Spas ji bo seredana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin ji bo CSS-ê piştgirî tixûbdar e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî moda lihevhatinê ya di Internet Explorer-ê de qut bikin). Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgiriya berdewam, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan bidin.
Kanala protonê-deriyê voltaja Hv1 kompleksek dimerîk e ku ji du domên hestiyar-voltajê (VSD) pêk tê, her yek ji wan rêgezek derbasbûna protonê ya dergehî vedihewîne. Dimerîzasyon ji hêla domîna kulîlk-pêla sîtoplazmî ve tê kontrol kirin.Derbasbûna ji rewşa girtî ber Dewleta vekirî di her du VSD-yan de tê zanîn ku bi hevkariyê pêk tê; Lêbelê, hindik di derbarê mekanîzmayên bingehîn de têne zanîn. Têkiliyên navberê di pêvajoyên allosterîk de rolek sereke dileyzin; lêbelê, navberên weha di kanalên Hv1 vekirî de nehatine nas kirin. Li vir em destnîşan dikin ku derûvên 2-guanidinothiazole du Hv1 VSD bi rengek hevkariyê asteng dikin û yek ji van pêkhateyan wekî lêkolînek ji bo hevgirtina alosterîk a di navbera binerdeyên vekirî de bikar tînin. Me dît ku şaneyên derveyî dawiya parça transmembrane ya yekem a VSD têkiliyek navbingehek çêdike ku navbeynkariya hevgirtina di navbera malperên girêdanê de dike, di heman demê de qada kelijandinî rasterast beşdarî vê pêvajoyê nabe. Her weha me delîlên xurt dîtin ku parzûna proton-hilbijartî ya kanalê hevkariya astengker-girêdanê kontrol dike. .
Kanalên protonê yên voltaj-derî di cûrbecûr zîndeweran de, ji fîtoplankton bigire heya mirovan, rolek girîng dilîzin. Di piraniya şaneyan de, ev kanal navbeynkariya derketina protonê ya ji parzûna protonê dikin û çalakiya NADPH oxidase birêkûpêk dikin. Di mirovan de tenê kanala proton-deriyê voltaja tê zanîn. Hv1 e, ku hilbera gena HVCN12,3 e. Hv1 (aka VSOP) hatiye nîşandan ku di pirbûna şaneya B4 de, hilberîna celebên oksîjenê yên reaktîf ji hêla pergala xweparastinê ve 5,6,7,8, şaneya spermê de rolek dilîze. tevgerîn9 û rêziknameya pH ya şilava rûyê hewayê10. Ev kanal di gelek cureyên penceşêrê de yên wekî Nexweşiyên hucreyên B4,11 û kansera pêsîrê û kolorektal12,13-yên Zêde diyarkirî de têkildar e. Hat dîtin ku çalakiya zêde ya Hv1 potansiyela metastatîkî ya hucreyên penceşêrê zêde dike 11, 12. Di mêjî de, Hv1 tê diyar kirin. ji hêla mîkroglia ve, û çalakiya wê hate destnîşan kirin ku di modelên strokeya iskemîk de zirara mêjî zêde dike.
Di proteîna Hv1 de domînek hestiyar-voltajê (VSD) heye, ku ji çar beşên transmembranî yên bi navê S1 heta S414 pêk tê. Ciona gutis15.Di van proteînên din de, C-termînala S4 bi modulek bandorker, qada pore an enzîmê ve girêdayî ye. Di Hv1 de, S4 bi qada kelijandin (CCD) ve girêdayî ye ku li aliyê sîtoplazmî yê parzûnê ye. .Kanal kompleksek dimerîk e ku ji du VSD-yan pêk tê, ku her yek rêgezek derbasbûna protonê ya dergehî vedihewîne16,17,18. Ev her du binyekeyên Hv1 hatin dîtin ku bi hevkarî vebûne19,20,21,22, ku pêşniyar dike ku hevgirtina allosterîk û danûstendinên nav-binbeşekê dileyzin. di pêvajoya dergehê de rolek girîng heye. Têkiliya di navbera binyekeyên di hundurê domîna kulîlkê de baş tê pênase kirin ji ber ku strukturên krîstal ên her du domên veqetandî hene22,23. Ji hêla din ve, pêwendiya navbera VSD-yên di hundurê membranê de ne. baş tê fêm kirin. Struktura krîstal a proteîna kîmerîkî ya Hv1-CiVSP di derbarê vê navberê de agahdarî nade, ji ber ku rêxistina trimerîkî ya kompleksa kanala krîstalkirî dibe ku ji guheztina CCD-a xwemalî ya Hv1 ji hêla zippera leucîn a hevîrtirşkê GCN424 ve bibe.
Lêkolînek vê dawîyê ya rêxistina binyekîneya kanala Hv1 destnîşan kir ku du helîkên S4 bêyî têkçûnek giran a strukturên duyemîn derbasî CCDê dibin, di encamê de helîkên dirêj ên ku ji parzûnê dest pê dikin û di nav sîtoplazmayê de dimeşin. ev lêkolîn pêşniyar dike ku Hv1 VSD bi beşa S4 re bi hevûdu re têkilî daynin.Lêbelê, lêkolînên din di navbera VSD-yan de navgînên alternatîf pêşniyar kirine. Van navbeynkaran beşên S1 17, 21, 26 û dawiya derve ya beşa S2 21 dihewîne. Sedemek muhtemel a nakokî encamên van lêkolînan ev e ku pevgirêdana allosterîk di navbera VSD-an de bi pêvajoya dergehê ve, ku bi dewletên girtî û vekirî ve girêdayî ye, hate vekolîn, û pêwendiya di navbera VSD-an de dibe ku di guheztinên dewletên cihêreng de di konformasyonê de cûda bibe.
Li vir, me dît ku 2-guanidinothiazole kanalên Hv1 bi hevgirtinê ve bi du VSD-yên vekirî ve girêdide, û yek ji pêkhateyan, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) bikar anî da ku têkiliya di navbera binbeşan di rewşa vekirî de lêkolîn bike. navbeynkar.Me dît ku kêşeya girêdana GBTA dikare bi modelek mîqdar ve baş were rave kirin ku tê de girêdana înhîbîtorek bi yek yekîneyek re dibe sedema zêdebûna girêdana girêdana yekîneya cîran. Her weha me dît ku bermayiyên D112, fîlterên hilbijartî yên ji bo qenala 27, 28 û beşek ji cîhê girêdana 29-ê ya girêdayiya guanidine 29 hevrêziya girêdana GBTA-yê kontrol dikin. Em destnîşan dikin ku girêdana hevkariyê di dimera Hv1 de, ku CCD ji beşa S4 vediqetîne, tê domandin, û destnîşan dike ku pêwendiya navberê ya di CCD de rasterast nagire navbeynkariya allosterîk di navbera malperên GBTA-girêdanê de navbeynkar dike. Berevajî vê, em dibînin ku perçeya S1 beşek ji navbeynkariya di navbera yekîneyan de ye û lihevhatinek VSD-yên cîran bi dawiya derveyî hucreyê ya S4 helîxê dûrî navenda dimerê pêşniyar dike ku destûrê bide. perçeya S1 di rewşa vekirî de be.
Inhibîtorên molekulên piçûk ên Hv1 wekî dermanên antîpenceşêrê û ajanên neuroprotektîv bikêr in. Lêbelê, heya îro, çend pêkhateyan karîbûn kanalê30,31,32,33 asteng bikin. Di nav wan de, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, pêkhate [1] di Figure de 1a) û jêderkên wê hatin dîtin ku derbasbûna VSD29,32 ya protonan bi kanalê re asteng dikin. Tê texmîn kirin ku girêdana van pêkhateyan bi rengek serbixwe di du binbeşên vekirî de pêk tê. berê hate destnîşan kirin ku Hv1 hema hema bi qasî 2GBI bi bandor dema ku bi giraniya 200 μM tê ceribandin (Wêne 1b) asteng dike. Me bergiriyên din ên thiazole lêkolîn kir û dît ku hin ji wan kanalê bi hêzek wekhev an mezintir ji GBTA asteng dikin (Hêjî. 1 û Pêvek. metn).Me kelûpelên berteka konsantrasyonê yên çar jêderkên tîazole (GBTA û pêkhateyên [3], [6] û [11], Xiflteya 1c) destnîşan kirin û dît ku ew ji yên 2GBI asêtir in. Rêjeyên Hill (h) ji derûvên thiazole ji 1,109 ± 0,040 heta 1,306 ± 0,033 (Hêjî. 1c û Hêjmara Pêvek. 1). Berevajî vê, hevsengiya Hill ji bo 2GBI 0,975 ± 0,024 29 bû, Fig. 2a û Hêjmara Pêvek. 1). Ahenga Hilê ya li jor 1 hevkariyê girêdide nîşan dide. Ji ber ku her yekîneyek Hv1 xwedan înhîbitorê xwe ye. malpera girêdanê, 29,32 me amaje kir ku girêdana derûvek tîazole bi yek yekîneyek dikare girêdana molekulek înhîbîtor a duyemîn bi yekîneya cîran re zêde bike. GBTA berhevoka ceribandinê bû bi rêjeya herî bilind a Hill. Ji ber vê yekê, me ev pêkhate hilbijart ku bêtir mekanîzmaya hevrêziya girêdanê lêkolîn bikin û 2GBI wekî kontrolek neyînî ya referansê bikar bînin.
(a) Pêkhateyên ceribandinê: [1] Referansa Hv1 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Astengkirina çalakiya Hv1 ya mirovî ji hêla guanidinothiazoles û berhevoka referansê 2GBI (barên kesk-şîn) Herikîna protonê .Hv1 di lewheyên hundir-derve yên oocytes Xenopus de hatin pîvandin di bersivê de ji depolarîzasyona ji potansiyela xwegirtinê ya -80 mV heta +120 mV. Her înhîbîtor bi giraniya 200 μM li serşokê hate zêdekirin. pHi = pHo = 6,0 .Daneyên mean±SEM in (n≥4).(c) Astengkirina girêdayê konsransiyonê ya Hv1 mirovî ji hêla pêkhateyên [2], [3], [6] û [11] ve.Her xala navînî astengkirina ± SD ya 3 nîşan dide. heta 15 pîvandin. Rêz bihevhatinek Hillê ye ku ji bo bidestxistina nirxên Kd yên diyar ên ku di Tabloya Pêvek 1 de hatine rapor kirin tê bikar anîn. Rêjeyên çîyayê ji berhevokên ku di hêjmara Pêvekirî 1 de hatine ragihandin hatine destnîşankirin: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (Li Rêbazan binêre).
(a,b) Pêkhateyên 2GBI û GBTA Hv1-ya dimerîk û monomerîk bi rengekî girêdayê konsantreyê asteng dikin.Her nuqte rawestana navînî ± SD ya 3 heta 8 pîvandinan temsîl dike û kevçî bihevhatina Hillê ye. Rêjeyên Girê (h) di histogramên xêzkirî ji hevhatinên ku di Hêjmarên Pêvek 3 û 4 de hatine ragihandin hatine destnîşan kirin. Bersiva komkirinê ya GBTA ya ku di (a) de hatî xuyang kirin wekî ya di jimar 1c de ye. Ji bo nirxên Kd yên xuya li Tabloya Pêvek 1 binêre. (c) Modelkirina girêdana hevkar a GBTA bi dimerîk Hv1 re. Xeta reş a zexm bi hevkêşeya (6) ve lihevhatina daneyên ceribandinê nîşan dide, ku modela girêdanê ya ku di (d) de hatî xuyang kirin diyar dike. -Kurkên hevsengiya veqetandinê yên bûyerên girêdanê yên yekem û duyemîn, bi rêzê ve (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Bin 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diyagrama şematîkî ya mekanîzmaya pêşniyarkirî ya bloka Hv1. Di rewşa GBTA-yê de, girêdana bi yek yekîneyeke vekirî ve girêdana yekîneya vekirî ya cîranê zêde dike (Kd2 Kanalên Hv1 dikarin bi guheztina domên sîtoplazmîk ên wan ên N- û C-termînalê bi beşên têkildar ên fosfataza CiVSP (Hv1NCCiVSP) hesas a voltaja CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 veguhezînin qadên wan ên N- û C-termînalê. wan bi ya astengkirina kanala dimerîk (cûreya çolê) re dan ber hev (Hêjî. 2a,b). Me dît ku ferqa di hevkarîya girêdanê ya di navbera her du pêkhateyan de di monomerîk Hv1 de ji holê rabû, piştgirî dide ravekirina ku girêdana GBTA bi yek yekîneyek re zêde dike. girêdana yekîneya din a ji bo înhîbîtorê. Me amaje kir ku girêdana GBTA bi yekîneyek Hv1 re dibe ku bibe sedema ji nû vesazkirina cîhê girêdayiyê (derxistina fit35), ku dê ji nû ve vesazkirina cîhê girêdana vala ya binyekîneya cîran ve bibe sedema vesazkirina girêdanê. affinity.
Ji bo danasîna jimareyî girêdana hevkar a GBTA ya bi kanalê re, me modelek bikar anî ku tê de her yekîneyek dikare molekula înhîbîtorê ya yekem li dû reaksiyonek bimolekularî bi Kd1 domdar a veqetandinê ve girê bide (Hêjî. 2c, Bin 1, OO+ B ⇆ BO*). Girêdan dibe sedem ku kanal rewşek bipejirîne ku tê de yekîneyên vala yên mayî li dû reaksiyonek bimolekular a yekta ku bi berdewamiya veqetandinê Kd2 ve bi înhîbîtorê ve girêdidin, li wir Kd2 Xeta reş a zexm a di jimar 2c de lihevhatina hevkêşeya modelê ye bi kêşeya ceribandî-bersivdana ceribandinê re, ku Kd1 ~290 μM û Kd2 ~29 μM peyda dike (Beşa Rêbaz, hevkêşe (6)). Model her weha diyar dike. girêdana 2GBI, ku Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Hêl. 2d). Di Hv1 monomerî de, tenê cîhek girêdanê û yek Kdm (O° + B ⇆ B°) heye. Di rewşa GBTA de, Kdm dora 54 e. μM, ku ji Kd2 bêtir dişibihe Kd1 (Hêl. 2d). Bi gotinek din, cîhê girêdana monomerê di veavakirinekê de ye (O°) ji ya nizm zêdetir dişibihe rewşa pêwendiya bilind (BO*). rewşa hevrêziyê (OO) ya dimer, bi îhtîmalek mezin ji ber rakirina pêwendiya di navbera yekîneyan de.
Wekî ku berê ji bo 2GBI32 hate xuyang kirin, me dît ku GBTA herikên Hv1 bi astengkirina kanalê vekir dema ku ew vekirî bû, ne ku vekirina wê dijwartir dike (Wêjeya Pêvek. 2a,b,d). Her weha tê zanîn ku 2GBI herikîna dûvikê hêdî hêdî hildiweşe. di berteka ji nûvepolarîzasyona membranê de, lê ev diyarde di GBTAyê de nehat dîtin (Hêjmara Pêvek. 2c). Di hebûna neçalakkirina Hv1 de di hebûna 2GBI de, dergehên her yekîneyek nikare bigire heta ku astengker ji cîhê girêdanê dernekeve (" mekanîzmaya deriyê lingê"), û 2GBI ji deriyên nêzîk de hêdîtir vediqete. Heke yekîneyek Hv1 bê blokekirin û girtin, dema ku bineyekîneya cîran asê bimîne, venekişandina molekulên 2GBI yên mayî hêdîtir dibe (girtina astengker). Cureyên kanalên demdirêj bi tenê yek yekîneyeke astengkirî berî girtina protonan bi awayekî demkî dimeşîne û tevkariyek girîng di herika dûvikê de ku hêdî hêdî diqelişe.
Vedîtina ku rizîbûna herikîna dûvika Hv1 di hebûna GBTAyê de (Hêjêra pêvek. 2c) bi girîngî hêdî nebûye, bi mekanîzmayek girêdana sînerjîstîkî ya ji bo vê astengkerê re hevaheng e (Wêne. 2d). Carekê molekulek GBTA ji binyekîneya Hv1 veneqete. , girêdana astengkerê bi yekîneya cîran re bi qasî 10 qatan dadikeve, ev yek alîgirê pêvajoya veneqetandinê ye. Ev tê vê wateyê ku molekula duyemîn a GBTA beriya ku di kanalê de bimîne xwedan şansê veqetandinê ye. Hilberîna tenê yek yekîneyek astengker tê çaverê kirin ku di hebûna GBTA-yê de ji hebûna 2GBI pir pirtir be, ku di encamê de zûtir hilweşîna niha ya dûvikê çêdibe.
Ji bo ku GBTA bi her du yekîneyên Hv1 re bi hevkariyê ve girêbide, divê cîhên girêdanê bi rengek alosterîkî werin girêdan. Divê her malperek girêdanê bikaribe: 1) zincîreyek bûyeran bide destpêkirin ku bi yekîneyên cîran ên ku bi înhîbîtorê ve girêdayî ne, û 2) navbeynkariyê bike. derbasbûna ji girêdana kêm-bersiv ber bi girêdana zêde. Me fikir kir ku heke bermahiyên taybetî yên di hundurê cîhê girêdanê de beşdarî pêvajoya hevkariyê bibin, mutasyona wan divê hevsengiya Hill-ê ya berteng-bersivê ya astengkirina GBTA ya Hv1 biguhezîne. Bermayiyên D112, F150 , S181 û R211 berê wekî beşek ji hawîrdora girêdana 2GBI29 dihatin xuyang kirin û me hîpotez kir ku ew ê bi heman rengî beşdarî girêdana GBTA-yê bibin (Wêne. 3A). Me ji bo kanalên mutant D112E, F150A, S181A kelûpelên berteka-bersivê yên GBTA pîvandin. , û R211S (Wêne 3) û hevahengên wan ên Girê bi yên Hv1-cûreya çolê re dan ber hev, 2GBI wekî referans bikar tînin. Bermahî V109 li ser heman rûyê beşa S1 wekî D112 ye û di hundurê şaneyê de zivirînek helîkî ya zêde heye. Ji ber ku V109 di girêdana 2GBI29 de nebû, me mutant V109A wekî kontrol bikar anî (Hêjîrê. 3b).
(a) Bermayiyên Hv1 yên pêşniyarkirî yên ku di girêdana derîvasyona guanidine de têkildar in. Kûçikên şîn ên şikestî li dora zincîreyên alî yên berê yên pêşniyarkirî yên ku bi beşên cihêreng ên pêkhateya 2GBI29 re têkilî didin. sorê tarî).Her nuqte astengkirina navînî ya 3 heta 12 pîvandinan ± SD V109 wekî kontrolek neyînî nîşan dide. Kêlkêşan lihevhatinên Girê ne ku ji bo bidestxistina nirxên Kd yên diyar têne bikar anîn (li Tabloya Pêvek 1 binêre). Rêjeyên Hill (h) di histogramên xêzkirî ji guncanên ku di Hêjmarên Pêvek 3 û 4 de hatine ragihandin hatine destnîşankirin.Nirxên h yên referansê yên ji bo Hv1 WT wekî xetên şikestî têne xuyang kirin. Stêrk cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî yên di navbera dergehên mutant û WT de destnîşan dikin (p Me dît ku mutasyona D112E bi girîngî hevbera Hill kêm kir (p Vedîtina ku hevsengiya Hill ji bo girêdana GBTA di dîmera Hv1 de ji 1-ê bilindtir e û di kanala monomerîk de dibe ~1 (Hêl. 2b) bi hebûna têkilîyên allosterîk ên di navbera deverên girêdanê yên di her du yekîneyan de hevaheng e. Heke ev be di rewşê de, hevsengiya Girêdana GBTA ya bi dimera ku astengker bi yek yekîneyekê ve girêdaye divê ~ 1 be. Me ev pêşbîniyê di dîmera girêdayî Hv1 F150A-WT de ceriband (Hêjîrê. 4a), ku tê de têkiliya F150A heye. yekîneya GBTA ji 2 rêzan mezintir ji ya binyekeya WTyê zêdetir bû (Hêl. 1c û 3d). Dûv re me ji bo astengkirina binyekîneya WT kevçîyên berteka-bersiv pîva bi giraniya bingehîn a 2 μM GBTA. , tê çaverê kirin ku astengker bi qasî 99% ji yekîneya F150A û (a) Diyagrama şematîkî ya dimera hevbendê F150A-WT ku ji bo çêkirina nîvkanala astengker tê bikar anîn ({F150A}b-WT/BAO*). Almasên spî cîhê mutasyonê nîşan didin. Di rewşên BAO* û BA*B* de, Tê çaverêkirin ku têkilbûna yekîneya F150A ji ya binyekîneya WT mezintir be. (b) Herikên protonê yên ji kanalên F150A-WT di bersivdayîna guhertinên di potansiyela membranê de ji -80 mV ber +120 mV têne pîvandin. pHi = pHo = 6,0 .Şopên gewr herikên ku di nebûna înhîbîtorê de têne pîvandin nîşan dide. Şopa reş (kontrol) herikîna ku piştî lêzêdekirina 2 μM GBTA tê pîvandin nîşan dide. Di vê giraniyê de, jêr-yekîneya WT bi girîngî nehat asteng kirin, lê binê yekîneya F150A hema hema bi tevahî bi GBTA ve girêdayî bû. ({F150A}b-WT). Zêdebûneke din a giraniya GBTAyê bû sedema blokekirina binyekeya WT (şopên porteqalî û sor). Binyekeya F150A).Her nuqte rawestana navînî ± SD ya 3 heta 7 pîvanan nîşan dide. Kevir ji bo bidestxistina nirxên Kd yên diyar ên ku di Tabloya Pêvek 1 de hatine rapor kirin Pevgirêkên Hillê hatine bikar anîn. Rêjeyên ku di hîstogramên navmalê de têne xuyang kirin ji guncanên ku di Hêjmarên Pêvek 3 û 4 de hatine ragihandin hatine destnîşankirin. Nirxên h yên Hv1 WT ev in. wekî xetên şikestî têne xuyang kirin. Stêrk li gorî WT dimer Hv1 cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî nîşan didin (p Ji ber ku astengkirina GBTA ya Hv1 di kanala vekirî de hate pîvandin, me fikir kir ku hevkariya girêdana GBTA dikare were bikar anîn ji bo lêkolîna mekanîzmaya pevgirêdana navbeşekê ya di rewşa vekirî de. Van her du yekîneyên Hv1 berê hatibûn dîtin ku bi hevkariyê 19,20,21 hatine girtin. 22 û pevgirêdana navbirûkê ku tev li dergehê dibe, hate pêşniyar kirin ku bi navbeynkariya navbeynkariya sîtoplazmîkî-heval-heval (CCD) 22,25. Ji ber vê yekê, me pirsî gelo CCD jî di hevgirtina di navbera deverên GBTA-girêdanê de di rewşa vekirî de têkildar e. Triglycine mutasyonên di navbera perçeya transmembrane ya S4 û qada kelijandinê de di lêkolînên berê de hatine destnîşan kirin da ku vê domanê ji kanala mayî veqetîne di heman demê de ku yekitiya dimerîzasyonê diparêze. Ji ber vê yekê, me bandora mutasyonên V220G, K221G û T222G ceriband. 5a, mutant GGG) li ser hevkarîya girêdana GBTA. Me kêmbûnek îstatîstîkî ya ne girîng dît (p > 0,05) di rêjeya Girêdana GBTA ya bi kanalên GGG re li gorî celebê çolê (Hêjîrê. 5c), destnîşan dike ku tevî rola wê ya di domandina kanalên GGG de. du binbeşek bi hev re girîng in, lê CCD rasterast navbeynkariya hevbendiya allosterîk a navbingehek di navbera malperên girêdana GBTA de nake.
(a) Diyagrama şematîkî ya dimera Hv1 ya bi mutasyonek trîglîsîn a li dawiya hundurê S4-ê hatî çêkirin ku ji bo têkbirina pevgirêdana navbera yekîneya ku bi navbeynkariya qada kelpîçandî ya sîtoplazmî (tîrên şîn) ve hatî çêkirin hatiye çêkirin. mutasyonên destnîşankirî, ku ji bo ceribandina perçeyên S1 yên ku di berhevkirina di navbera binerdeyên (tîrên şîn) de têkildar in, hatine sêwirandin. (c–h) 2GBI (ciyan) û GBTA (sora tarî) avahîyên destnîşankirî bi rengekî girêdayî konsantreyê asteng dikin.Her nuqte astengkirina navîn temsîl dike ± SD ji 3 heta 10 pîvandin. Kevir bihevhatinek Hillê bû ku ji bo bidestxistina nirxên Kd-yê yên diyar (binihêrin Tabloya Pêvek 1) tê bikar anîn. Hv1 WT wekî xetên şikestî têne xuyang kirin. Stêrk cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî yên di navbera rêçên mutant û WT de destnîşan dikin (p Ji ber ku me CCD wekî navbeynkarek rasterast a girêdana hevkariyê ya GBTA red kir, me pirsî gelo danûstendinên di navbera VSD-yan de tev li hevgirtina allosterîk a di navbera malperên girêdanê de ne. Me dît ku hevkarîya girêdana GBTA ji hêla mutasyona muhafezekar a bermayî D112 ve hatî rakirin (Wêne. 3c) di beşa transmembrana S1 de.S1 du bermayiyên din ên barkirî yên neyînî hene, E119 û D123, ku li heman aliyê helîxê wekî D112, lê nêziktirê dawiya derve 24 ya perçeyê ne. Simulasyonên dînamîkên molekulî yên destpêkê destnîşan kirin ku ev bermay bi hev ve girêdayî ne. ji bo D112 bi rêya xetên avê36,37. Ji ber vê yekê, me ceriband ka E119 û D123 di hevgirtina allosterîk de di navbera cîhên girêdana GBTA-yê de têkildar in (Hêjîr. 5b). Wek kontrolek neyînî, me pozîsyona barkirina erênî ya parastî K125, ku li nêzî D123 ye ceriband. lê li aliyê din ê helika S1 (Hêjîrê. 5b).
Me astengkirina-girêdayî konsantasyonê ya kanalên E119A, D123A û K125A ji hêla 2GBI û GBTA ve pîva û dît ku mutasyonên E119A û K125A li gorî celebê çolê (p > 0.05, Xiflteya 5d,i) bi girîngî hevsengiya Hillê ya her du astengkeran neguherand. ). Ji hêla din ve, mutasyona D123A bi girîngî rêjeya Hill ya GBTA kêm kir (p 0.05/14).
Ji ber ku bêbandorkirina barkirinê li pozîsyona 123-an a li ser her du yekîneyan bû sedema guhertinek xurt di hevkarîya girêdana GBTA de, dema ku berevajîkirina barkirinê li ser her du yekîneyan tenê bandorek piçûk bû, me analîzê dirêj kir ku tenê yek yekîneyek bi kanala berevajîkirina barkirinê ve bigire. Dimerên girêdayî Hv1 bi veguheztina D123R di binyekîneya C-termînalê de (Hêjî. 5b) hilberandin û astengkirina berteka-bersiva ji hêla GBTA û 2GBI ve pîva. ji cureya Hv1 ya çolê (p Me her weha dît ku mutasyona D112E zêdekirina hevsera Girê ya GBTA ya ku ji hêla paşxaneya WT-D123R ve hatî hilberandin ji holê rakir (Hêjî. 5b, h û Fig. 4). Wêneyê 5h û Hêjmara Pêvek. 3).Van dîtinan destnîşan dikin ku pevgirêdana alosterîk a pêşkeftî ya di navbera binyekîneyan de ku ji ber barên berevajî li pozîsyona 123 çêdibe, dema ku cîhê girêdanê li pozîsyona D112 xera bibe, wernagere hevkariyek girêdanê ya bihêztir.
Me fikir kir ku heke bermahiyên D123 li ser yekîneyên vekirî yên cîran ew qas nêzik bin ku bi elektrostatîkî bi hevûdu re têkilî daynin, dê pêwendiya rezîlî ya di navbera barên neyînî de bi veguheztina asîda aspartîk bi argînîn ve bibe berhevokek barên neyînî û erênî. danûstendina balkêş a di navbera wan de. Yek bineyekî (WT-D123R dimer). Têkiliyên balkêş dikarin pêwendiya di navbera dawiya perçeya S1-ê de bihêztir bikin, ku bibe sedema girêdana allosterîk a bihêztir di navbera yekîneyan de û zêdebûna hevkariya GBTA-girêdanê.
Ji bo piştgirîkirina vê hîpotezê, me li rêyek geriya ku ji bo bihêzkirina pêwendiya di navbera endên derveyî beşa S1 de, ku ji guheztina barkirinê ya li pozîsyona 123 cuda ye. ji bo encamdana xaç-girêdana spontan a di navbera binbeşekê de17. Wekî din, strukturên krîstal ên Hv1-CiVSP-ya chimerîk VSD destnîşan kir ku I127 ji dawiya derve ya helika S1 tenê bi yek bermayiyek veqetandî ye24. Ji ber vê yekê me pirsî gelo çêbûna girêdanek kovalentî di navbera cysteines li pozîsyona 127, ku tê pêşbînîkirin ku di encama danûstendinek S1-S1 de bihêztir bibe, bandorek li ser hevkarîya girêdana GBTA-yê heye mîna ya ku ji hêla guheztina barkirinê ve li cîhê 123 ve hatî dîtin.
Me astengkirina Hv1 I127C ya girêdayî konsantreyê ji hêla GBTA û 2GBI ve di hebûn û nebûna 10 mM β-mercaptoethanol (βME) de pîva (Hêjî. 6a). Di heman demê de ku înhîbîtor li çareseriya hundurîn tê zêdekirin, kêmkirina ajanek li çareseriya derveyî hucreyê tê zêdekirin. Dimerek girêdayî bi cîsteîn veguhezîne tenê di yek yekîneyek (WT-I127C) de wekî kontrolek neyînî hate bikar anîn (Hêjîr. 6a). di navbera binbeşên I127C de li ser astengkirina 2GBI, ji ber ku hevahenga Hill ji bo girêdana I127C bi Hv1 re, bi an bêyî βME, ji ya girêdana bi dimerên cîgir ên monocysteine re pir cûda bû. Rêjeya Hill nikare WT-I127C ji hev cuda bike (Hêjî. 6b û Xêra Pêvekirî. 3). Berevajî vê yekê, me bandora dramatîk a xaçerêya navbeşûnî ya spontan li ser astengkirina GBTA pîva. Rêjeya Hill ji bo girêdana Hv1 I127C di nebûna βME de (li ser girêdana xaçerê) ji pîvandinê ya di hebûna βME-yê de (ji hev veqetandin) an jî bi karanîna WT-127C ji bo girêdana dimerê (di nebûna girêdana xaçerê de) bi giranî bilindtir bû (Hêjîra 6c û Hêjmara Pêvek. 4), nîşan dide ku hevgirtina allosterîk di navbera cihên girêdanê de bi avakirina girêdanên dîsulfîdê yên di navbera dawiya perçeyên S1 de pir zêde dibe. Van encam şîroveya me piştgirî dikin ku têkiliya elektrostatîk a balkêş a aspartat û argînîn li cîhê 123 di dimera WT-D123R de dibe sedema zêdebûna hevgirtina allosterîk di navbera binerdeyên.
Hevberdana rewşa vekirî bi danûstendinên laşî yên rasterast ên di navbera dûvikên derveyî yên beşa S1 de di her du yekîneyan de tê navbeynkirin.
(a) Nûneratiya şematîkî ya dimerên Hv1 yên mutant û dimerên girêdanê, ku ji bo vekolînê hatîye çêkirin ku vekolîne ka girêdanên cysteine yên navbeş çawa bandorê li hevkarîya girêdana GBTA dikin. e) bi hebûn an tunebûna 10 mM βME di çareseriya derveyî hucreyê de.Her nuqte rawestana navînî ± SD ya 3 heta 10 pîvanan nîşan dide. Kevir bihevhatinek Hill bû ku ji bo bidestxistina nirxên Kd hate bikar anîn (li Tabloya Pêvek 1 binêre). Di histogramên navborî de hevsengiyên çîyayê ji berhevhatinên ku di Hêjmarên Pêvek 3 û 4 de hatine ragihandin hatine destnîşankirin. Stêrkên di (c,e) de cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî nîşan didin. di navbera şert û mercên cuda yên astengkirina GBTA de (p 0.05).
Me her weha dît ku di nebûna βME-yê de, hevsengiya Girê ya GBTA ya ku bi dimera D112E I127C Hv1 ve girêdide ji ya ku di hebûna kêmkerên kêmker de tê pîvandin pir girîngtir bû (Wêne. 6e û Hêjmara Pêvek. 4), tê vê wateyê ku mutasyona D112E zêdebûna hevkariya girêdana GBTA ya ku ji ber girêdana cysteine 127-ê derketiye holê ranekir. Hêza Girê ya 2GBI ya ku bi D112E, I127C Hv1 dimeran ve girêdide jî ji hêla mutasyona D112E ve bi girîngî bandor nebû (Wêne 1).6d û Pêvek Wêne 3).
Bi hev re, van dîtinan destnîşan dikin ku girêdana GBTA ji hêla danûstendina di navbera dawiya perçeyên S1 yên li jêr-yekeyên Hv1 yên cîran de bi navgîniya danûstendinên elektrostatîkî yên balkêş an jî bi avakirina girêdanên kovalentî yên di navbera cysteinên cîgir de ve girêdayî ye. Digel ku bandora danûstendinên elektrostatîk ên balkêş li ser hevkariyê dikare bi mutasyona D112E were rakirin, bandora girêdanên kovalent nikare.
Di lêgerîna me ya cîhê kîmyewî de ku ji bo girêdana derûvên guanidine bi kanalên Hv1 re peyda dibe, me dît ku 2-guanidinothiazoles mîna GBTA ji 2-guanidinobenzimidazoles (Wêne. 1c) ve girêdayî ye. û kanalên monomerîk (Hêl. 2a,b) û kanala dimerîk a ku tê de yek bineyekî berê bi înhîbîtorê ve girêdayî bû (Hêjîrê. 4) me hişt ku em bigihîjin encamê ku astengkirina Hv1 ji hêla GBTA ve Kiryar pêvajoyek hevrêzî ye, û cihên girêdanê yên pêkhateyên di her du yekîneyan de bi alosterîkî ve girêdayî ne. Vedîtina ku GBTA bi kanala vekirî ve girêdide, wekî ku berê ji bo pêkhateya têkildar 2GBI32 hatî destnîşan kirin, destnîşan dike ku hevgirtina allosterîk bi taybetî di rewşa vekirî de dikare were nirxandin. Modela girêdana me ya hevkar karîbû bi qastî astengkirina Hv1 ji hêla GBTA ve (Hêjî. 2c) vebêje û bandorên cihêreng ên 2GBI û GBTA li ser hilweşîna herikên dûvikê kanalê piştî repolarîzasyona membranê rave bike, ku şîroveya me ya pêvajoya girêdanê piştgirî dike.
Rêjeya herî zêde ya Hill ku dikare di proteînek allosterîk de bi du deverên girêdanê (wek Hv1) were bidestxistin 2 ye. Me GBTA pîva kir ku tîpa çolê ya Hv1 bi rêjeya 1.31 ve girêbide, ku di Hv1 I127C de derket 1.88. enerjiya azad a sînerjîstîk, ferqa di navbera enerjiyên azad ên girêdanê yên cihên pêwendiya herî nizm û herî bilind de (li Rêbaz binêre), di rewşa Hv1-type çolê de 1,3 kcal/mole û di rewşa Hv1 I127C de 2,7 kcal/mole bû. oksîjena ji hemoglobînê re mînaka herî navdar û baş-lêkolînkirî ya pêvajoya hevkariyê ye38. Ji bo hemoglobîna mirovî (tetramerek bi çar cihên girêdanê yên bi allosterîkî ve girêdayî ye), rêjeya Hill di navbera 2,5-3,0 de ye, bi nirxên 1,26 heta 3,64 kcal/mol, li gorî şert û mercên ceribandinê ve girêdayî ye38. Ji ber vê yekê, di warê enerjiya gerdûnî de, hevkariya GBTA ya ku bi Hv1 ve girêdide ji ya O2 ya bi hemoglobînê ve girêdide bi giranî ne cûda ye dema ku hejmarên cûda yên binbeşên proteîn ên di her du pergalan de têne hesibandin.
Di modela meya sînerjiyê de, girêdana molekulên GBTA bi yek yekîneyekê re dibe sedema zêdebûna girêdana girêdana yekîneya cîran. Em pêvajoyek ku tê de ji nû vesazkirina hawîrdora girêdanê ya ku ji bûyera yekem a girêdanê pêk tê (hevhatina îndusîkirî) dibe sedema guhertinên di danûstendinên di navbera yekîneyan de. Di bersivdayîna van guhertinan de, binbeşên cîran cîhên girêdana xwe diguherînin, di encamê de girêdana GBTA-yê hişktir dibe. Di vê pêvajoyê de, S1 aspartate D112 berpirsiyar e ji nû vesazkirina cîhê girêdanê ku bi zêdebûna girêdana girêdanê ve girêdayî ye.D112 berê hate destnîşan kirin ku ew beşek ji rêça derbasbûna protonê Hv1 ye û wekî fîltera hilbijartî tevdigere27,28. Encamên me destnîşan dikin ku parzûnên hilbijartî yên di her du yekîneyên Hv1 de bi rengekî alosterîkî di rewşek vekirî de têne hev kirin. Figure 7a cîhê nêzîkê cîhê girêdana GBTA û cîhê bermayiyên D112, D123, K125 û I127 li ser nexşeyek Hv1 VSD nîşan dide. li ser avahiya krîstal a kimera Hv1-CiVSP. Rêwerzên pêşniyarkirî yên ji bo hevgirêdana allosterîk ku dawiya derveyî hucreyê ya S1 vedihewîne bi tîrên reş têne xuyang kirin.
(a) Skematîka Hv1 VSD. Li ser bingeha avahiya krîstal a çîmera Hv1-CiVSP, beşên helîkî bi şilî têne xuyang kirin. Di vê veavakirinê de, dawiya hundurê beşa S4 bi CCD re dibe yek (ne xuyangkirî). Cihên pêşbînîkirî yên GBTA-yê yên girêdayî wekî ovalên gewr têne xuyang kirin. Tîrên reş rêyên ku tev li hevgirtina alosterîk a di navbera cîhên girêdanê de di du yekîneyên cîran de ne. Cihên bermahiyên S1 yên lêkolînkirî bi qalên rengîn têne nîşankirin. di du veavakirinên dimer ên cihêreng ên ku ji aliyê derveyî şaneyê ya balafira perdeyê ve têne dîtin. Li ser panela çepê, navbera dimerê ji hêla helîka S4 ve hatî çêkirin. Zivirîna her du VSD-yan 20 dereceyan li gorî demjimêrê li dora axek perpendîkular li balafira perdeyê, bi pê re veqetandina dawînên derve yên her du helikên S4 (tîrên şikestî), lihevhatina ku li milê rastê tê xuyang kirin çêdike. Di vê veavakirinê de, bermayiyên D123 û I127 ji yekeyên cîran têne destûr kirin ku nêzî hev bibin. (c) Nûnertiya şematîkî ya CiVSP VSD di veavakirina dimer de ku di avahiya krîstal a 4G80 de tê dîtin. Position P140 di CiVSP de bi pozîsyona D123 ya Hv1 re têkildar e.
Encamên me destnîşan dikin ku danûstendina elektrostatîk a berteng a di navbera bermayiya 123 (123D/123D an 123R/123R) de bi astek "normal" a hevkarîya girêdana GBTA-yê di rewşa vekirî de têkildar e û pêwendiyê ji paşvekişandinê vediguhezîne Balkêş (123D/123R) , hevkarî zêde bûye (Hêjîrê. 5g). Tê çaverêkirin ku rakirina pêwendiya rijandinê ya bi cîgirkirina alanînê re jî bibe sedema zêdebûna hevkariyê. Lêbelê, kêmbûna hevkariyê ya dimera 123A/123A hate dîtin (Hêjî. 5e). Yek gengaz ravekirin ev e ku bandora bêîstîqrar a danîna bermahiyên hîdrofobîk li hawîrdorek hîdrofîlîk dibe ku ji bandora stabîlîzker zêdetir be ji ber rakirina danûstendinên nerazî yên di navbera bermayiyên D123 de, û di encamê de kêmbûna tevheviya hevkarîya girêdanê pêk tîne. pozîsyona D171 ya Ciona gutis Ci-Hv1 (di nav Hv1 mirovî de bi D123 re têkildar e) bi aktîvkirinê zêde dibe, piştgirî dide têgîna ku D123 di rewşek vekirî de di hawîrdorek hîdrofîlîk de ye.
Tê zanîn ku girtina kanalên Hv1 bi gelek veguherînan pêk tê. , li dûv veguheztinek cihêreng ku dibe sedem ku proton di rêça her du binbekan de rêgirtinê vekin. Guherîna konformasyonel a sensora voltajê ji hêla fluorescence voltage-clamp ve hate şopandin, û hate dîtin ku veguheztina duyemîn bi bijartî ji hêla mutasyona li cîhê D171 ve hatî xera kirin. Tevliheviya sînyala fluorescentê bi hebûna danûstendinên elektrostatîk ên di navbera bermahiyên D171 yên yekeyên cîran de li hin xalan li ser koordînatên reaksiyonê yên guherîna konformasyonê re hevaheng e. û navbeynkariya allosterîk di navbera malperên girêdana GBTA de dike.
Fujiwara et al25 pêşnîyar kir ku navbera dimerê ya domîneya çîtoplazmîkî ya kilîtkirî ya sîtoplazmîkî di nav membranê de dirêj dibe ku du helîkên S4 dihewîne (Wêne. 7b, panela çepê). Tevahiya VSD û analîza fonksiyonel a herêma ku helika S4 û CCD bi hev ve girêdide. Di nebûna gradientek pH a transmembrane de, ji bo vekirina kanalên Hv1 hewceyê depolarîzasyona membranê ya berbiçav heye, û di bin şert û mercên ku kanal bi giranî girtî ye de girêdana cysteine pêk tê. Ji ber vê yekê, navbeynkariya S4-S4 ya ku hatiye tespîtkirin îhtîmal e ku veavakirina yekîneya derveyî-dewletê nîşan bide. Lêkolînên din delîl ji bo tevlêbûna S1 û S2 di danûstendinên navbeşengan de di dema dergehê 17,21,26 de dîtine ku pêşniyar dikin ku kanal dikarin veavakirinên yekîneyek cûda li vekirî û dewletên girtî, ramanek bi vedîtinên Mony et al. S1 di dema dergehê de 39 dimeşe.
Li vir, em destnîşan dikin ku, di rewşek vekirî de, dawiya derveyî hucreyê ya helika S1 têra xwe nêzik in ku piştgirî bidin danûstendinên elektrostatîk ên rasterast ên ku navbeynkariya hevgirtina allosterîk di navbera yekîneyan de dike. ji hev cuda ku rasterast bi hev re têkilî daynin.Lêbelê, zivirîna 20° li milê demjimêrê ya du yekîneyên VSD li dora axek ku li ser balafira membranê ye, digel veqetandina dawiya derên her du helîkên S4, vesazkirinek S1-S1 peyda kir. bi dîtinên me re (Hêjî. 7b, panela rastê).Em vê veavakirinê ji bo kanala di rewşa vekirî de pêşniyar dikin.
Her çend tê fikirîn ku enzîma CiVSP wekî monomerek kar dike jî, avahiya krîstal a VSD-ya wê ya veqetandî di rewşek dimer de tê girtin. Dawiyên derve yên helîkên S1 di vê dimerê de ji hêla fezayî ve nêzê hev in, û veavakirina giştî dişibihe ya ku tê pêşniyar kirin. ji bo Hv1 (Hêl. 7c). Di dimera CiVSP de, bermahîya herî nêzîk ji binyekîneya cîran li pozîsyona 140 proline bû (Hêjî. 7c). Balkêş e ku P140 di CiVSP de bi pozîsyona D123 ya Hv1 re têkildar e. Wekhevî di veavakirina binyekîneyê de di navbera Hv1 de. û dimersên CiVSP destnîşan dikin ku VSD-yên van proteînan xwedan meylek xwedan e ku têkiliyek çêbike ku li wir dawiya derveyî hucreyî ya S1 bi hev re têkildar dibe.
Rola bingehîn a Hv1 di aktîvkirina hucreya spermê de vê kanalê dike hedefek dermanê balkêş ji bo kontrolkirina zayiniya mêr. Wekî din, aktîvkirina Hv1 di mîkroglia de hate destnîşan kirin ku başbûna ji stroke iskemîk xirabtir dike. Hat dîtin ku çalakiya Hv1 ya pêşkeftî bi kêmtir re têkildar e. saxbûna di nexweşên pêsîrê 12 an jî penceşêra kolorektal 13 de û tê fikirîn ku beşdarî nexweşiyên xirab ên hucreya B 11 dibe. Ji ber vê yekê, dermanên molekulên piçûk ên ku Hv1 dikin armanc, dikarin wekî dermanên neuroprotektîv an dermanên antîpenceşêrê werin bikar anîn. Vedîtina ku derûvên guanidinothiazole dikarin paşiya konformasyonê derxînin. yekîneya Hv1 vekirî, ku dibe sedema zêdebûna girêdana girêdanê, dibe ku bibe sedema pêşvebirina dermanên bihêztir ên ku kanalên Hv1 dikin hedef.
Mutagenesis-derhêneriya Hv1 ya mirovî bi karanîna teknîkên PCR-ya standard hate kirin. Di avakirina Hv1NCCiVSP de, bermayiyên 1-96 û 228-273 yên Hv1 bi bermayiyên 1-113 û 240-576 yên CiVSP18 ve hatin guhertin. C-termînala yek yekîneyê bi girêdana GGSGGGSGGSGSGGSGG ve bi N-termînala binyekeya duyemîn ve girêdayî ye. Plazmîdên pGEMHE yên ku avahîyên cihêreng dihewîne bi enzîmên sînordarkirinê yên Nhe1 an jî Sph1 (New England Biolabs) hatine rêz kirin û bi ARNyê sentez pêk hat. T7 mMessage kit transkripsiyona mMachine (Ambion). 1-3 roj beriya pîvandinên elektrofîzyolojîk, cRNA li oocytên Xenopus (50 nl serê şaneyê, 0,3-1,5 μg/μl) hate derzîkirin. Ji Xenopus laevis (NASCO) oocytên qonaxa V û VI hatin wergirtin. ji Ecocyte Bioscience.Piştî derzîlêdana RNA, şaneyên di navgîna ND96 de ku tê de 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml8 hene, hatin parastin. .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole[2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- 5-karboksîlate [9] û (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetate [10] ji Sigma-Aldrich bûn. Famotidine [7] ji MP Biomedicals bû.1-[4 -(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] û 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-Tiazol-2-yl]guanidine [12] bû. ji Matrix Scientific. Ev pêkhate ji paqijiya herî bilind a bazirganî ne. Ew di DMSO ya hişk de hatin hilweşandin da ku çareseriyek stok a 100 mM were hilberandin, ku dûv re di çareseriya tomarkirinê de li konsantasyona dawîn a xwestî hate rijandin. Pêkhateyên 3 û 4 li jêr bi herî kêm 99% paqijî.
Li suspensionek ji 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hîdrochloride (1,02 g, 4,5 mmol) di 25 mL asîda hîdrochloric avî (2,5 N) de dicyandiamide zexm (380 mg, 4,5 mmol) hat zêdekirin, û tevliheviya heterojen a ku derket holê. 4 saetan bi tevlêdana xurt vegerandin. Tevra reaksiyonê heta germahiya odeyê hate sarkirin û bi lêzêdekirina gav bi gav hîdroksîd potassium 10N bêbandor kirin. Barkirina spî ya ku hatî çêkirin hate parzûn kirin, bi ava sar (3 × 50 ml) hate şûştin, di firinê de hate hişk kirin. 65 °C) çend demjimêran, û dûv re ji etil acetate/petroleum ether ji nû ve krîstalîze kirin da ku hişkek spî bide (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (ronahî 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (s pir berfireh, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114,2 (d, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Hz), 126,1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.HRMS (ESI): m/z nirxa hesapkirî.Ji bo C9H8F3N4S (M + H)+: 416, hat dîtin. : 261.0419.
Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), ku wek berê hatî diyarkirin hatiye sentezkirin, di hemamek rûn de di lûleya ceribandinê ya piçûk de heya 200 °C hate germ kirin.300 mg (zêdebûna mezin) siyanamîd û 1,0 ml konk. Bi lez û bez asîda hîdrochlorîk hat zêdekirin û tevlihev bi qasî 2 hûrdeman di hemama rûn de hate ragirtin, di wî demî de piraniya avê hildiweşiya. Dûv re tevliheviya reaksiyonê li germahiya odeyê hate sar kirin û di encamê de materyalê hişk bû. bû perçeyên piçûk û bi avê hat şûştin da ku zerikek amorf a zer û reng zer peyda bike. (38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 Hz , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d , 1 H, J = 8,3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z1 nirxa hesapkirî (ESI): m/z1 nirxa hesapkirî (ESI) 42MH49. , dîtin: 243.0704.
Herikîna protonê di hêlînên hundurîn û derveyî yên oocytes de ku avahîyên cihêreng vedibêjin bi karanîna amplifikatorek Axopatch 200B ku ji hêla Axon Digidata 1440A (Alavên Molekular) ve bi nermalava pClamp10 ve tê kontrol kirin, hate pîvandin. Çareseriyên hundurîn û derveyî hucreyê xwedî heman pêkhate ne: 100-(N-morpholi2). ) asîda etanîsulfonîk (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM TEA klorîd, 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), hatî verast kirin pH 6.0 bi hîdroksîdê TEA. Hemî pîvandin di 22 ± 2 °C de hatin kirin. Pîpeta xwedan berxwedana gihîştinê 1.5-4 MΩ ye. Şopên heyî li 1 kHz hatin parzûn kirin, li 5 kHz nimûne hatin girtin û bi Clampfit10.2 (Alavên Molekulerî) hatin analîz kirin. ) û Origin8.1 (OriginLab).
Çareseriyên ku di nav xwe de hûrgelên cihêreng ên înhîbîtorê Hv1 û di hin rewşan de 10 mM βME-yê bi gravîtasyonê ve bi navgînek ku bi pergala valahiya perfusionê ya VC-6 ve girêdayî ye (Warner Instr.), ku di nav nermalava pClamp TTL (Transistor- de) ve hatî derbas kirin, ketin serşokê. Nîşaneyên Mantiqa Transîstorê. Ceribandinên perfuzyonê yên bilez bi karanîna pênûsa perfusionê ya pir-lûle (AutoMate Sci.) bi tîpek radestkirinê ya 360 μm ku li ber pîpetek paçê hatî danîn, hatin kirin. Astengkirina kanalê bi pîvanên amperometrîkî yên îsokronî yên di dawiya lûleyê de hate destnîşankirin. +120 mV nebza depolarîzasyonê. Pîvandinên GV wekî ku berê hatî destnîşan kirin hatin kirin18,20. Herikên dûvikê piştî gavên depolarîzasyonê di voltaja cûda de ji -20 mV heya +120 mV di -40 mV de hatin tomar kirin heya ku tiştek din neyê gotin. Pîvana referansê ya pêşî ya ceribandinê ye. ji bo rastkirina rizîbûna heyî tê bikaranîn 18 .Grafika GV bi hevkêşana Boltzmann re digunce:
Hêmanên veqetandinê yên xuya (Kd) ji bo hevbendiyên cihêreng ên kanal û înhîbîtoran (Tabloya Pêvek 1) bi guncankirina girêdayiya konsantrebûnê ya astengkirinê (navgîniya %nirxên înhib) bi hevkêşeya Hill re hatine destnîşankirin:
li wir [I] kombûna înhîbîtor I ye û h jî koeficienta Hill e. Ji bo hesabkirina hevbera Hill, hevkêşana (2) ji nû ve tê rêzkirin:
Dema şandinê: Jun-07-2022
