Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت. سىز ئىشلىتىۋاتقان توركۆرگۈچ نۇسخىسىنىڭ CSS نى چەكلىك قوللىشى بار. ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن ، يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىش ھالىتىنى ئېتىۋېتىڭ). بۇ جەرياندا كاپالەتلىك قىلىڭ. داۋاملىق قوللاش ، ئۇسلۇب ۋە JavaScript بولمىغان تور بېكەتنى كۆرسىتىمىز.
Hv1 توك بېسىمى شەكىللىك پروتون قانىلى ئىككى خىل بېسىملىق سېزىمچان دائىرە (VSDs) دىن تەركىب تاپقان ۋاقىت سىزىقى مۇرەككەپ بولۇپ ، ھەر بىرىدە دەرۋازا پروتوننىڭ ئۆتۈشۈش يولى بار. ۋاقىت سىزىش سىپوپلازما شەكىللىك كاتەكچە تور دائىرىسى تەرىپىدىن كونترول قىلىنىدۇ. يېپىق ھالەتتىكى ھالەتكە ئۆتۈش. ھەر ئىككى VSD دىكى ئوچۇق ھالەتنىڭ ھەمكارلاشقانلىقى مەلۇم. قانداقلا بولمىسۇن ، ئاساسىي مېخانىزملار ھەققىدە ئاز بىر قىسىم ئۇچۇرلار بار. قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ خىل كۆرۈنمە يۈزى ئوچۇق Hv1 قانىلىدا ئېنىقلانمىدى. بۇ يەردە بىز 2-گانىدىنوتىئازول تۇغۇندىسىنىڭ ھەمكارلىق شەكلىدە ئىككى Hv1 VSD نى توسىدىغانلىقىنى ۋە بۇ بىرىكمىلەرنىڭ بىرىنى ئوچۇق تارماق تارماقلارنىڭ ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇشىنى تەكشۈرۈش ئورنىدا ئىشلىتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز. VSD نىڭ تۇنجى تارقىلىشچان بۆلەكنىڭ ئاخىرى ئۆز-ئارا ئۇلىنىش كۆرۈنۈشىنى شەكىللەندۈرىدۇ ، ئۇ باغلىنىشلىق تور بېكەتلەر ئارا باغلىنىشنى ۋاسىتە قىلىدۇ ، ئەمما كاتەكچە كاتەكچە تور دائىرىسى بۇ جەريانغا بىۋاسىتە قاتناشمايدۇ. .
توك بېسىمى بار پروتون قاناللىرى فىتپلانكتوندىن ئىنسانلارغىچە بولغان ھەر خىل جانلىقلاردا مۇھىم رول ئوينايدۇ. كۆپىنچە ھۈجەيرىلەردە ، بۇ قاناللار پروتون پەردىسىدىن پروتون ئېقىمىنى ۋاسىتە قىلىپ ، NADPH ئوكسىد ئوكسىدنىڭ پائالىيىتىنى تەڭشەيدۇ. Hv1 بولۇپ ، HVCN1 گېنىنىڭ مەھسۇلاتى 2،3. ھەرىكەتچانلىقى 9 ۋە pH نەپەس يولى سۇيۇقلۇقىنى تەڭشەش. بۇ قانال B ھۈجەيرىسىنىڭ يامان سۈپەتلىك ئۆسمىسى 4،11 ۋە سۈت بېزى ۋە بوغماق ئۈچەي راكىغا ئوخشاش بىر نەچچە ھەددىدىن زىيادە بېسىمغا چېتىشلىق 12،13. مىكرو ئورگانىزم ئارقىلىق ، ئۇنىڭ پائالىيىتى قان يېتىشمەسلىكتىن بولغان سەكتە مودېللىرىدىكى مېڭىنىڭ بۇزۇلۇشىنى ئېغىرلاشتۇرۇۋېتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى.
Hv1 ئاقسىلى ئېلېكتر بېسىمىنى سېزىش دائىرىسى (VSD) نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ئۇ S1 دىن S414 دەپ ئاتىلىدىغان تۆت تارقىلىشچان بۆلەكتىن تەركىب تاپقان. Ciona gutis15. بۇ باشقا ئاقسىللاردا ، S4 نىڭ C تېرمىنالى ئېففېكت مودۇلى ، تۆشۈكچىلەر دائىرىسى ياكى ئېنزىمغا ئۇلىنىدۇ. Hv1 دە ، S4 پەردىنىڭ سىپوپلازما تەرىپىگە جايلاشقان كاتەكچە كاتەكچە (CCD) بىلەن ئۇلىنىدۇ. .بۇ قانال ئىككى خىل VSD دىن تەركىب تاپقان ۋاقىت سىزىقى مۇرەككەپ بولۇپ ، ھەر بىرىدە دەرۋازا پروتوننىڭ ئۆتۈشۈش يولى بار 16،17،18،18. كىرىش ئېغىزىدىكى موھىم رول. بىرىكمە كاتەكچە دائىرە ئىچىدىكى تارماق بۆلەكلەرنىڭ كۆرۈنمە يۈزى ئېنىق بېكىتىلگەن ، چۈنكى ئىككى يەككە ساھەنىڭ خرۇستال قۇرۇلمىسى 22،23. يەنە بىر تەرەپتىن ، پەردە ئىچىدىكى VSDs نىڭ كۆرۈنمە يۈزى يوق. ياخشى چۈشىنىلىدۇ. Hv1-CiVSP خېرمېرلىق ئاقسىلنىڭ خرۇستال قۇرۇلمىسى بۇ كۆرۈنمە يۈزى ھەققىدە ئۇچۇر بىلەن تەمىنلىمەيدۇ ، چۈنكى كىرىستاللاشتۇرۇلغان قانال گۇرۇپپىسىنىڭ ۋاقىتلىق تەشكىللىنىشى يەرلىك Hv1 CCD نىڭ ئېچىتقۇ ئاقسىلى GCN424 نىڭ ئورنىنى ئېلىشى مۇمكىن.
يېقىندا Hv1 قانىلىنىڭ تارماق تەشكىللەش تەتقىقاتىدا مۇنداق يەكۈن چىقىرىلدى: ئىككى S4 خىلىتسى ئىككىلەمچى قۇرۇلمىغا ئېغىر دەخلى يەتكۈزمەي CCD غا ئۆتىدۇ ، نەتىجىدە پەردە ۋە تۈردىن سىپوپلازماغا باشلىنىدىغان ئۇزۇن خىلىتلار پەيدا بولىدۇ. بۇ تەتقىقات Hv1 VSDs نىڭ S4 بۆلىكىدە ئۆز-ئارا ئالاقىلىشىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدى. قانداقلا بولمىسۇن ، باشقا تەتقىقاتلار VSD لار ئارىسىدا ئۆز-ئارا ئالماشتۇرۇشنى ئوتتۇرىغا قويدى. بۇ كۆرۈنۈشلەر S1 بۆلەكلىرىنىڭ 17 ، 21 ، 26 ۋە S2 بۆلىكىنىڭ سىرتقى ئۇچىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. بۇ تەتقىقاتلارنىڭ نەتىجىسى شۇكى ، VSD لار ئارىسىدىكى ئاللوستېرلىق جىپسىلىشىش يېپىق ۋە ئوچۇق ھالەتكە باغلىق بولغان دەرۋازا جەريانىغا قارىتا تەكشۈرۈلگەن بولۇپ ، VSDs نىڭ كۆرۈنمە يۈزى ئوخشىمىغان دۆلەت ئۆزگىرىشىدە ئوخشىماسلىقى مۇمكىن.
بۇ يەردە ، 2-guanidinothiazole نىڭ Hv1 قانىلىنى ئىككى خىل ئوچۇق VSD نى بىرىكتۈرۈش ئارقىلىق چەكلەپ ، ئوچۇق ھالەتتىكى تارماق ئورۇنلارنىڭ ئۆز-ئارا تەسىرنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن بىرىكمە بىرىكمە 2-گانىدىنوبېنزوتىيازول (GBTA) نى ئىشلىتىپ ، Hv1 قانىلىنى تورمۇزلايدىغانلىقىنى بايقىدۇق. كۆرۈنمە يۈزى. بىز GBTA باغلاش ئەگرى سىزىقىنى مىقدارلاشتۇرۇپ مودېل ئارقىلىق ياخشى تەسۋىرلەپ بېرەلەيدىغانلىقىنى بايقىدۇق ، بۇنىڭدا چەكلىگۈچنىڭ بىر تارماق تورغا باغلىنىشى قوشنا تارماق تارماقنىڭ باغلىنىشچانلىقىنى ئاشۇرىدۇ. بىز يەنە D112 نىڭ قالدۇقلىرىنى ، تاللاش سۈزگۈچنى بايقىدۇق. قانال 27 ، 28 ۋە بىر قىسىم گانىدىن ھاسىل بولغان باغلاش تور بېكىتى 29 GBTA باغلاش ھەمكارلىقنى كونترول قىلىدۇ. بىز Hv1 ئۆلچىمىدە ھەمكارلىق باغلىنىشىنىڭ ساقلانغانلىقىنى كۆرسىتىمىز ، بۇ يەردە CCD S4 بۆلىكىدىن ئايرىلىدۇ ، بۇ CCD دىكى ئۆز-ئارا ئۇلىنىش كۆرۈنمە يۈزىنىڭ بىۋاسىتە ئەمەسلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. GBTA باغلاش تور بېكەتلىرى ئارا ئارىلاشما جىپسىلاشتۇرۇشنى ۋاسىتە قىلىڭ. بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، بىز S1 پارچىسىنىڭ تارماق بۆلەكلەر ئارا كۆرۈنمە يۈزىنىڭ بىر قىسمى ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق ھەمدە يانداش VSD لارنى S4 helix نىڭ تاشقى ھۈجەيرە ئۇچى بىلەن ۋاقىت سىزىقىنىڭ مەركىزىدىن يىراقلاشتۇرۇپ ئورۇنلاشتۇرۇشنى ئوتتۇرىغا قويدۇق. S1 پارچىسى ئوچۇق ھالەتتە.
Hv1 نىڭ كىچىك مولېكۇلا چەكلىگۈچىسى باكتېرىيەگە قارشى تۇرغۇچى دورا ۋە نېرۋا ئاجىزلاش دورىسى سۈپىتىدە پايدىلىق. قانداقلا بولمىسۇن ، بۈگۈنگە قەدەر ، ئاز ساندىكى بىرىكمىلەر قانالنى 30،31،32،3،3 نى تورمۇزلىيالايدۇ. . ئىلگىرى 200 mMM قويۇقلۇقىدا سىناق قىلىنغاندا Hv1 نى 2GBI غا ئوخشاش ئۈنۈملۈك چەكلەيدىغانلىقى كۆرسىتىلدى (1b رەسىم) .بىز باشقا تىيازول تۇخۇمىنى تەكشۈردۇق ۋە ئۇلارنىڭ بەزىلىرىنىڭ GBTA غا ئوخشاش ياكى كۈچلۈكرەك بولغان قانالنى چەكلىگەنلىكىنى بايقىدۇق (1-رەسىم ۋە قوشۇمچە) تېكىست) .بىز تۆت تىيازول تۇغۇندىسىنىڭ قويۇقلۇقى ئىنكاس ئەگرى سىزىقىنى بېكىتتۇق (GBTA ۋە بىرىكمىلەر [3] ، [6] ۋە [11] ، 1c رەسىم) ۋە ئۇلارنىڭ 2GBI غا قارىغاندا تېخىمۇ تىك ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق. تاغ كوئېففىتسېنتى (h) تىيازول تۇخۇمىنىڭ 1.109 ± 0.040 دىن 1.306 ± 0.033 ئارىلىقىدا (رەسىم). 1c ۋە قوشۇمچە رەسىم 1). بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، 2GBI نىڭ Hill كوئېففىتسېنتى 0.975 ± 0.024 29 ، 2a رەسىم ۋە قوشۇمچە 1-رەسىم). 1 دىن يۇقىرى بولغان تاغ كوئېففىتسېنتى باغلىنىشچان ھەمكارلىقنى كۆرسىتىدۇ. باغلىنىشلىق تور بېكەت ، 29،32 بىز تىيازول تۇخۇمىنىڭ بىر تارماق گەۋدىسىگە باغلىنىشى ئىككىنچى ئىنگىبىتور مولېكۇلاسىنىڭ قوشنا تارماق تورغا باغلىنىشىنى كۈچەيتەلەيدۇ دەپ ئويلىدۇق. GBTA ئەڭ يۇقىرى Hill كوئېففىتسېنتى بولغان سىناق بىرىكمىسى ئىدى. بىرىكمە بىرىكتۈرۈش مېخانىزمىنى يەنىمۇ ئىلگىرىلەپ تەتقىق قىلىپ ، 2GBI نى پايدىسىز مەنپىي كونترول قىلىپ ئىشلەتكەن.
(1) سىناق بىرىكمىلىرى: 2-گانىدىنو-بېنزوتىئازول (GBTA) ، [3] (5 -guanidine, [5] (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) گانىدىن ، [6] فاموتىندىن ، ]. 12] 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3-thiazol-2-yl] گۈەندىن. .Hv1 پروتون ئېقىمى Xenopus تۇخۇم ھۈجەيرىسىنىڭ ئىچى تاختىسىدا ئۆلچەنگەن بولۇپ ، ساقلاش يوشۇرۇن كۈچىدىن -80 mV دىن +120 mV غىچە بولغان. .Data بولسا ± SEM (n≥4). 15 ئۆلچەم. بۇ سىزىق قوشۇمچە جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەن ئېنىق Kd قىممىتىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان Hill ماس كېلىدىغان 1-رەسىم: H (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033 ، h (3) = 1.25 ± 0.07 ، h (6) = 1.109 ± 0.040 ، h (11) = 1.179 ± 0.036 (ئۇسۇللارغا قاراڭ).
(a) b قىستۇرما گىستوگرامما قوشۇمچە 3-ۋە 4-رەسىملەردە كۆرسىتىلگەن ماس ھالقىلاردىن بېكىتىلدى. (A) دا كۆرسىتىلگەن GBTA نىڭ قويۇقلۇقى ئىنكاسى 1-رەسىمدىكى بىلەن ئوخشاش. ئېنىق Kd قىممىتى ئۈچۈن قوشۇمچە جەدۋەلنى كۆرۈڭ. (c) مودېل GBTA نىڭ ئۆلچەملىك Hv1 بىلەن ھەمكارلىق باغلىنىشى. قاتتىق قارا سىزىق (6) تەڭلىمىسى ئارقىلىق تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرىغا ماس كېلىدۇ ، بۇ (d) دا كۆرسىتىلگەن باغلىنىش ئەندىزىسىنى تەسۋىرلەيدۇ. بىرىنچى ۋە ئىككىنچى باغلىنىش ھادىسىسىنىڭ ئايرىلىش تەڭپۇڭلۇقى ئەگرى سىزىقى (Sub 1: OO + B ⇄ BO *, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO * + B ⇄ B * O *, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ). كۆكنىڭ يۇقىرى يېقىنلىق ھالىتىدىكى كۆك. GBTA نىڭ مونومېرلىق Hv1 بىلەن باغلىنىشى ئۈچۈن ، رېئاكسىيەنىڭ ئايرىلىش تۇراقلىقى: O ° + B ⇄ B ° Kd1 بىلەن Kd2 ئارىلىقىدا ، ئەمما كېيىنكىسىگە يېقىنراق (كۈلرەڭ كۆك سىزىقلار ئوتتۇراھال يېقىنلىقنى كۆرسىتىدۇ).
Hv1 قانىلى ئۇلارنىڭ N ۋە C تېرمىنالىدىكى سىپوپلازما دائىرىسىنى Ciona ئۈچەي يولى بېسىمى سەزگۈر فوسفاتازا CiVSP (Hv1NCCiVSP) نىڭ ماس بۆلەكلىرى بىلەن ئالماشتۇرۇش ئارقىلىق مونوپوللاشتۇرغىلى بولىدۇ. ئۇلارنى ئۆلچەملىك قانال (ياۋا تىپتىكى) چەكلەش بىلەن سېلىشتۇردى (2a رەسىم ، b) باشقا تور بېكەتنىڭ تورمۇزلىغۇچىغا بولغان يېقىنلىقى. بىز GBTA نىڭ بىر Hv1 تارماق لىنىيىسىگە باغلىنىشى باغلىنىشلىق تور بېكەتنىڭ قايتا تەشكىللىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن (fit35 نى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ) ، بۇ قوشنا تارماق ئورۇننىڭ بوش باغلىنىش ئورنىنى قايتىدىن رەتكە تۇرغۇزۇپ ، باغلىنىشنىڭ كۈچىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ دەپ ئويلىدۇق. يېقىنلىق.
GBTA نىڭ قانالغا بولغان ھەمكارلىق باغلىنىشىنى مىقدارلاشتۇرۇپ تەسۋىرلەش ئۈچۈن ، بىز ھەر بىر تارماق بۆلەكنىڭ تۇراقلىق Kd1 بىلەن ئىككى قۇتۇپلۇق رېئاكسىيەدىن كېيىن تۇنجى چەكلىگۈچى مولېكۇلانى باغلىيالايدىغان مودېلنى قوللاندۇق (2c رەسىم ، تارماق 1 ، OO + B ⇆ BO *). باغلاش قانالنىڭ ئايرىلىش تۇراقلىق Kd2 بىلەن ئۆزگىچە ئىككى قۇتۇپلۇق رېئاكسىيەدىن كېيىن قالغان قۇرۇق تارماقلارنىڭ چەكلىگۈچكە باغلىنىدىغان ھالەتنى قوبۇل قىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، بۇ يەردە Kd2
2c رەسىمدىكى قاتتىق قارا سىزىق مودېلنىڭ تەڭلىمىسىنىڭ تەجرىبە قويۇقلۇقى ئىنكاس قايتۇرۇش ئەگرى سىزىقىغا ماس كېلىدىغان بولۇپ ، Kd1 ~ 290 μ mM ۋە Kd2 ~ 29 μ mM (ئۇسۇل بۆلىكى ، تەڭلىمىسى (6)) ھاسىل قىلىدۇ. مودېل يەنە تەسۋىرلەيدۇ 2GBI نىڭ باغلىنىشى ، بۇ يەردە Kd2 ≈ Kd1 = Kd (رەسىم 2d) μM ، بۇ Kd1 بىلەن Kd2 غا تېخىمۇ ئوخشايدۇ (2d رەسىم). مۇنداقچە ئېيتقاندا ، مونومېرنىڭ باغلاش ئورنى تۆۋەن دەرىجىدىكىگە قارىغاندا يۇقىرى يېقىنلىق ھالىتى (BO *) بىلەن تېخىمۇ ئوخشىشىپ كېتىدۇ. دىمېرنىڭ يېقىنلىق ھالىتى (OO) ، كۆپىنچە تارماق تارماقلارنىڭ كۆرۈنمە يۈزىنىڭ يوقىتىلىشىدىن بولۇشى مۇمكىن.
ئىلگىرى 2GBI32 دە كۆرسىتىلگەندەك ، GBTA نىڭ Hv1 ئېقىمىنى ئېچىۋېتىشنى قىيىنلاشتۇرماي ، بەلكى قانالنى ئاچقاندا توسۇش ئارقىلىق باسقانلىقىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە رەسىم 2a ، b ، d). پەردىنىڭ قايتا ھاسىل بولۇشىغا قارىتا ، ئەمما بۇ ھادىسە GBTA دا كۆرۈلمىدى (قوشۇمچە 2-رەسىم). پۇت دەرۋازىسى »مېخانىزىمى) ، ۋە 2GBI دەرۋازىنىڭ يېپىلىشىدىن ئاستا ئاستا باغلىنىدۇ. ئەگەر بىر Hv1 تارماق لىنىيىسى قۇلۇپلانغان ۋە يېپىق بولسا ، ياندىكى تارماق ئورۇن توسۇلۇپ قالسا ، قالغان 2GBI مولېكۇلاسىنىڭ باغلىنىشى ئاستا بولىدۇ (توسۇشنى تۇتۇش). پەقەت بىر توسۇلۇپ قالغان تارماق بۆلەك تاقاشتىن بۇرۇن ۋاقىتلىق ھەرىكەت قىلىدۇ ۋە ئاستا-ئاستا چىرىگەن قۇيرۇق ئېقىمىغا مۇھىم تۆھپە قوشىدۇ.
GBTA (قوشۇمچە رەسىم 2c) نىڭ ئالدىدا Hv1 قۇيرۇق ئېقىمىنىڭ چىرىشىنىڭ كۆرۈنەرلىك ئاستىلىمىغانلىقىنى بايقاش بۇ چەكلىگۈچنىڭ بىرىكمە باغلاش مېخانىزمى بىلەن بىردەك (2d رەسىم). بىر قېتىم GBTA مولېكۇلاسى Hv1 تارماق لىنىيىسى بىلەن باغلانمايدۇ. ، توساقنىڭ قوشنا تارماق لىنىيىگە بولغان يېقىنلىقى تەخمىنەن 10 ھەسسە تۆۋەنلەپ ، باغلىنىش جەريانىنى قوللايدۇ. بۇ GBTA نىڭ ئىككىنچى مولېكۇلاسىنىڭ قانالغا قاپسىلىپ قېلىشتىن بۇرۇن يېشىش پۇرسىتىنىڭ تېخىمۇ يۇقىرى بولىدىغانلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ. ئۇزۇن ئۆمۈر كۆرىدىغان قانال تۈرلىرى مۆلچەرلىنىشىچە ، پەقەت بىرلا توسۇش تارماق لىنىيىسى ئىشلەپ چىقىرىشى ، GBTA نىڭ ئالدىدا 2GBI غا قارىغاندا تېخىمۇ كۆپ بولۇپ ، قۇيرۇق ئېقىمىنىڭ تېزرەك بۇزۇلۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىكەن.
GBTA نىڭ Hv1 تارماق ئەترىتى بىلەن ھەمكارلىشىشى ئۈچۈن ، باغلىنىشلىق تور بېكەتلەر چوقۇم ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇلۇشى كېرەك. ھەر بىر باغلىنىش تور بېكىتى چوقۇم تۆۋەندىكى ئىقتىدارلارنى ھازىرلىشى كېرەك: تۆۋەن تۇغقانلىقتىن يۇقىرى قويۇقلۇق باغلىنىشقا ئۆتۈش. بىز ئويلاشتۇقكى ، ئەگەر باغلىنىش ئورنىدىكى ئالاھىدە قالدۇقلار ھەمكارلىق جەريانىدا تۆھپە قوشسا ، ئۇلارنىڭ ئۆزگىرىشى GBTA نىڭ Hv1 چەكلىمىسىنىڭ قويۇقلۇقى ئىنكاس ئەگرى سىزىقىنىڭ Hill كوئېففىتسېنتىنى ئۆزگەرتىشى كېرەك. D112 ، F150 ، S181 ۋە R211 ئىلگىرى 2GBI29 باغلاش مۇھىتىنىڭ بىر قىسمى ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى ۋە بىز ئۇلارنىڭ ئوخشاشلا GBTA باغلىنىشقا قاتنىشىدىغانلىقىنى پەرەز قىلدۇق (رەسىم 3A) ، ۋە R211S (3-رەسىم) ھەمدە ئۇلارنىڭ Hill كوئېففىتسېنتىنى Hv1 ياۋا تىپى بىلەن سېلىشتۇرۇپ ، 2GBI نى پايدىلىنىش ماتېرىيالى قىلىپ ئىشلەتكەن. قالدۇق V109 S1 بۆلىكىنىڭ D112 بىلەن ئوخشاش يۈزىدە بولۇپ ، ھۈجەيرە ئىچىدە بىر ئارتۇقچە بۇرۇلۇش بار. V109 2GBI29 نى باغلاشقا قاتناشمىدى ، بىز V109A ئۆزگەرتكۈچىنى كونترول قىلىپ ئىشلەتتۇق (رەسىم). 3b).
. قېنىق قىزىل). ھەر بىر نۇقتا 3 دىن 12 گىچە ئۆلچەشنىڭ ئوتتۇرىچە چەكلىنىشىنى كۆرسىتىدۇ ± SD V109 مەنپىي كونترول سۈپىتىدە. ئەگرى سىزىقلار ئېنىق Kd قىممىتىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان Hill fit (قوشۇمچە جەدۋەل 1 گە قاراڭ). قىستۇرما گىستوگرامما قوشۇمچە 3-ۋە 4-رەسىملەردە كۆرسىتىلگەن ئۆلچەمدىن بېكىتىلدى. Hv1 WT نىڭ پايدىلىنىش قىممىتى قىممەت سىزىقچە قىلىپ كۆرسىتىلدى. .
بىز D112E نىڭ ئۆزگىرىشى Hill كوئېففىتسېنتىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەتكەنلىكىنى بايقىدۇق (p GBTA باغلاشنىڭ Hill كوئېففىتسېنتىنىڭ Hv1 ئۆلچىمىدە 1 دىن يۇقىرى بولۇپ ، مونومېرال قانىلىدا ~ 1 گە ئايلىنىدىغانلىقىنى بايقاش (2b رەسىم) بۇ ئىككى تارماق رايوندىكى باغلىنىشلىق تور بېكەتلەر ئارا ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ مەۋجۇتلۇقى بىلەن بىردەك. ئەگەر بۇ بولسا ئەھۋالدىن قارىغاندا ، GBTA نىڭ Hill كوئېففىتسېنتى چەكلىگۈچىنىڭ بىر تارماق لىنىيىگە باغلانغان ۋاقىت چەكلىمىسى بىلەن باغلىنىشى ~ 1. بولۇشى كېرەك. بىز بۇ پەرەزنى Hv1 F150A-WT ئۇلانغان دىمېردا سىناق قىلدۇق (رەسىم 4a) ، F150A نىڭ يېقىنلىقى. GBTA نىڭ تارماق لىنىيىسى چوڭلۇقى WT تارماق لىنىيىسىنىڭكىدىن 2 دىن يۇقىرى (1c ۋە 3d رەسىملەر) دىن يۇقىرى. توسقۇنلۇق قىلغۇچى F150A تارماق لىنىيىسىنىڭ تەخمىنەن% 99 ۋە WT تارماق ئەترىتىنىڭ (a) توسۇلۇش يېرىم شارنى ھاسىل قىلىشتا ئىشلىتىلىدىغان F150A-WT ئۇلىنىش سىزىقىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى ({F150A} b-WT / BAO *). ئاق ئالماس ئۆزگىرىشنىڭ ئورنىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. BAO * ۋە BA * B * شتاتلىرىدا ، مۆلچەرلىنىشىچە ، F150A تارماق ئەترىتىنىڭ يېقىنلىقى WT تارماق ئەترىتىنىڭكىدىن يۇقىرى بولۇشى مۇمكىن. .گرېي ئىزلىرى چەكلىگۈچ يوق ھالەتتە ئۆلچەنگەن توكقا ۋەكىللىك قىلىدۇ. قارا ئىز (كونترول) 2 mMM GBTA قوشۇلغاندىن كېيىن ئۆلچەنگەن توكقا ۋەكىللىك قىلىدۇ. ({F150A} b-WT. F150A تارماق گەۋدىسى) .ھەر بىر نۇقتا 3 دىن 7 گىچە بولغان ئوتتۇرىچە چەكلەشنى كۆرسىتىدۇ. ئەگرى سىزىقلار قوشۇمچە جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەن Kd قىممىتىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن Hill ماسلاشتۇرۇلغان بولۇپ ، قىستۇرما گىستوگراممىدا كۆرسىتىلگەن Hill كوئېففىتسېنتى قوشۇمچە 3-ۋە 4-رەسىملەردە كۆرسىتىلگەن ماس ھالقىلاردىن بېكىتىلگەن. Hv1 WT نىڭ h قىممىتى سىزىقچە قىلىپ كۆرسىتىلىدۇ.
GBTA نىڭ Hv1 نى چەكلىشى ئوچۇق قانالدا ئۆلچەنگەنلىكى ئۈچۈن ، بىز GBTA باغلاش ھەمكارلىقنى ئوچۇق ھالەتتە ئۆز-ئارا جىپسىلاشتۇرۇش مېخانىزىمىنى تەتقىق قىلىشقا ئىشلىتىشكە بولىدۇ دەپ ئويلىدۇق. 22 ۋە دەرۋازىغا چېتىشلىق ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇش جىپسىلاشتۇرۇلغان سىپوپلازما شەكىللىك كاتەكچە تور (CCD) ئارقىلىق مۇرەسسە قىلىش ئوتتۇرىغا قويۇلدى. S4 تارقىلىشچان بۆلەك بىلەن كاتەكچە كاتەكچە دائىرە ئارىسىدىكى كۆرۈنۈشنىڭ ئۆزگىرىشى ئىلگىرىكى تەتقىقاتلاردا ۋاقىت چەكلىمىسىنىڭ مۇكەممەللىكىنى ساقلاش بىلەن بىر ۋاقىتتا ، بۇ تور نامىنى باشقا قانالدىن يېشىش ئۈچۈن كۆرسىتىلدى. شۇڭلاشقا ، بىز V220G ، K221G ۋە T222G ئۆزگىرىشنىڭ تەسىرىنى سىنىدۇق. . 5a ، GGG ئۆزگەرتكۈچى) GBTA باغلاش ھەمكارلىق كوپىراتىپى. ئىككى تارماق تارماق مۇھىم ، ئەمما CCD بىۋاسىتە GBTA باغلاش تور بېكەتلىرى ئارا ئارىلاشما ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇشنى مۇرەسسە قىلمايدۇ.
(1) S4 نىڭ ئىچكى ئۇچىدىكى ترىگلىتسىن ئۆزگىرىشى بىلەن Hv1 دىئامېتىرىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى ، سىپوپلازما شەكىللىك كاتەكچە دائىرە (كۆك ئوق) ئارقىلىق مۇرەسسە قىلىنغان ئۆز-ئارا جىپسىلاشتۇرۇشنى قالايمىقانلاشتۇرۇش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن. كۆرسىتىلگەن ئۆزگىرىشلەر ، تارماق بۆلەكلەر (كۆك ئوق) نىڭ تۇتاشتۇرۇلۇشىغا چېتىشلىق S1 پارچىلىرىنى سىناش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن. 3 دىن 10 گىچە بولغان SD. ئەگرى سىزىق كۆرۈنەرلىك Kd قىممىتىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان Hill ماسلاشتۇرۇلغان (قوشۇمچە جەدۋەل 1 گە قاراڭ). Hv1 WT سىزىقچە سىزىق سۈپىتىدە كۆرسىتىلىدۇ.
بىز CCD نى GBTA ھەمكارلىق باغلاشنىڭ بىۋاسىتە ۋاسىتىچىسى دەپ رەت قىلغانلىقىمىز ئۈچۈن ، VSD لار ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا باغلىنىشنىڭ باغلىنىشلىق تور بېكەتلەر ئارا ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇشقا چېتىشلىق ياكى ئەمەسلىكىنى سورىدۇق. بىز GBTA باغلاش ھەمكارلىق ئورنىنىڭ قالدۇق D112 (3c رەسىم) نىڭ مۇتەئەسسىپ ئۆزگىرىشى بىلەن بىكار قىلىنغانلىقىنى بايقىدۇق. S1 تارقىلىشچان بۆلىكىدە. شۇڭلاشقا ، بىز E119 بىلەن D123 نىڭ GBTA باغلىنىدىغان تور بېكەتلەر ئارىسىدىكى ئاللوستېرلىق تۇتاشتۇرۇشقا قاتناشقان-قاتناشمىغانلىقىنى سىنىدۇق (5b رەسىم). سەلبىي كونترول بولۇش سۈپىتىمىز بىلەن ، بىز D123 نىڭ يېنىغا جايلاشقان ساقلانغان مۇسبەت زەرەتلەنگەن ئورۇن K125 نى سىنىدۇق. ئەمما S1 helix نىڭ يەنە بىر تەرىپىدە (5b رەسىم).
بىز 2GBI ۋە GBTA ئارقىلىق E119A ، D123A ۋە K125A قاناللىرىنىڭ قويۇقلۇقىغا باغلىق چەكلەشنى ئۆلچەپ ، E119A ۋە K125A نىڭ ئۆزگىرىشى ياۋا تىپقا سېلىشتۇرغاندا ھەر ئىككى چەكلىگۈچنىڭ Hill كوئېففىتسېنتىنى كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتەلمىگەنلىكىنى بايقىدۇق (p> 0.05 ، رەسىم 5d ، i) ). يەنە بىر جەھەتتىن ، D123A نىڭ ئۆزگىرىشى GBTA نىڭ Hill كوئېففىتسېنتىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەتتى (p 0.05/14).
ھەر ئىككى تارماق ئورۇندىكى 123-ئورۇندىكى توكنى نېيتراللاشتۇرۇش GBTA باغلاش ھەمكارلىقىدا كۈچلۈك ئۆزگىرىش پەيدا قىلغانلىقتىن ، ھەر ئىككى تارماق ئورۇندىكى توكنى قايتۇرۇشنىڭ ئازراق تەسىرى بولغانلىقتىن ، بىز ئانالىزنى كېڭەيتىپ ، تەتۈر ئايلىنىش قانىلى بىلەن پەقەت بىرلا تارماقنى ئۆز ئىچىگە ئالدۇق. C تېرمىنال تارماق بۆلىكىدە D123R نىڭ ئورنىنى ئالغان Hv1 ئۇلانغان ئۆلچەم ھاسىل قىلدى (5b رەسىم) ۋە GBTA ۋە 2GBI نىڭ قويۇقلۇقى ئىنكاس قايتۇرۇشنى چەكلىدى. بىز GBTA نىڭ WT-D123R قانىلىغا باغلانغان Hill كوئېففىتسېنتىنىڭ كۆرۈنەرلىك يۇقىرى ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق. ياۋا تىپتىكى Hv1 نىڭ (p بىز يەنە D112E نىڭ ئۆزگىرىشى WT-D123R تەگلىكى ئىشلەپچىقارغان GBTA باغلاشچان Hill كوئېففىتسېنتىنىڭ ئېشىشىنى ئەمەلدىن قالدۇرغانلىقىنى بايقىدۇق (5b رەسىم ، h ۋە قوشۇمچە 4-رەسىم). 2GBI باغلاشنىڭ Hill كوئېففىتسېنتىغا بولغان تەسىرىمۇ يوقىتىلدى ( 5h رەسىم ۋە قوشۇمچە 3-رەسىم) .بۇ تەتقىقات نەتىجىسىدىن ئايان بولۇشىچە ، D112 ئورنىدىكى باغلىنىش ئورنى قالايمىقانلاشقاندا ، 123-ئورۇندىكى قارمۇ قارشى توك سەۋەبىدىن كېلىپ چىققان تارماق گۇرۇپپىلار ئوتتۇرىسىدىكى كۈچەيتىلگەن ئاللوستېرىك جىپسىلىشىش تېخىمۇ كۈچلۈك باغلىنىشلىق ھەمكارلىققا ئايلانمايدۇ.
بىز قوشنا ئوچۇق تارماق ئورۇندىكى D123 قالدۇقلىرى ئۆز-ئارا ئېلېكتر سىستىمىسىدا ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتەلەيدىغان دەرىجىدە يېقىن بولسا ، پاسسىپ زەرەتلەر ئوتتۇرىسىدىكى يىرگىنچلىك ئۆز-ئارا تەسىرنى كىسلاتانىڭ ئورنىنى ئارگىنېنغا ئالماشتۇرۇش ئارقىلىق پاسسىپ ۋە ئاكتىپ زەرەتنىڭ بىرىكىشىگە ئايلاندۇرىمىز دەپ ئويلىدۇق. ئۇلار ئارىسىدىكى جەلپ قىلىش كۈچى. ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش.
بۇ پەرەزنى قوللاش ئۈچۈن ، بىز S1 بۆلىكىنىڭ سىرتقى ئۇچى ئارىسىدىكى كۆرۈنمە يۈزىنى كۈچەيتىشنىڭ يولىنى ئىزدىدۇق ، بۇ توكنىڭ 123-ئورۇندىكى توك ئالماشتۇرۇشتىن ئالاھىدە پەرقلىنىدۇ. بۇنىڭدىن باشقا ، Hv1-CiVSP خېرمېرلىق VSD نىڭ كىرىستال قۇرۇلمىسى I127 نىڭ S1 helix نىڭ سىرتقى ئۇچىدىن پەقەت بىرلا قالدۇق بىلەن ئايرىلغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى. 127-ئورۇندىكى سىستايىنلار S1-S1 نىڭ تېخىمۇ كۈچلۈك ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقى مۆلچەرلەنگەن بولۇپ ، 123-ئورۇندىكى توكنى ئۆزگەرتىش ئارقىلىق كۆزىتىلگەنگە ئوخشاش GBTA باغلاش ھەمكارلىققا تەسىر كۆرسىتىدۇ.
بىز 10 mM merc mercaptoethanol (βME) نىڭ بار-يوقلۇقىدا Hv1 I127C نىڭ قويۇقلۇقىغا تايىنىشنى GBTA ۋە 2GBI بىلەن ئۆلچىدۇق. (6a رەسىم). تاشقى ھۈجەيرە ھەل قىلىش چارىسىگە ۋاكالەتچى قوشۇلدى. پەقەت بىرلا تارماق بۆلەكتە (WT-I127C) سىستېننىڭ ئورنىنى ئالغان ئۇلانغان دىئامېر سەلبىي كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلدى (6a رەسىم) .بىز ئۆزلۈكىدىن ئۆز-ئارا گىرەلىشىپ كەتكەن ئۆز-ئارا ئۇلىنىشنىڭ ھېچقانداق تەسىرىنى ئۆلچەشكە ئامالسىز قالدۇق. 2GBI چەكلىمىسىدىكى I127C تارماق لىنىيىسى ئارىسىدا ، چۈنكى I127C نىڭ Hv1 بىلەن باغلىنىشىدىكى Hill كوئېففىتسېنتى βME بار ياكى يوق ، يەككە سىستېمىنىڭ ئورنىنى ئالغان ئۆلچەمگە باغلاش بىلەن روشەن پەرقلىنىدۇ. Hill كوئېففىتسېنتى WT-I127C (6b رەسىم ۋە قوشۇمچە 3-رەسىم) نى پەرقلەندۈرەلمىدى. روشەن سېلىشتۇرما بولغاندا ، بىز ئۆز-ئارا گىرەلىشىپ كەتكەن ئۆز-ئارا ئۇلىنىشنىڭ GBTA چەكلىمىسىگە تەسىر كۆرسەتكەنلىكىنى ئۆلچەپ چىقتۇق. . باغلىنىشلىق تور بېكەتلەر ئارىسىدىكى S1 پارچىلىرىنىڭ سىرتقى ئۇچى ئارىسىدا دېسففىدلىق باغلىنىشنىڭ شەكىللىنىشى بىلەن زور دەرىجىدە كۈچىيىدۇ. بۇ نەتىجىلەر بىزنىڭ چۈشەندۈرۈشىمىزنى قوللايدۇ ، WT-D123R دىمېردىكى 123-ئورۇندىكى يانتۇ ۋە ئارگىننىڭ جەلپ قىلىش كۈچىگە ئىگە ئېلېكترو سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىرلىرى ئۆز-ئارا ئالوستېرتىك جىپسىلىشىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. subunits.
ئوچۇق ھالەتتىكى تۇتاشتۇرۇش ئىككى تارماق بۆلەكتىكى S1 بۆلىكىنىڭ سىرتقى ئۇچى ئوتتۇرىسىدىكى بىۋاسىتە فىزىكىلىق ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق ۋاسىتە قىلىنغان.
(a) ئۆزگىرىشچان Hv1 ئۆلچىمى ۋە ئۇلاش ئۆلچىمىنىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى ، ئۆز-ئارا ئارىلاشما سىستايىن ئۆز-ئارا ئۇلىنىشنىڭ GBTA باغلاش ھەمكارلىقىغا قانداق تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن. (bd) 2GBI (b, d) ۋە GBTA (c ، e) تاشقى ھۈجەيرە ئېرىتمىسىدە 10 mM βME بار ياكى يوق ئەھۋالدا. ئەگرى سىزىق Kd قىممىتىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان Hill غا ماس كېلىدۇ (قوشۇمچە جەدۋەل 1 گە قاراڭ) ئوخشىمىغان GBTA چەكلەش شارائىتى ئارىسىدا (p 0.05).
بىز يەنە βME بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا ، GBTA نىڭ D112E I127C Hv1 دىمېرغا باغلىنىدىغان Hill كوئېففىتسېنتىنىڭ كېمەيتكۈچى ماددىلارنىڭ بارلىقى بىلەن سېلىشتۇرغاندا كۆرۈنەرلىك يۇقىرى ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق (6e رەسىم ۋە قوشۇمچە 4-رەسىم) ، بۇ D112E نىڭ ئۆزگىرىشىنى كۆرسىتىدۇ. سىستايىن 127 نىڭ ئۆز-ئارا ئۇلىنىشىدىن كېلىپ چىققان GBTA باغلاش ھەمكارلىقنىڭ ئېشىشىنى ئەمەلدىن قالدۇرمىدى. 3-رەسىم).
ئومۇملاشتۇرغاندا ، بۇ بايقاشلار جەلپ قىلىش كۈچىگە ئىگە ئېلېكترو سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىر قىلىش ئارقىلىق ياكى تور بېكەتلەر ئارا ئالماشتۇرۇلغان سىستايىنلار ئارا ئالۋاستىلىق ئۆز-ئارا باغلىنىش ئارقىلىق قوشنا Hv1 تارماق لىنىيىسىدىكى S1 پارچىلىرىنىڭ سىرتقى ئۇچى ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق كۈچەيتىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. جەلپ قىلىش كۈچىگە ئىگە ئېلېكتروستاتتىك ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ D112E ئۆزگىرىشى ئارقىلىق ھەمكارلىقنى بىكار قىلغىلى بولسىمۇ ، ئەمما يانتۇ زايومنىڭ تەسىرى بولمايدۇ.
بىز Hv1 قانىلىغا گانىدىن ھاسىل بولغان تۇغۇندى ماددىلارنى باغلاشقا بولىدىغان خىمىيىلىك بوشلۇق ئۈستىدە ئىزدىنىشىمىزدە ، GBTA غا ئوخشاش 2-گانىدىنوتىئازولنىڭ قويۇقلۇقى قويۇقلۇقىنىڭ 2-گانىدىنوبېنزىمدازولغا قارىغاندا تېخىمۇ يۇقىرى بولىدىغانلىقىنى بايقىدۇق (رەسىم 1c). ۋە مونومېرلىق قاناللار (رەسىم 2a ، b) ۋە بىر تارماق تارماق تورمۇزلىغۇچىغا ئالدىن باغلانغان ۋاقىت سىزىقى (4-رەسىم) بىزنى Hv1 نىڭ GBTA تەرىپىدىن چەكلىنىشى ھەرىكەتنىڭ ئۆز-ئارا ماسلىشىش جەريانى ، دەپ يەكۈن چىقاردى. ئىككى تارماق بۆلەكتىكى بىرىكمىلەرنىڭ باغلىنىشلىق تور بېكەتلىرى ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇلغان. GBTA نىڭ ئوچۇق قانالغا تۇتىشىدىغانلىقى بايقالغان ، ئىلگىرى مۇناسىۋەتلىك بىرىكمە 2GBI32 دا كۆرسىتىلگەندەك ، ئاللوستېرتىك تۇتاشتۇرۇشنى ئوچۇق ھالەتتە ئالاھىدە باھالىغىلى بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بىزنىڭ ھەمكارلىق باغلاش ئەندىزىمىز GBTA نىڭ Hv1 نىڭ چەكلىنىشىنى مىقدارلاشتۇرۇپ تەسۋىرلەپ بېرەلەيتتى (2c رەسىم) ۋە 2GBI ۋە GBTA نىڭ پەردە قايتا ھاسىل بولغاندىن كېيىن قانال قۇيرۇق ئېقىمىنىڭ بۇزۇلۇشىغا بولغان ئوخشىمىغان تەسىرىنى چۈشەندۈرۈپ بېرەلەيمىز ، بۇ بىزنىڭ باغلىنىش جەريانىنى چۈشەندۈرۈشىمىزنى قوللايدۇ.
ئىككى باغلىنىشلىق ئورۇن (مەسىلەن Hv1 غا ئوخشاش) ئاللوستېرلىق ئاقسىلدا ئېرىشكىلى بولىدىغان ئەڭ چوڭ Hill كوئېففىتسېنتى 2. بىز GBTA نى ئۆلچەپ ، Hv1 ياۋا تىپنى كوئېففىتسېنتى 1.31 بىلەن باغلىدۇق ، بۇ Hv1 I127C دا 1.88 گە يەتتى. بىرىكمە ئەركىن ئېنىرگىيە ، ئەڭ تۆۋەن ۋە ئەڭ يېقىن بولغان تور بېكەتلەرنىڭ باغلىنىشچان ئەركىن ئېنېرگىيىسىنىڭ پەرقى (ئۇسۇلغا قاراڭ) ، Hv1 ياۋا تىپىدىكى ئەھۋالدا 1.3 kcal / مول ، Hv1 I127C بولسا 2.7 kcal / mole. ئوكسىگېننىڭ گېموگلوبىنغا ئايلىنىشى ھەمكارلىق جەريانىدىكى ئەڭ داڭلىق ۋە ئەڭ ياخشى تەتقىق قىلىنغان مىسال 38. kcal / mol ، تەجرىبە شارائىتىغا ئاساسەن 38 .شۇڭا ، يەرشارى ئېنېرگىيىسى جەھەتتە ، GBTA نىڭ Hv1 بىلەن باغلىنىشىنىڭ ھەمكارلىقچانلىقى O2 نىڭ گېموگلوبىن بىلەن باغلىنىشى بىلەن ئاساسەن ئوخشىمايدۇ ، ئىككى سىستېمىدىكى ئوخشىمىغان ئاقسىل تارماق ماددىلىرى ئويلاشقاندا.
بىزنىڭ ھەمتۈرتكىلىك ئەندىزىمىزدە ، GBTA مولېكۇلاسىنىڭ بىر تارماق گەۋدە بىلەن باغلىنىشى قوشنا تارماق تارماقنىڭ باغلىنىشچانلىقىنى ئاشۇرىدۇ. بىز تۇنجى باغلىنىش ھادىسىسى (كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ماسلىشىش) نەتىجىسىدە باغلىنىش مۇھىتىنىڭ قايتا تەشكىللىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان جەرياننى تەسەۋۋۇر قىلىمىز. تارماق گۇرۇپپىلار ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ ئۆزگىرىشى. بۇ ئۆزگىرىشلەرگە قارىتا ، قوشنا تارماق تارماقلار باغلىنىش تور بېكەتلىرىنى ئۆزگەرتىدۇ ، نەتىجىدە تېخىمۇ قاتتىق GBTA باغلىنىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. بۇ جەرياندا ، S1 يان تەرەپ D112 باغلىنىشچانلىقىنى ئاشۇرۇش بىلەن باغلىنىشلىق تور بېكەتنىڭ قايتا تەشكىللىنىشىگە مەسئۇل. D122 ئىلگىرى Hv1 پروتون سىڭىش يولىنىڭ بىر قىسمى ئىكەنلىكى ۋە تاللاش سۈزگۈچ رولىنى ئوينايدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. نەتىجىمىز شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، ئىككى Hv1 تارماق لىنىيىسىدىكى تاللاش سۈزگۈچلىرى ئوچۇق ھالەتتە ئۆز-ئارا تۇتاشتۇرۇلغان. 7a رەسىمدە GBTA باغلاش ئورنىنىڭ تەخمىنىي ئورنى ۋە D112 ، D123 ، K125 ۋە I127 قالدۇقلىرىنىڭ ئورنى Hv1 VSD نىڭ سىخېمىسىغا ئاساسەن كۆرسىتىلدى. Hv1-CiVSP خېرېرانىڭ خرۇستال قۇرۇلمىسىدا. S1 نىڭ تاشقى ھۈجەيرە ئۇچىغا چېتىشلىق ئاللوستېرلىق تۇتاشتۇرۇشنىڭ تەۋسىيە قىلىنغان يۆنىلىشى قارا ئوق بىلەن كۆرسىتىلدى.
(a) Hv1 VSD نىڭ سىخېماسى باغلانغان GBTA نىڭ ئالدىن پەرەز قىلىنغان ئورۇنلىرى كۈلرەڭ تۇخۇم شەكلىدە كۆرسىتىلىدۇ. قارا ئوقلار قوشنا ئىككى تارماق ئورۇندىكى باغلىنىشلىق ئورۇنلار ئارىسىدىكى ئاللوستېرلىق تۇتاشتۇرۇشقا مۇناسىۋەتلىك يوللارنى كۆرسىتىدۇ. تەكشۈرۈلگەن S1 قالدۇقلىرىنىڭ ئورنى رەڭلىك شار بىلەن بەلگە قويۇلغان. (B) Hv1 تارماق ئەترىتىنىڭ سىخېما تەسۋىرى پەردە تەكشىلىكىنىڭ تاشقى ھۈجەيرىسىدىن كۆرۈنگەندەك ئوخشىمىغان ئىككى خىل ئوخشىمىغان شەكىلدە. سول تەرەپتە ، ۋاقىت سىزىقى كۆرۈنمە يۈزى S4 helix ئارقىلىق شەكىللەنگەن. ئىككى S4 خىلىتنىڭ سىرتقى ئۇچىنى ئايرىش (بويالغان ئوق) ، ئوڭ تەرەپتە كۆرسىتىلگەن ئورۇنلاشتۇرۇشنى ھاسىل قىلىدۇ. بۇ سەپلىمەتە ، قوشنا تارماق ئورۇندىكى D123 ۋە I127 قالدۇقلىرىنىڭ بىر-بىرىگە يېقىنلىشىشىغا رۇخسەت قىلىنىدۇ. (c) CiVSP VSD نىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى 4G80 كىرىستال قۇرۇلمىسىدىن تېپىلغان ۋاقىت ئۆلچىمىدە. CiVSP دىكى P140 ئورنى Hv1 دىكى D123 ئورۇنغا ماس كېلىدۇ.
نەتىجىمىز شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، قالدۇق 123 (123D / 123D ياكى 123R / 123R) ئارىسىدىكى يىرگىنچلىك ئېلېكتر سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىر ئوچۇق ھالەتتە GBTA باغلاش ھەمكارلىقنىڭ «نورمال» سەۋىيىسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇپ ، ئۆز-ئارا تەسىرنى ئىتتىرىشتىن جەلپ قىلىش كۈچىگە (123D / 123R) غا يۆتكەيدۇ. ، ھەمكارلىق كۈچەيدى (5g رەسىم). مۆلچەرلىنىشىچە ، ئالانىننىڭ ئورنىنى ئېلىش بىلەن يىرگىنچلىك ئۆز-ئارا تەسىرنى يوقىتىشمۇ ھەمكارلىقنىڭ كۈچىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن ، 123A / 123A دىمېرنىڭ ھەمكارلىقنىڭ تۆۋەنلىشى كۆرۈلگەن (5e رەسىم). چۈشەندۈرۈش شۇكى ، گىدروفوبىك قالدۇقلىرىنى گىدروفىللىق مۇھىتقا قويۇشنىڭ تۇراقسىزلاشتۇرۇش رولى D123 قالدۇقلىرى ئارىسىدىكى يىرگىنچلىك ئۆز-ئارا تەسىرنى يوقىتىش سەۋەبىدىن مۇقىملاشتۇرۇش ئۈنۈمىدىن ئېشىپ كېتىشى مۇمكىن ، نەتىجىدە باغلىنىشلىق ھەمكارلىق ئومۇميۈزلۈك تۆۋەنلەيدۇ. مونېي قاتارلىقلار. Ciona gutis Ci-Hv1 نىڭ ئورنى D171 (ئىنسانلارنىڭ Hv1 دىكى D123 گە ماس كېلىدۇ) ئاكتىپلانغاندىن كېيىن كۆپىيىدۇ ، D123 ئوچۇق ھالەتتە گىدروفىللىق مۇھىتقا جايلاشقان دېگەن قاراشنى قوللايدۇ.
Hv1 قانىلىنىڭ دەرۋازىسى كۆپ قېتىم ئۆتۈشۈش ئارقىلىق يۈز بەرگەنلىكى مەلۇم ، 19،20،26،39،40،4،4. Qui et al26 پەردىنىڭ ئايلىنىشىدىن كېيىن ، Ci-Hv1 نىڭ ئېلېكتر بېسىمى سېنزورنىڭ ماسلىشىشچان ئۆزگىرىشنى باشتىن كەچۈرگەنلىكىنى بايقىغان. ئۇنىڭدىن كېيىن ، ھەر ئىككى تارماق يولدا پروتوننىڭ ئوچۇق ئۆتكۈزۈلۈشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان روشەن ئۆتكۈنچى باسقۇچ. ئېلېكتر بېسىمى سېنزورىنىڭ ماس ئۆزگىرىشى توك بېسىمى قىسىش فلۇئورېسسېنسىيىسى ئارقىلىق كۆزىتىلىپ ، ئىككىنچى قېتىملىق ئۆتكۈنچى باسقۇچنىڭ D171 ئورنىدىكى ئۆزگىرىش ئارقىلىق تاللانغانلىقى بايقالغان. فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ بۇزۇلۇشى ماسلىشىشچان ئۆزگىرىشنىڭ ئىنكاس كوئوردېناتىنى بويلاپ مەلۇم نۇقتىدا قوشنا تارماق ئورۇننىڭ D171 قالدۇقلىرى ئارىسىدا ئېلېكترو سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ بارلىقى بىلەن بىردەك. ھەمدە GBTA باغلاش تور بېكەتلىرى ئارىسىدىكى بىرىكمە باغلىنىشنى ۋاسىتە قىلىدۇ.
فۇجىۋارا قاتارلىقلار 25 سىپوپلازما شەكىللىك كاتەكچە تور دائىرىسىنىڭ غۇۋا كۆرۈنمە يۈزىنىڭ پەردىگە كېڭىيىپ ، ئىككى S4 خىلىتنى ئۆز ئىچىگە ئالىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدى (رەسىم 7b ، سول تەرەپ). S4 helix بىلەن CCD نى تۇتاشتۇرىدىغان رايوننىڭ پۈتكۈل VSD ۋە ئىقتىدار ئانالىزى. تارقىلىشچان pH گرادېنتى بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا ، Hv1 قانىلى ئېچىۋېتىش ئۈچۈن خېلى كۆپ پەردىنىڭ ئايلىنىشىنى تەلەپ قىلىدۇ ، قانال ئاساسەن تاقالغان شارائىتتا سىستايىن ئۆز-ئارا ئۇلىنىش يۈز بېرىدۇ. شۇڭلاشقا ، بايقالغان S4-S4 كۆرۈنمە يۈزى بەلكىم دۆلەت سىرتىدىكى تارماق سەپلىمىنى ئەكىس ئەتتۈرۈشى مۇمكىن. باشقا تەتقىقاتلار S1 ۋە S2 نىڭ دەرۋازا ئارىلىقىدا ئۆز-ئارا تەسىرگە قاتناشقانلىقىغا ئائىت پاكىتلارنى بايقىدى. يېپىق ھالەتتىكى ھالەت ، مونىي قاتارلىقلارنىڭ تەتقىقاتى بىلەن بىردەك پىكىر. S1 دەرۋازا جەريانىدا 39 ھەرىكەت قىلىدۇ.
بۇ يەردە ، بىز ئوچۇق ھالەتتە ، S1 helix نىڭ تاشقى ھۈجەيرە ئۇچىنىڭ تارماق ئېلېمېنتلار ئارىسىدىكى ئاللوستېرتىك جىپسىلىشىشنى ۋاسىتە قىلىدىغان بىۋاسىتە ئېلېكترو سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىرنى قوللاشقا يېتەرلىك ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز. بىر-بىرىدىن باشقا بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن ، ئىككى VSD تارماق ئەترىتىنىڭ 20 ° C سائەت يۆنىلىشىدە ئايلانما پەردىگە توغرىلانغان ئوق ئەتراپىدا ئايلىنىشى ، ئىككى S4 خىلىتنىڭ سىرتقى ئۇچىنى ئايرىش بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، S1-S1 سەپلىمىسىنى ئىزچىل ھاسىل قىلدى. بىزنىڭ بايقاشلىرىمىز بىلەن (7b رەسىم ، ئوڭ تەرەپ). ئوچۇق ھالەتتە قانالنىڭ بۇ سەپلىمىسىنى تەۋسىيە قىلىمىز.
گەرچە CiVSP ئېنزىم مونومېر رولىنى ئوينايدۇ دەپ قارالسىمۇ ، ئەمما ئۇنىڭ ئايرىۋېتىلگەن VSD نىڭ خرۇستال قۇرۇلمىسى سۇس ھالەتتە تۇتۇلدى. Hv1 (رەسىم 7c). ۋە CiVSP ئۆلچەملىرى بۇ ئاقسىللارنىڭ VSD لىرىنىڭ S1 نىڭ تاشقى ھۈجەيرە ئۇچى ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان كۆرۈنمە يۈزى شەكىللەندۈرۈشنىڭ ئىچكى خاھىشىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
Hv1 نىڭ ئىسپېرما ھۈجەيرىسىنى قوزغىتىشتىكى موھىم رولى بۇ قانالنى ئەرلەرنىڭ تۇغۇشنى كونترول قىلىشتىكى جەلپ قىلىش كۈچىگە ئىگە دورا نىشانىغا ئايلاندۇرىدۇ. بۇنىڭدىن باشقا ، Hv1 نىڭ مىكرو ئورگانىزىمدا قوزغىتىلىشى قان يېتىشمەسلىكتىن بولغان سەكتىنىڭ ئەسلىگە كېلىشىنى ناچارلاشتۇرۇۋېتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. كۈچەيتىلگەن Hv1 پائالىيىتىنىڭ تۆۋەن بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئىكەنلىكى بايقالدى. سۈت بېزى 12 ياكى بوغماق ئۈچەي راكىغا گىرىپتار بولغان بىمارلاردا ھايات قېلىش 13 ۋە B ھۈجەيرىسىنىڭ يامان سۈپەتلىك ئۆسمىسىگە تۆھپە قوشىدۇ دەپ قارىلىدۇ .شۇڭا ، Hv1 نى نىشان قىلغان كىچىك مولېكۇلا دورىلىرىنى نېرۋا ئاجىزلاش دورىسى ياكى باكتېرىيەگە قارشى داۋالاش دورىسى ئورنىدا ئىشلىتىشكە بولىدۇ. ئوچۇق Hv1 تارماق لىنىيىسى ، باغلىنىشچانلىقىنىڭ كۈچىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، بەلكىم Hv1 قانىلىنى نىشان قىلغان تېخىمۇ كۈچلۈك دورىلارنىڭ تەرەققىي قىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.
ئىنسانلارنىڭ Hv1 نىڭ بېكەتكە يۈزلەنگەن ئۆزگىرىشچانلىقى ئۆلچەملىك PCR تېخنىكىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. Hv1NCCiVSP قۇرۇلۇشىدا ، Hv1 نىڭ 1-96 ۋە 228-273 قالدۇقلىرى CiVSP18 نىڭ 1-113 ۋە 240-576 قالدۇقلىرى بىلەن ئالماشتۇرۇلدى. Hv1 ئۇلانغان ۋاقىت سىزىقىدا ، بىر تارماق تارماقنىڭ C تېرمىنالى GGSGGSGGSGSGGSGG ئۇلىغۇچ ئارقىلىق ئىككىنچى تارماق تارماقنىڭ N تېرمىنالىغا ئۇلىنىدۇ. ھەرخىل قۇرۇلۇشلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان pGEMHE پىلازمىسى Nhe1 ياكى Sph1 چەكلەش فېرمېنتى (يېڭى ئېنگلاند بىئولاب) بىلەن تۈزۈلگەن بولۇپ ، RNA بىرىكتۈرۈلگەن. T7 mMessage mMachine ترانسكرىپسىيە زاپچاسلىرى (Ambion). ئېلېكترو فىزىئولوگىيىلىك ئۆلچەشتىن 1-3 كۈن بۇرۇن ، CRNA Xenopus تۇخۇم ھۈجەيرىسىگە ئوكۇل قىلىندى (ھەر بىر ھۈجەيرە 50 nl ، 0.3-1.5 μ mg / μl). RNA ئوكۇلىدىن كېيىن ، ND96 ۋاستىسىدە 96 mM NaCl ، 2 mM KCl ، 1.8 mM CaCl ، 1 mMgCl ، 10 mM HEPES ، 5 mM pyruvate ، 100 mgg / ml گېنتامىن ، pH 7.2 18 ° C بولغان ھۈجەيرىلەر ساقلانغان. .
2-گانىدىنو-بېنزىمىدازول [1] ، 2-گانىدىنو-بېنزوتىئازول [2] ، -تيازول -2-يىل) گانىدىن) 5-كاربونات [9] ۋە (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ئېتىل كىسلاتاسى [10] سىگما-ئالدرىچتىن كەلگەن. - (4-خلوروفېنىل) -1،3-تىيازول -2 يىل Matrix Scientific دىن. بۇ بىرىكمىلەر سودا جەھەتتە ئەڭ يۇقىرى ساپلىق ھېسابلىنىدۇ. ئۇلار قۇرۇق DMSO دا ئېرىتىلگەندىن كېيىن 100MM لىق زاپاس ئېرىتمە ھاسىل قىلدى ، ئاندىن لازىملىق ئاخىرقى قويۇقلۇقتا خاتىرىلەش ئېرىتمىسىدە سۇيۇلدۇرۇلدى. 3 ۋە 4-بىرىكمىلەر تۆۋەندە بىرىكتۈرۈلدى. كەم دېگەندە 99% ساپلىق.
2-ئامىنو -4- (ترىفلوئورومېتىل) بېنزېنېتىئول گىدروخلورىد (1.02 گرام ، 4.5 مىللىمېتىر) 25 مىللىلىتىر سۇ گىدروخلورىد كىسلاتاسى (2.5 N) غا قاتتىق دىسكاندىئامىد (380 مىللىگىرام ، 4.5 مىللىمېتىر) قوشۇلدى. 4 سائەت كۈچلۈك غىدىقلاش ئارقىلىق قايتۇرۇلدى. رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى ئۆي تېمپېراتۇرىسىغا سوۋۇتۇلدى ۋە 10N كالىي ھىدروكسىدنى تەدرىجىي قوشۇش ئارقىلىق نېيتراللاشتۇرۇلدى. شەكىللەنگەن ئاق چۆكمە سۈزۈلۈپ ، سوغۇق سۇ بىلەن يۇيۇلدى (3 × 50 مىللىمېتىر) ، تونۇردا قۇرۇتۇلدى ( 65 ° C) بىر نەچچە سائەت ، ئاندىن ئېتىل ئاتسېتات / نېفىت ئېفىردىن قايتا تەشكىللىنىپ ، ئاق قاتتىق (500 مىللىگىرام ،% 48) بېرىدۇ. mp 221–222 ° C (يورۇقلۇق 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (ناھايىتى كەڭ s ، 4 H) ، 7.40 , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 = 272 Hz) ، 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz) ، 134.8 ، 152.1 ، 158.4 ، 175.5.HRMS (ESI): m / z ھېسابلانغان قىممەت. : 261.0419.
نافتو [1,2-d] تىيازول -2-ئامىن (300 مىللىگىرام ، 1.5 مىللىمېتىر) ، ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك بىرىكتۈرۈلگەن ، كىچىك سىناق نەيچىسىدىكى ماي مۇنچىسىدا 200 سېلسىيە گرادۇسقىچە قىزىتىلغان. 1.0 مىللىلىتىر. كىچىك پارچىلارغا پارچىلىنىپ سۇ بىلەن يۇيۇلۇپ سۇس سېرىق رەڭلىك ئامورفوس قاتتىقلىقى تەمىنلەندى. (38 mg ،% 10) mp 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz ، DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MHz ، DMSO-d6): δ = 119.9 ، 122.7 ، 123.4 ، 123.6 ، 126.5 ، 127.1 ، 128.7 ، 132.1 ، 140.7 ، 169.1.HRMS (ESI): m / z ھېسابلانغان قىممەت. C12H11N4S (M + H) ، تېپىلدى: 243.0704.
پروتون ئېقىمى ئوكسىگېننىڭ ئىچكى ۋە تاشقى يامىقىدا ئۆلچەنگەن بولۇپ ، pClamp10 يۇمشاق دېتالى بىلەن Axon Digidata 1440A (مولېكۇلا ئۈسكۈنىسى) كونترول قىلغان Axopatch 200B كۈچەيتكۈچ ئارقىلىق ئوخشىمىغان قۇرۇلۇشلارنى ئىپادىلەيدۇ. ) ئېتانېسۇلفونىك كىسلاتاسى (MES) ، 30 مىللىمېتىرلىق تېترائېتىلاممونىي (TEA) مېسسىلات ، 5 mM TEA خىلور ، 5 mM ئېتىلېن گلىكول بىس (2-ئامىنوئېتىل) -N ، N ، N '، N-tetraacetic كىسلاتاسى (EGTA) غا تەڭشەلدى. pH 6.0 TEA ھىدروكسىد بىلەن. ) ۋە Origin8.1 (OriginLab).
ھەر خىل قويۇقلۇقى Hv1 چەكلىگۈچنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ھەل قىلىش چارىسى ۋە بەزى ئەھۋاللاردا pClamp يۇمشاق دېتالى TTL (Transistor-) دىن ئۆتكەن VC-6 خۇشپۇراق كلاپان سىستېمىسى (Warner Instr.) غا ئۇلانغان كۆپ خىل شەكىل ئارقىلىق تارتىش كۈچى ئارقىلىق مۇنچا ئىچىگە كىردى. ترانس ist ور لوگىكىسى) سىگناللىرى. رېپېتىتسىيە قىلىش تەجرىبىسى كۆپ تۇرۇبا پۈركۈش قەلەمچىسى (AutoMate Sci.) ئارقىلىق 360 مىللىمېتىرلىق دىئامېتىرى يەتكۈزۈش ئۇچى بىلەن ياماق تۇرۇبىسىنىڭ ئالدىغا ئورنىتىلغان. +120 mV ئايرىش دولقۇنى. GV ئۆلچەش ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك 18،20. نۆۋەتتىكى بۇزۇلۇشنى تۈزىتىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. GV گرافىك Boltzmann تەڭلىمىگە ماس كېلىدۇ:
ئوخشاش بولمىغان قانال ۋە ئىنگىبىتورنىڭ بىرىكىشى ئۈچۈن روشەن ئايرىلىش تۇراقلىقى (Kd) چەكلىمە قويۇقلۇقىنىڭ قويۇقلۇقىغا باغلىق (% چەكلەش قىممىتىدىن دېرەك بېرىدۇ) Hill تەڭلىمىسى بىلەن بېكىتىلدى:
بۇ يەردە [I] ئىنگىبىتورنىڭ قويۇقلۇقى I ، h بولسا Hill كوئېففىتسېنتى. Hill كوئېففىتسېنتىنى ھېسابلاش ئۈچۈن ، (2) تەڭلىمىسى:
يوللانغان ۋاقتى: Jun-07-2022
