಿಲ್ ಡೊಮೇನ್‌ನ ಡೈಮರ್ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಎರಡು S4 ಹೆಲಿಗಳನ್ನು (Fig. 7b, ಎಡ ಫಲಕ) ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪೊರೆಯೊಳಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಿದರು. S4 ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು CCD ಅನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸುವ ಪ್ರದೇಶದ ಸಂಪೂರ್ಣ VSD ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ pH ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳನ್ನು ತೆರೆಯಲು ಗಣನೀಯವಾದ ಪೊರೆಯ ಡಿಪೋಲರೈಸೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಚಾನಲ್ ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ ಮುಚ್ಚಲ್ಪಟ್ಟಿರುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕಿಂಗ್ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಪತ್ತೆಯಾದ S4-S4 ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್ ಆಫ್-ಸ್ಟೇಟ್ ಸಬ್‌ಯುನಿಟ್ ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ. ಇತರ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಗೇಟಿಂಗ್ 17,21,26 ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್‌ಸಬ್ಯೂನಿಟ್ ಸಂವಹನಗಳಲ್ಲಿ S1 ಮತ್ತು S2 ಒಳಗೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ ಮತ್ತು ಚಾನಲ್‌ಗಳು ವಿಭಿನ್ನ ಉಪಘಟಕ ಸಂರಚನೆಗಳನ್ನು ತೆರೆದ ಮತ್ತು ಮುಚ್ಚಿದ ಸ್ಥಿತಿಗಳು, ಮೋನಿ ಮತ್ತು ಇತರರ ಸಂಶೋಧನೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾದ ಕಲ್ಪನೆ. S1 ಗೇಟಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 39 ಚಲಿಸುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿ, ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, S1 ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನ ಬಾಹ್ಯಕೋಶದ ತುದಿಗಳು ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ ಅಲೋಸ್ಟೆರಿಕ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವ ನೇರ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ. ವಿಸ್ತೃತ S4-S4 ಸಂವಹನಗಳೊಂದಿಗೆ ಡೈಮರ್ ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿ, S1 ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ತುಂಬಾ ದೂರದಲ್ಲಿದೆ ಪರಸ್ಪರ ಹೊರತಾಗಿ ನೇರವಾಗಿ ಸಂವಹನ ಮಾಡಲು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪೊರೆಯ ಸಮತಲಕ್ಕೆ ಲಂಬವಾಗಿರುವ ಅಕ್ಷದ ಸುತ್ತ ಎರಡು VSD ಉಪಘಟಕಗಳ 20 ° ಪ್ರದಕ್ಷಿಣಾಕಾರವಾಗಿ ತಿರುಗುವಿಕೆಯು, ಎರಡು S4 ಹೆಲಿಸ್‌ಗಳ ಹೊರ ತುದಿಗಳ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಸೇರಿ, S1-S1 ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ. ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳೊಂದಿಗೆ (Fig. 7b, ಬಲ ಫಲಕ). ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಚಾನಲ್‌ಗಾಗಿ ನಾವು ಈ ಸಂರಚನೆಯನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
CiVSP ಕಿಣ್ವವು ಮೊನೊಮರ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆಯಾದರೂ, ಅದರ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ VSD ಯ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯನ್ನು ಡೈಮರ್ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಡೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿರುವ S1 ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನ ಹೊರ ತುದಿಗಳು ಪ್ರಾದೇಶಿಕವಾಗಿ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿವೆ, ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಾರೆ ಸಂರಚನೆಯು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಿದಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ. Hv1 ಗಾಗಿ (Fig. 7c).CiVSP ಡೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿ, ಪಕ್ಕದ ಉಪಘಟಕದಿಂದ ಸಮೀಪವಿರುವ ಶೇಷವು 140 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಲೈನ್ ಆಗಿತ್ತು (Fig. 7c). ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, CiVSP ನಲ್ಲಿ P140 Hv1 ರಲ್ಲಿ D123 ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ. Hv1 ನಡುವಿನ ಉಪಘಟಕ ಸಂರಚನೆಯಲ್ಲಿನ ಹೋಲಿಕೆ ಮತ್ತು CiVSP ಡೈಮರ್‌ಗಳು ಈ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ VSD ಗಳು S1 ನ ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ತುದಿಗಳು ಸಂವಹನ ಮಾಡುವ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಆಂತರಿಕ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ವೀರ್ಯ ಕೋಶ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ Hv1 ನ ಅಗತ್ಯ ಪಾತ್ರವು ಈ ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ಪುರುಷ ಫಲವತ್ತತೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕೆ ಆಕರ್ಷಕ ಔಷಧದ ಗುರಿಯನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಇದಲ್ಲದೆ, ಮೈಕ್ರೋಗ್ಲಿಯಾದಲ್ಲಿ Hv1 ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ರಕ್ತಕೊರತೆಯ ಸ್ಟ್ರೋಕ್‌ನಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಇನ್ನಷ್ಟು ಹದಗೆಡಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ವರ್ಧಿತ Hv1 ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಸ್ತನ 12 ಅಥವಾ ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಬದುಕುಳಿಯುವುದು 13 ಮತ್ತು B-ಕೋಶದ ಮಾರಣಾಂತಿಕತೆಗೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ 11 .ಆದ್ದರಿಂದ, Hv1 ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಸಣ್ಣ ಅಣುವಿನ ಔಷಧಗಳನ್ನು ನ್ಯೂರೋಪ್ರೊಟೆಕ್ಟಿವ್ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಆಂಟಿಕಾನ್ಸರ್ ಚಿಕಿತ್ಸಕಗಳಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು. ತೆರೆದ Hv1 ಉಪಘಟಕ, ಹೆಚ್ಚಿದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಾಂಧವ್ಯಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, Hv1 ಚಾನಲ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡು ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಬಲವಾದ ಔಷಧಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.
ಮಾನವ Hv1 ನ ಸೈಟ್-ನಿರ್ದೇಶಿತ ಮ್ಯುಟಾಜೆನೆಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ PCR ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. Hv1NCCiVSP ನಿರ್ಮಾಣದಲ್ಲಿ, Hv1 ನ 1-96 ಮತ್ತು 228-273 ಶೇಷಗಳನ್ನು CiVSP18 ನ 1-113 ಮತ್ತು 240-576 ಶೇಷಗಳಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗಿದೆ. ಒಂದು ಉಪಘಟಕದ C-ಟರ್ಮಿನಸ್ ಅನ್ನು GGSGGSGGSGSGGSGG ಲಿಂಕರ್ ಮೂಲಕ ಎರಡನೇ ಉಪಘಟಕದ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ವಿವಿಧ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ pGEMHE ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳನ್ನು Nhe1 ಅಥವಾ Sph1 ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಕಿಣ್ವಗಳೊಂದಿಗೆ ರೇಖೀಯಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ಮತ್ತು RNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು T7 mMessage mMachine ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಕಿಟ್ (Ambion).ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ಅಳತೆಗಳಿಗೆ 1-3 ದಿನಗಳ ಮೊದಲು, cRNA ಅನ್ನು ಕ್ಸೆನೋಪಸ್ ಓಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು (ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ 50 nl, 0.3-1.5 μg/μl). ಕ್ಸೆನೋಪಸ್ ಲೇವಿಸ್‌ನಿಂದ ಹಂತ V ಮತ್ತು VI ಓಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ (NASCO) Ecocyte Bioscience ನಿಂದ. RNA ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ, ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ND96 ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM ಪೈರುವೇಟ್, 100 μg/ml gentamicin ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ND96 ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ. .
2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೊ-ಬೆಂಜಿಮಿಡಾಜೋಲ್[1], 2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೊ-ಬೆಂಜೊಥಿಯಾಜೋಲ್[2], (4-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-ಐಎಲ್)ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ [5], (5-ಬ್ರೊಮೊ-4 -ಮೀಥೈಲ್-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ಈಥೈಲ್ 2-guanidino-5-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-4-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಟ್ [8], ಈಥೈಲ್ 2-guanidino-4- ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್- 5-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಟ್ [9] ಮತ್ತು (2-ಗ್ವಾನಿಡಿನೋ-4-ಮೀಥೈಲ್-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-5-ಐಎಲ್) ಈಥೈಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್ [10] ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್‌ನಿಂದ ಬಂದವು. ಫಾಮೋಟಿಡಿನ್ [7] ಎಂಪಿ ಬಯೋಮೆಡಿಕಲ್ಸ್‌ನಿಂದ.1-[4 -(4-ಕ್ಲೋರೋಫೆನಿಲ್)-1,3-ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-ಐಎಲ್]ಗ್ವಾನಿಡಿನ್[11] ಮತ್ತು 1-[4-(3,4-ಡೈಮೆಥಾಕ್ಸಿಫೆನಿಲ್)-1,3- ಥಿಯಾಜೋಲ್-2-ಐಎಲ್]ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ [12] ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್‌ನಿಂದ.ಈ ಸಂಯುಕ್ತಗಳು ವಾಣಿಜ್ಯಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಅತ್ಯುನ್ನತ ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ಅವುಗಳನ್ನು 100 mM ಸ್ಟಾಕ್ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಒಣ DMSO ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಅದನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಅಪೇಕ್ಷಿತ ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಂಯೋಜನೆಗಳು 3 ಮತ್ತು 4 ಅನ್ನು ಕೆಳಗೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಕನಿಷ್ಠ 99% ಶುದ್ಧತೆ.
25 ಮಿಲಿ ಜಲೀಯ ಹೈಡ್ರೋಕ್ಲೋರಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ (2.5 ಎನ್) 2-ಅಮಿನೋ-4-(ಟ್ರೈಫ್ಲೋರೋಮೆಥೈಲ್) ಬೆಂಜೆನೆಥಿಯೋಲ್ ಹೈಡ್ರೋಕ್ಲೋರೈಡ್ (1.02 ಗ್ರಾಂ, 4.5 ಎಂಎಂಒಎಲ್) ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಘನ ಡೈಕ್ಯಾಂಡಿಯಾಮೈಡ್ (380 ಮಿಗ್ರಾಂ, 4.5 ಎಂಎಂಒಎಲ್) ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಹೆಟರ್ಜೆನ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಹುರುಪಿನ ಸ್ಫೂರ್ತಿದಾಯಕದೊಂದಿಗೆ ರಿಫ್ಲಕ್ಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ತಂಪಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 10N ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ರೂಪುಗೊಂಡ ಬಿಳಿ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿ, ತಣ್ಣೀರಿನಿಂದ ತೊಳೆದು (3 × 50 ಮಿಲಿ), ಒಲೆಯಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಿ ( 65 °C) ಹಲವಾರು ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಈಥೈಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್/ಪೆಟ್ರೋಲಿಯಂ ಈಥರ್‌ನಿಂದ ಬಿಳಿಯ ಘನವನ್ನು ನೀಡಲು (500 mg, 48 %) ಮರುಹರಳುಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ; mp 221-222 °C (ಬೆಳಕು 225-226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (ಅತ್ಯಂತ ವಿಶಾಲವಾದ s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಮೌಲ್ಯ. C9H8F3N4S ಗಾಗಿ (M, 1 ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. 26 : 261.0419.
Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ, ಸಣ್ಣ ಪರೀಕ್ಷಾ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ತೈಲ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ 200 °C ಗೆ ಬಿಸಿಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. 300 mg (ದೊಡ್ಡ ಹೆಚ್ಚುವರಿ) ಸೈನಮೈಡ್ ಮತ್ತು ಬಿಸಿ ಸಂಯುಕ್ತಕ್ಕೆ ಹೈಡ್ರೋಕ್ಲೋರಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸುಮಾರು 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ತೈಲ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು, ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ನೀರು ಆವಿಯಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ತಂಪಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಘನೀಕರಿಸಿದ ವಸ್ತು ತೆಳು ಹಳದಿ ಅಸ್ಫಾಟಿಕ ಘನವನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಸಣ್ಣ ತುಂಡುಗಳಾಗಿ ಒಡೆದು ನೀರಿನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d , 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI: 169.1. HRMS: 699 , ಕಂಡುಬಂದಿದೆ: 243.0704.
ಪ್ರೋಟಾನ್ ಪ್ರವಾಹಗಳನ್ನು pClamp10 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಆಕ್ಸಾನ್ ಡಿಜಿಡಾಟಾ 1440A (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ನಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುವ ಆಕ್ಸಾಪ್ಯಾಚ್ 200B ಆಂಪ್ಲಿಫಯರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿಭಿನ್ನ ರಚನೆಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಓಸೈಟ್‌ಗಳ ಆಂತರಿಕ ಮತ್ತು ಬಾಹ್ಯ ಪ್ಯಾಚ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶ ಮತ್ತು ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಪರಿಹಾರಗಳು ಒಂದೇ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ: )ಎಥೆನೆಸಲ್ಫೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (MES), 30 mM ಟೆಟ್ರಾಎಥೈಲಾಮೊನಿಯಮ್ (TEA) ಮೆಸಿಲೇಟ್, 5 mM TEA ಕ್ಲೋರೈಡ್, 5 mM ಎಥಿಲೀನ್ ಗ್ಲೈಕಾಲ್-ಬಿಸ್(2-ಅಮಿನೋಥೈಲ್)-N,N,N',N'-ಟೆಟ್ರಾಸೆಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ (EGTA), ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ TEA ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ನೊಂದಿಗೆ pH 6.0. ಎಲ್ಲಾ ಮಾಪನಗಳನ್ನು 22 ± 2 °C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪೈಪೆಟ್ 1.5-4 MΩ ನ ಪ್ರವೇಶ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಪ್ರಸ್ತುತ ಕುರುಹುಗಳನ್ನು 1 kHz ನಲ್ಲಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, 5 kHz ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿ ಮತ್ತು Clampfit10.2 (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ) ಮತ್ತು ಮೂಲ 8.1 (OriginLab).
Hv1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕದ ವಿವಿಧ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪರಿಹಾರಗಳು ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ 10 mM βME ಅನ್ನು ಗುರುತ್ವಾಕರ್ಷಣೆಯಿಂದ ಸ್ನಾನದೊಳಗೆ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು VC-6 ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ವಾಲ್ವ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ (ವಾರ್ನರ್ Instr.) ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾದ ಮ್ಯಾನಿಫೋಲ್ಡ್ ಮೂಲಕ, ಇದನ್ನು pClamp ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ TTL (ಟ್ರಾನ್ಸಿಸ್ಟರ್-) ಮೂಲಕ ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು. ಟ್ರಾನ್ಸಿಸ್ಟರ್ ಲಾಜಿಕ್) ಸಂಕೇತಗಳು. ಬಹು-ಟ್ಯೂಬ್ ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಪೆನ್ಸಿಲ್ (ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ವಿಜ್ಞಾನ) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕ್ಷಿಪ್ರ ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಜೊತೆಗೆ 360 μm ವ್ಯಾಸದ ವಿತರಣಾ ತುದಿಯನ್ನು ಪ್ಯಾಚ್ ಪೈಪೆಟ್‌ನ ಮುಂಭಾಗದಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. +120 mV ಡಿಪೋಲರೈಸಿಂಗ್ ಪಲ್ಸ್ ಪ್ರಸ್ತುತ ಕೊಳೆತವನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ 18 .GV ಗ್ರಾಫ್ ಬೋಲ್ಟ್ಜ್‌ಮನ್ ಸಮೀಕರಣಕ್ಕೆ ಸರಿಹೊಂದುತ್ತದೆ:
ಚಾನೆಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಸಂಯೋಜನೆಗಳಿಗೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಟೇಬಲ್ 1) ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ವಿಘಟನೆಯ ಸ್ಥಿರಾಂಕಗಳನ್ನು (ಕೆಡಿ) ಹಿಲ್ ಸಮೀಕರಣದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು (ಸರಾಸರಿ % inhib ಮೌಲ್ಯಗಳು) ಅಳವಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ:
ಇಲ್ಲಿ [I] ಪ್ರತಿಬಂಧಕ I ಮತ್ತು h ಎಂಬುದು ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವಾಗಿದೆ. ಹಿಲ್ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು, ಸಮೀಕರಣವನ್ನು (2) ಹೀಗೆ ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ: