Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta para sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang Hv1 voltage-gated proton channel ay isang dimeric complex na binubuo ng dalawang voltage-sensing domain (VSD), na ang bawat isa ay naglalaman ng gated proton permeation pathway. Ang dimerization ay kinokontrol ng cytoplasmic coiled-coil domain. Ang paglipat mula sa closed state patungo sa ang bukas na estado sa parehong mga VSD ay kilala na nagaganap nang sama-sama; gayunpaman, kakaunti ang nalalaman tungkol sa pinagbabatayan na mga mekanismo. Ang mga intersubunit na interface ay may mahalagang papel sa mga prosesong allosteric; gayunpaman, ang mga naturang interface ay hindi natukoy sa mga bukas na Hv1 channel. Dito ipinapakita namin na hinaharangan ng 2-guanidinothiazole derivatives ang dalawang Hv1 VSD sa isang kooperatiba na paraan at ginagamit ang isa sa mga compound na ito bilang isang probe para sa allosteric coupling sa pagitan ng mga bukas na subunit. Nalaman namin na ang extracellular Ang dulo ng unang transmembrane fragment ng VSD ay bumubuo ng isang intersubunit na interface na namamagitan sa pagsasama sa pagitan ng mga nagbubuklod na site, samantalang ang coiled-coil domain ay hindi direktang kasangkot sa prosesong ito. Nakakita rin kami ng matibay na ebidensya na ang proton-selective filter ng channel ay kumokontrol sa blocker-binding cooperativity .
Ang mga channel ng proton na may boltahe ay may mahalagang papel sa iba't ibang mga organismo, mula sa phytoplankton hanggang sa mga tao. ay ang Hv1, na produkto ng HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) ay ipinakitang gumaganap ng papel sa paglaganap ng B cell4, paggawa ng reaktibong species ng oxygen ng likas na immune system5,6,7,8, sperm cell motility9 at pH regulation ng airway surface fluid10. Ang channel na ito ay kasangkot sa ilang Overexpressed sa mga uri ng cancer gaya ng B-cell malignancies4,11 at breast at colorectal cancers12,13.Napag-alaman ang sobrang aktibidad ng Hv1 na nagpapataas ng metastatic potential ng mga cancer cells 11, 12 .Sa utak, ang Hv1 ay ipinahayag sa pamamagitan ng microglia, at ang aktibidad nito ay ipinakita upang palalain ang pinsala sa utak sa mga modelo ng ischemic stroke.
Ang Hv1 protein ay naglalaman ng isang voltage-sensing domain (VSD), na binubuo ng apat na transmembrane segment na tinatawag na S1 hanggang S414. Ang VSD ay kahawig ng mga kaukulang domain ng voltage-gated Na+, K+ at Ca2+ channel at voltage-sensitive phosphatases, gaya ng CiVSP mula sa Ciona gutis15.Sa iba pang mga protina na ito, ang C-terminus ng S4 ay nakakabit sa isang effector module, ang pore domain o enzyme. Sa Hv1, ang S4 ay naka-link sa coiled-coil domain (CCD) na matatagpuan sa cytoplasmic side ng membrane .Ang channel ay isang dimeric complex na binubuo ng dalawang VSD, bawat isa ay naglalaman ng gated proton permeation pathway16,17,18. Ang dalawang Hv1 subunits na ito ay natagpuang nagtutulungang bumukas19,20,21,22, na nagmumungkahi na ang allosteric coupling at inter-subunit na pakikipag-ugnayan ay gumaganap isang mahalagang papel sa proseso ng gating. Ang interface sa pagitan ng mga subunit sa loob ng coiled coil domain ay mahusay na tinukoy dahil ang mga kristal na istruktura ng dalawang nakahiwalay na domain ay magagamit22,23. Sa kabilang banda, ang interface sa pagitan ng mga VSD sa loob ng lamad ay hindi Ang kristal na istraktura ng Hv1-CiVSP chimeric protein ay hindi nagbibigay ng impormasyon tungkol sa interface na ito, dahil ang trimeric na organisasyon ng crystallized channel complex ay maaaring magresulta mula sa pagpapalit ng katutubong Hv1 CCD ng yeast leucine zipper na GCN424.
Ang isang kamakailang pag-aaral ng organisasyon ng subunit ng Hv1 channel ay nagtapos na ang dalawang S4 helice ay lumipat sa CCD nang walang matinding pagkagambala sa pangalawang istraktura, na nagreresulta sa mahabang mga helice na nagsisimula mula sa lamad at nag-project sa cytoplasm.Batay sa cysteine crosslinking analysis, ang pag-aaral na ito ay nagmumungkahi na ang mga Hv1 VSD ay makipag-ugnayan sa isa't isa sa kahabaan ng S4 na segment. Gayunpaman, ang ibang mga pag-aaral ay nagmungkahi ng mga alternatibong interface sa pagitan ng mga VSD. Kasama sa mga interface na ito ang mga S1 segment 17, 21, 26 at ang mga panlabas na dulo ng S2 segment 21. Isang posibleng dahilan para sa magkasalungat na bahagi. Ang mga resulta ng mga pag-aaral na ito ay ang allosteric coupling sa pagitan ng mga VSD ay napagmasdan na may kaugnayan sa proseso ng gating, na nakasalalay sa mga sarado at bukas na estado, at ang interface sa pagitan ng mga VSD ay maaaring mag-iba sa iba't ibang mga pagbabago ng estado sa conform.
Dito, nalaman namin na pinipigilan ng 2-guanidinothiazole ang mga channel ng Hv1 sa pamamagitan ng synergistically binding sa dalawang bukas na VSD, at ginamit ang isa sa mga compound, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), upang suriin ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga subunit sa bukas na estado. interface. Nalaman namin na ang GBTA binding curve ay maaaring mailarawan nang mabuti sa pamamagitan ng isang quantitative model kung saan ang pagbubuklod ng isang inhibitor sa isang subunit ay nagreresulta sa pagtaas ng binding affinity ng katabing subunit. Nalaman din namin na ang mga residue D112, selectivity filters para sa channel 27, 28 at bahagi ng guanidine derivative binding site 29 kumokontrol sa GBTA binding cooperativity. Ipinapakita namin na ang cooperative binding ay pinananatili sa Hv1 dimer, kung saan ang CCD ay humihiwalay sa S4 segment, na nagmumungkahi na ang intersubunit interface sa CCD ay hindi direkta. pinapamagitan ang allosteric coupling sa pagitan ng mga site na nagbubuklod ng GBTA. Sa kabaligtaran, nalaman namin na ang fragment ng S1 ay bahagi ng interface sa pagitan ng mga subunit at nagmumungkahi ng pag-aayos ng mga katabing VSD na may extracellular na dulo ng S4 helix na malayo sa gitna ng dimer upang payagan ang S1 fragment ay nasa bukas na estado.
Ang mga small molecule inhibitors ng Hv1 ay kapaki-pakinabang bilang mga anticancer na gamot at neuroprotective agent.Gayunpaman, hanggang ngayon, kakaunti ang mga compound na nakapagpigil sa channel30,31,32,33. Kabilang sa mga ito, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, compound [1] sa Fig . 1a) at ang mga derivatives nito ay natagpuan na humarang sa VSD29,32 permeation ng mga proton sa pamamagitan ng channel. Ang pagbubuklod ng naturang mga compound ay naisip na magaganap nang nakapag-iisa sa dalawang bukas na subunits. 2-guanidinobenzothiazole (GBTA, compound [2] sa Figure 1a) ay dati nang ipinakita na pumipigil sa Hv1 halos kasing epektibo ng 2GBI kapag nasubok sa isang konsentrasyon na 200 μM (Larawan 1b). Sinuri namin ang iba pang mga thiazole derivatives at nalaman na ang ilan sa mga ito ay humadlang sa channel na may katulad o higit na potensyal kaysa sa GBTA (Fig. 1 at Karagdagang Natukoy namin ang mga curve ng pagtugon sa konsentrasyon ng apat na thiazole derivatives (GBTA at mga compound [3], [6] at [11], Fig. 1c) at nalaman namin na mas matarik ang mga ito kaysa sa 2GBI. The Hill coefficients (h) ng thiazole derivatives ay mula sa 1.109 ± 0.040 hanggang 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c at Pandagdag na Fig. 1). Sa kaibahan, ang Hill coefficient para sa 2GBI ay 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a at Supplementary Fig. 1). Ang isang Hill coefficient sa itaas 1 ay nagpapahiwatig ng binding cooperativity. Dahil ang bawat Hv1 subunit ay may sariling inhibitor- nagbubuklod na site, 29,32 na aming pinangatuwiranan na ang pagbubuklod ng isang thiazole derivative sa isang subunit ay maaaring mapahusay ang pagbubuklod ng pangalawang molekula ng inhibitor sa katabing subunit. Ang GBTA ay ang test compound na may pinakamataas na koepisyent ng Hill. Samakatuwid, pinili namin ang tambalang ito upang pag-aralan pa ang mekanismo ng nagbubuklod na synergy at ginamit ang 2GBI bilang isang sanggunian na negatibong kontrol.
(a) Mga compound ng pagsubok: [1] Sanggunian Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Pagpigil sa aktibidad ng Hv1 ng tao sa pamamagitan ng ipinahiwatig na guanidinothiazoles at ang reference compound na 2GBI (blue-green bars) .Hv1 proton currents ay sinusukat sa inside-out plaques ng Xenopus oocytes bilang tugon sa depolarization mula sa isang humahawak na potensyal na -80 mV hanggang +120 mV. Ang bawat inhibitor ay idinagdag sa paliguan sa isang konsentrasyon na 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Ang data ay mean±SEM (n≥4).(c) Concentration-dependent inhibition ng Hv1 ng tao sa pamamagitan ng compounds [2], [3], [6] at [11].Ang bawat punto ay kumakatawan sa mean inhibition ± SD ng 3 sa 15 mga sukat. Ang linya ay isang Hill fit na ginamit upang makuha ang maliwanag na mga halaga ng Kd na iniulat sa Karagdagang Talahanayan 1. Ang mga koepisyent ng burol ay tinutukoy mula sa mga akma na iniulat sa Karagdagang Fig. 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (tingnan ang Mga Paraan).
(a,b) Inhibited ng mga compound na 2GBI at GBTA ang dimeric at monomeric Hv1 sa paraang nakadepende sa konsentrasyon. Ang bawat punto ay kumakatawan sa mean inhibition ± SD ng 3 hanggang 8 na sukat at ang curve ay isang Hill fit. Ang Hill coefficients (h) na ipinapakita sa ang mga inset histogram ay natukoy mula sa mga akma na iniulat sa Mga Karagdagang Fig 3 at 4. Ang pagtugon sa konsentrasyon ng GBTA na ipinapakita sa (a) ay kapareho ng sa Fig. 1c. Tingnan ang Karagdagang Talahanayan 1 para sa maliwanag na mga halaga ng Kd. (c) Pagmomodelo ng ang kooperatiba na pagbubuklod ng GBTA sa dimeric Hv1. Ang solidong itim na linya ay kumakatawan sa akma sa pang-eksperimentong data sa pamamagitan ng equation (6), na naglalarawan sa nagbubuklod na modelo na ipinapakita sa (d). Ang mga dashed na linya na may label na Sub 1 at Sub 2 ay kumakatawan sa bimolecular association -dissociation equilibrium curves ng una at pangalawang nagbubuklod na mga kaganapan, ayon sa pagkakabanggit (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Schematic diagram ng iminungkahing mekanismo ng Hv1 block. Sa kaso ng GBTA, ang pagbubuklod sa isang bukas na subunit ay nagpapataas ng affinity ng katabing bukas na subunit (Kd2 Ang mga channel ng Hv1 ay maaaring ma-monomerize sa pamamagitan ng pagpapalit ng kanilang N- at C-terminal cytoplasmic domain na may kaukulang mga bahagi ng Ciona Intestinalis voltage-sensitive phosphatase CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34. Sinusukat namin ang concentration dependence ng pagsugpo ng monomeric Hv1 ng GBTA at 2GBI at inihambing ang mga ito sa pagsugpo sa dimeric channel (wild-type) (Larawan 2a, b). affinity ng iba pang subunit para sa inhibitor. Nangatuwiran kami na ang GBTA binding sa isang Hv1 subunit ay maaaring humantong sa muling pagsasaayos ng binding site (pag-uudyok sa fit35), na magti-trigger ng muling pagsasaayos ng bakanteng binding site ng katabing subunit, na humahantong sa pagtaas ng pagbubuklod. pagkakaugnay.
Upang ilarawan ang dami ng kooperatiba na pagbubuklod ng GBTA sa channel, gumamit kami ng isang modelo kung saan ang alinman sa mga subunit ay maaaring magbigkis sa unang molekula ng inhibitor kasunod ng isang bimolecular na reaksyon na may isang dissociation constant na Kd1 (Larawan 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO* ). Ang pagbubuklod ay nagiging sanhi ng channel na magpatibay ng isang estado kung saan ang natitirang mga walang laman na subunit ay nagbubuklod sa inhibitor kasunod ng isang natatanging bimolecular na reaksyon na may isang dissociation constant na Kd2, kung saan ang Kd2 Ang solidong itim na linya sa Figure 2c ay ang akma ng equation ng modelo sa experimental concentration-response curve, na nagbubunga ng Kd1 ng ~290 μM at isang Kd2 ng ~29 μM (seksyon ng Mga Paraan, equation (6)). Inilalarawan din ng modelo ang pagbubuklod ng 2GBI, kung saan Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). Sa monomeric Hv1, mayroon lamang isang binding site at isang Kdm (O° + B ⇆ B°). Sa kaso ng GBTA, ang Kdm ay nasa paligid ng 54 μM, na mas katulad sa Kd1 kaysa sa Kd2 (Fig. 2d). affinity state (OO) ng dimer, malamang dahil sa pag-aalis ng interface sa pagitan ng mga subunit.
Tulad ng ipinakita dati para sa 2GBI32, nalaman namin na pinigilan ng GBTA ang mga agos ng Hv1 sa pamamagitan ng pagharang sa channel kapag ito ay bukas sa halip na gawin itong mas mahirap na buksan (Karagdagang Fig. 2a, b, d). bilang tugon sa repolarization ng lamad, ngunit ang hindi pangkaraniwang bagay na ito ay hindi naobserbahan sa GBTA (Karagdagang Fig. 2c). foot gate” mekanismo), at 2GBI unbinds mas mabagal kaysa sa pagsara ng mga gate. Kung ang isang Hv1 subunit ay na-unblock at isinara, habang ang katabing subunit ay nananatiling naka-block, ang pag-unbinding ng natitirang 2GBI molecule ay nagiging mas mabagal (blocker capture). Long-lived channel species na may isang naka-block na subunit lamang ang nagsasagawa ng mga proton nang pansamantala bago isara at gumawa ng malaking kontribusyon sa dahan-dahang nabubulok na agos ng buntot.
Ang paghahanap na ang pagkabulok ng Hv1 tail currents ay hindi makabuluhang pinabagal sa pagkakaroon ng GBTA (Karagdagang Fig. 2c) ay pare-pareho sa isang synergistic binding mechanism para sa blocker na ito (Fig. 2d). Kapag ang isang GBTA molecule ay hindi nakatali mula sa Hv1 subunit , ang affinity ng blocker sa katabing subunit ay bumaba nang humigit-kumulang 10 beses, na pinapaboran ang prosesong hindi nagbubuklod. Nangangahulugan ito na ang pangalawang molekula ng GBTA ay may mas mataas na pagkakataong ma-unrave bago ito ma-trap sa channel.Matagal ang buhay na channel species na gumawa lamang ng isang blocking subunit ay inaasahang magiging mas masagana sa presensya ng GBTA kaysa sa pagkakaroon ng 2GBI, na nagreresulta sa mas mabilis na pagkabulok ng kasalukuyang buntot.
Upang makipagtulungan ang GBTA sa parehong Hv1 subunit, dapat allosterically coupled ang mga binding site. Ang bawat binding site ay dapat na may kakayahang: 1) mag-trigger ng isang hanay ng mga kaganapan na nakikipag-ugnayan sa mga katabing subunit na nakatali sa inhibitor, at 2) namamagitan sa transition mula sa low-affinity hanggang sa high-affinity binding.Nangatuwiran kami na kung ang mga partikular na residue sa loob ng binding site ay nag-ambag sa proseso ng kooperatiba, dapat baguhin ng kanilang mutation ang Hill coefficient ng concentration-response curve ng GBTA inhibition ng Hv1.Residues D112, F150 Ang , S181 at R211 ay dati nang ipinakita bilang bahagi ng 2GBI29 na nagbubuklod na kapaligiran at ipinalagay namin na sila ay magiging kasangkot din sa GBTA na nagbubuklod (Larawan 3A). Sinusukat namin ang mga inhibitory concentration-response curves ng GBTA para sa mga mutant channel D112E, F150A, S181A. , at R211S (Figure 3) at inihambing ang kanilang mga Hill coefficient sa mga Hv1 wild-type, gamit ang 2GBI bilang reference. Ang Residu V109 ay nasa parehong mukha ng S1 segment bilang D112 at may isang dagdag na helical turn sa loob ng cell. Ang V109 ay hindi kasangkot sa pagbubuklod ng 2GBI29, ginamit namin ang V109A mutant bilang isang kontrol (Fig. 3b).
(a) Iminungkahing Hv1 residues na kasangkot sa guanidine derivative binding. Ang mga putol-putol na asul na kurba ay pumapalibot sa mga dating iminungkahing side chain na nakikipag-ugnayan sa iba't ibang bahagi ng compound 2GBI29.(bf) Concentration-dependent inhibition ng ipinahiwatig na Hv1 mutants ng mga compound na 2GBI (cyan) at GBTA ( madilim na pula). Ang bawat punto ay kumakatawan sa ibig sabihin ng pagsugpo ng 3 hanggang 12 mga sukat ± SD V109 bilang negatibong kontrol. Ang mga kurba ay Hill fit na ginagamit upang makakuha ng maliwanag na mga halaga ng Kd (tingnan ang Karagdagang Talahanayan 1). Ang mga koepisyent ng Hill (h) na ipinapakita sa ang mga inset histogram ay natukoy mula sa mga akma na iniulat sa Mga Karagdagang Fig 3 at 4. Ang mga halaga ng sanggunian h para sa Hv1 WT ay ipinapakita bilang mga dashed na linya. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng makabuluhang pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mutant at WT na mga sipi (p Natagpuan namin na ang mutation ng D112E ay makabuluhang nabawasan ang koepisyent ng Hill (p Ang paghahanap na ang koepisyent ng Hill para sa GBTA binding ay mas mataas kaysa sa 1 sa Hv1 dimer at nagiging ~1 sa monomeric channel (Fig. 2b) ay pare-pareho sa pagkakaroon ng allosteric na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga nagbubuklod na site sa dalawang subunits. Kung ito ay ang kaso, ang Hill coefficient ng GBTA na nagbubuklod sa dimer kung saan ang blocker ay nakatali sa isang subunit ay dapat na ~1. Sinubukan namin ang hulang ito sa Hv1 F150A-WT na naka-link na dimer (Fig. 4a), kung saan ang affinity ng F150A subunit para sa GBTA ay higit sa 2 order ng magnitude na mas mataas kaysa sa WT subunit (Fig. 1c at 3d). Pagkatapos ay sinukat namin ang mga curve ng pagtugon sa konsentrasyon para sa pagsugpo ng WT subunit sa isang basal na konsentrasyon ng 2 μM GBTA. Sa konsentrasyong ito , ang blocker ay inaasahang magbibigkis ng humigit-kumulang 99% ng F150A subunit at (a) Schematic diagram ng F150A-WT junction dimer na ginamit upang buuin ang nakaharang na hemichannel ({F150A}b-WT/BAO*). Ipinapakita ng mga puting diamante ang lokasyon ng mutation. Sa mga estado ng BAO* at BA*B*, ang affinity ng F150A subunit ay inaasahang mas mataas kaysa sa WT subunit.(b) Proton currents mula sa F150A-WT channels na sinusukat bilang tugon sa mga pagbabago sa membrane potential mula −80 mV hanggang +120 mV.pHi = pHo = 6.0 .Ang mga grey na bakas ay kumakatawan sa mga alon na sinusukat sa kawalan ng inhibitor. Ang itim na bakas (kontrol) ay kumakatawan sa kasalukuyang sinusukat pagkatapos ng pagdaragdag ng 2 μM GBTA. Sa konsentrasyong ito, ang WT subunit ay hindi makabuluhang napigilan, samantalang ang F150A subunit ay halos ganap na nakatali sa GBTA ({F150A}b-WT). Ang karagdagang pagtaas sa konsentrasyon ng GBTA ay nagresulta sa pagbara ng WT subunit (orange at pulang bakas).(c) Concentration-dependent inhibition ng {F150A}b-WT dimer (inhibitor pre-bound to F150A subunit). Ang bawat punto ay kumakatawan sa mean inhibition ± SD ng 3 hanggang 7 na sukat. Ang mga kurba ay Hill fit na ginamit upang makuha ang maliwanag na mga halaga ng Kd na iniulat sa Karagdagang Talahanayan 1. Ang mga koepisyent ng Hill na ipinakita sa inset histograms ay tinutukoy mula sa mga akma na iniulat sa Mga Pandagdag na Figs 3 at 4. Ang mga h value ng Hv1 WT ay ipinapakita bilang mga dashed na linya. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa istatistika kumpara sa WT dimer Hv1 (p Dahil ang GBTA inhibition ng Hv1 ay sinusukat sa open channel, nangatuwiran kami na ang GBTA binding cooperativity ay maaaring gamitin para pag-aralan ang mekanismo ng intersubunit coupling sa open state. Ang dalawang Hv1 subunit na ito ay dating natagpuang cooperatively gated 19,20,21, 22 at ang intersubunit coupling na kasangkot sa gating ay iminungkahi na ipamagitan ng cytoplasmic coiled-coil domain (CCD) 22, 25. Samakatuwid, tinanong namin kung ang CCD ay kasangkot din sa pagsasama sa pagitan ng mga site na nagbubuklod ng GBTA sa bukas na estado.Triglycine Ang mga mutasyon sa interface sa pagitan ng S4 transmembrane fragment at ng coiled-coil domain ay ipinakita sa mga naunang pag-aaral upang i-decouple ang domain na ito mula sa natitirang bahagi ng channel habang pinapanatili ang integridad ng dimerization. Samakatuwid, sinubukan namin ang epekto ng mutations V220G, K221G at T222G (Fig .5a, GGG mutant) sa GBTA binding cooperativity. Nakakita kami ng hindi gaanong istatistika (p > 0.05) na pagbaba sa Hill coefficient ng GBTA na nagbubuklod sa mga channel ng GGG kumpara sa wild type (Fig. 5c), na nagmumungkahi na sa kabila ng papel nito sa pagpapanatili ng dalawang subunits na magkasama ay mahalaga, ngunit ang CCD ay hindi direktang namamagitan sa intersubunit allosteric coupling sa pagitan ng GBTA binding sites.
(a) Schematic diagram ng Hv1 dimer na may triglycine mutation sa panloob na dulo ng S4 na idinisenyo upang guluhin ang intersubunit coupling na pinapamagitan ng cytoplasmic coiled-coil domain (asul na mga arrow).(b) Schematic na representasyon ng Hv1 dimer at ligation dimer na may ipinahiwatig na mga mutasyon, na idinisenyo upang subukan ang mga fragment ng S1 na kasangkot sa pagsasama sa pagitan ng mga subunit (asul na mga arrow).(c–h) Ang 2GBI (cyan) at GBTA (madilim na pula) ay humahadlang sa ipinahiwatig na mga konstruksyon sa paraang nakadepende sa konsentrasyon. Ang bawat punto ay kumakatawan sa ibig sabihin ng pagsugpo ± SD ng 3 hanggang 10 sukat. Ang kurba ay isang Hill fit na ginamit upang makakuha ng maliwanag na mga halaga ng Kd (tingnan ang Karagdagang Talahanayan 1). Ang mga koepisyent ng burol sa interpolated histograms ay tinutukoy tulad ng inilarawan sa seksyong Mga Paraan (tingnan ang Mga Pandagdag na Fig 3 at 4). Mga halaga ng sanggunian h para sa Ang Hv1 WT ay ipinapakita bilang mga dashed na linya. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng makabuluhang pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mutant at WT na mga sipi (p Dahil inalis namin ang CCD bilang direktang tagapamagitan ng GBTA cooperative binding, tinanong namin kung ang mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga VSD ay kasangkot sa allosteric coupling sa pagitan ng mga nagbubuklod na site. sa S1 transmembrane segment. Ang S1 ay naglalaman ng dalawang iba pang negatibong sisingilin na residues, E119 at D123, na matatagpuan sa parehong bahagi ng helix bilang D112, ngunit mas malapit sa panlabas na dulo 24 ng fragment. Ang mga simulation ng maagang molecular dynamics ay nagpahiwatig na ang mga residue na ito ay na-link sa D112 sa pamamagitan ng waterlines36,37. Samakatuwid, sinubukan namin kung ang E119 at D123 ay kasangkot sa allosteric coupling sa pagitan ng GBTA-binding sites (Fig. 5b). ngunit sa kabilang panig ng S1 helix (Larawan 5b).
Sinusukat namin ang pagsugpo na umaasa sa konsentrasyon ng E119A, D123A at K125A na mga channel ng 2GBI at GBTA at nalaman na ang E119A at K125A mutations ay hindi makabuluhang binago ang Hill coefficient ng alinmang inhibitor kumpara sa wild type (p > 0.05, Fig. 5d,i ) ). Sa kabilang banda, ang mutation D123A ay makabuluhang nabawasan ang Hill coefficient ng GBTA (p 0.05/14).
Dahil ang pag-neutralize sa singil sa posisyon 123 sa parehong mga subunit ay nagresulta sa isang malakas na pagbabago sa GBTA binding cooperativity, habang ang pag-reverse ng charge sa parehong mga subunit ay nagkaroon lamang ng maliit na epekto, pinalawig namin ang pagsusuri upang isama lamang ang isang subunit na may inversion channel ng pagsingil. Kami nakabuo ng Hv1-linked dimer na may D123R substitution sa C-terminal subunit (Fig. 5b) at sinukat ang concentration-response inhibition ng GBTA at 2GBI. Nalaman namin na ang Hill coefficient ng GBTA na nagbubuklod sa WT-D123R channel ay mas mataas kaysa doon ng wild-type na Hv1 (p Nalaman din namin na tinanggal ng D112E mutation ang pagtaas sa GBTA-binding Hill coefficient na ginawa ng WT-D123R background (Fig. 5b, h at Supplementary Fig. 4). Ang epekto sa Hill coefficient ng 2GBI binding ay inalis din ( Fig. 5h at Supplementary Fig. 3). Iminumungkahi ng mga natuklasang ito na ang pinahusay na allosteric coupling sa pagitan ng mga subunit na sanhi ng magkasalungat na singil sa posisyon 123 ay hindi isinasalin sa mas malakas na binding cooperativity kapag ang binding site sa posisyon D112 ay nabalisa.
Nangatuwiran kami na kung ang mga nalalabi ng D123 sa mga katabing bukas na mga subunit ay sapat na malapit upang makipag-ugnay sa electrostatically sa isa't isa, ang nakakasuklam na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga negatibong singil ay mai-convert sa isang kumbinasyon ng mga negatibo at positibong singil sa pamamagitan ng pagpapalit ng aspartic acid sa arginine. kaakit-akit na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga ito.Isang subunit (WT-D123R dimer).Maaaring palakasin ng mga kaakit-akit na pakikipag-ugnayan ang interface sa pagitan ng mga panlabas na dulo ng fragment ng S1, na humahantong sa mas malakas na allosteric coupling sa pagitan ng mga subunit at nadagdagan ang kooperatibidad na nagbubuklod ng GBTA.
Upang suportahan ang hypothesis na ito, naghanap kami ng paraan upang palakasin ang interface sa pagitan ng mga panlabas na dulo ng S1 segment, na naiiba sa paglipat ng singil sa posisyon 123. Lee et al. Nauna nang natagpuan ang mutation ng Hv1 residue I127 sa cysteine upang magresulta sa spontaneous intersubunit cross-linking17. Higit pa rito, ang kristal na istraktura ng Hv1-CiVSP chimeric VSD ay nagpahiwatig na ang I127 ay pinaghihiwalay mula sa panlabas na dulo ng S1 helix ng isang residue lamang. cysteinees sa posisyon 127, na inaasahang magreresulta sa mas malakas na pakikipag-ugnayan ng S1-S1, ay may epekto sa GBTA binding cooperativity na katulad ng naobserbahan sa pamamagitan ng pagbabago ng charge sa posisyon 123 .
Sinusukat namin ang pagsugpo na umaasa sa konsentrasyon ng Hv1 I127C ng GBTA at 2GBI sa presensya at kawalan ng 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fig. 6a). Kasabay ng pagdaragdag ng inhibitor sa intracellular solution, ang pagbabawas. Ang ahente ay idinagdag sa extracellular solution. Ang isang naka-link na dimer na may pagpapalit ng cysteine sa isang subunit lamang (WT-I127C) ay ginamit bilang isang negatibong kontrol (Larawan 6a). Hindi namin nasukat ang anumang epekto ng kusang intersubunit na cross-linking sa pagitan ng mga subunit ng I127C sa pagsugpo sa 2GBI, dahil ang koepisyent ng Hill para sa I127C na nagbubuklod sa Hv1, mayroon o walang βME, ay makabuluhang naiiba mula doon para sa pagbubuklod sa mga monocysteine substituted dimer. Ang koepisyent ng Hill ay hindi makapag-iba ng WT-I127C (Larawan 6b at Karagdagang Larawan. 3). Sa lubos na kaibahan, sinukat namin ang dramatikong epekto ng kusang intersubunit na crosslinking sa pagsugpo sa GBTA. Ang koepisyent ng Hill para sa pagbubuklod sa Hv1 I127C sa kawalan ng βME (crosslink on) ay makabuluhang mas mataas kaysa sa sinusukat sa pagkakaroon ng βME (crosslink off) o paggamit ng WT-127C upang maiugnay ang dimer (sa kawalan ng crosslink) (Larawan 6c at Karagdagang Fig. 4), na nagpapahiwatig na ang allosteric coupling sa pagitan ng mga nagbubuklod na site ay lubos na pinahusay ng pagbuo ng mga disulfide bond sa pagitan ng mga panlabas na dulo ng mga fragment ng S1. Sinusuportahan ng mga resultang ito ang aming interpretasyon na ang kaakit-akit na electrostatic na pakikipag-ugnayan ng aspartate at arginine sa posisyon 123 sa WT-D123R dimer ay nagreresulta sa pagtaas ng allosteric coupling sa pagitan ang mga subunit.
Ang open-state coupling ay pinapamagitan ng direktang pisikal na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga panlabas na dulo ng S1 segment sa dalawang subunit.
(a) Schematic na representasyon ng mutant Hv1 dimer at linker dimer, na idinisenyo upang imbestigahan kung paano nakakaapekto ang intersubunit cysteine crosslinks sa GBTA binding cooperativity.(bd) Concentration-dependent inhibition ng mga ipinahiwatig na construct ng 2GBI (b,d) at GBTA (c, e) sa pagkakaroon o kawalan ng 10 mM βME sa extracellular solution. Ang bawat punto ay kumakatawan sa mean inhibition ± SD ng 3 hanggang 10 na sukat. Ang curve ay isang Hill fit na ginamit upang makakuha ng mga halaga ng Kd (tingnan ang Karagdagang Talahanayan 1). sa pagitan ng iba't ibang kundisyon ng pagsugpo sa GBTA (p 0.05).
Natagpuan din namin na sa kawalan ng βME, ang koepisyent ng Hill ng GBTA na nagbubuklod sa D112E I127C Hv1 dimer ay makabuluhang mas mataas kaysa sa sinusukat sa pagkakaroon ng mga ahente ng pagbabawas (Larawan 6e at Karagdagang Fig. 4), na nagpapahiwatig na ang D112E mutation ay hindi inalis ang pagtaas sa GBTA binding cooperativity na nagreresulta mula sa cross-linking ng cysteine 127. Ang Hill coefficient ng 2GBI binding sa D112E, I127C Hv1 dimer ay hindi rin gaanong naapektuhan ng D112E mutation (Larawan 1).6d at Karagdagang Larawan 3).
Kung sama-sama, iminumungkahi ng mga natuklasang ito na ang pagbubuklod ng GBTA ay pinahusay ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga panlabas na dulo ng mga fragment ng S1 sa katabing mga subunit ng Hv1 sa pamamagitan ng mga kaakit-akit na pakikipag-ugnayan ng electrostatic o sa pamamagitan ng pagbuo ng mga covalent bond sa pagitan ng mga substituted cysteines na Allosteric coupling sa pagitan ng mga site ay tumataas at nagreresulta sa nagbubuklod na kooperatiba. Habang ang epekto ng kaakit-akit na pakikipag-ugnayan ng electrostatic sa cooperativity ay maaaring alisin sa pamamagitan ng mutation D112E, ang epekto ng covalent bond ay hindi maaaring.
Sa aming paggalugad ng chemical space na magagamit para sa pagbubuklod ng guanidine derivatives sa Hv1 channels, nalaman namin na ang 2-guanidinothiazoles tulad ng GBTA ay may mas steeper concentration dependence kaysa sa 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c) .The Hill coefficient analysis ng GBTA binding sa parehong dimeric at monomeric channels (Fig. 2a,b) at sa dimeric channel kung saan ang isang subunit ay pre-bound sa inhibitor (Fig. 4) ay humantong sa amin upang tapusin na ang pagsugpo ng Hv1 ng GBTA Ang aksyon ay isang synergistic na proseso, at allosterically coupled ang mga nagbubuklod na site ng mga compound sa dalawang subunit. Ang pagtuklas na ang GBTA ay nagbubuklod sa bukas na channel, tulad ng ipinakita dati para sa nauugnay na tambalang 2GBI32, ay nagmumungkahi na ang allosteric coupling ay maaaring partikular na masuri sa bukas na estado. Ang aming cooperative binding model nagawang ilarawan ang dami ng pagsugpo sa Hv1 ng GBTA (Fig. 2c) at ipaliwanag ang iba't ibang epekto ng 2GBI at GBTA sa pagkabulok ng mga alon ng buntot ng channel pagkatapos ng repolarization ng lamad, na sumusuporta sa aming interpretasyon ng proseso ng pagbubuklod.
Ang pinakamataas na koepisyent ng Hill na maaaring makamit sa isang allosteric na protina na may dalawang binding site (tulad ng Hv1) ay 2. Sinukat namin ang GBTA upang itali ang Hv1 wild-type na may coefficient na 1.31, na tumaas sa 1.88 sa Hv1 I127C.Ang synergistic na libreng enerhiya, ang pagkakaiba sa pagitan ng mga nagbubuklod na libreng enerhiya ng pinakamababa at pinakamataas na affinity site (tingnan ang Mga Paraan), ay 1.3 kcal/mole sa kaso ng Hv1 wild-type at 2.7 kcal/mole sa kaso ng Hv1 I127C. Ang pagbubuklod ng oxygen sa hemoglobin ay ang pinakatanyag at mahusay na pinag-aralan na halimbawa ng collaborative na proseso38.Para sa hemoglobin ng tao (isang tetramer na may apat na allosterically coupled binding sites), ang Hill coefficient ay umaabot mula 2.5-3.0, na may mga halagang mula 1.26 hanggang 3.64 kcal/mol, depende sa mga eksperimentong kundisyon38. Kaya, sa mga tuntunin ng global energetics, ang kooperatibidad ng GBTA na nagbubuklod sa Hv1 ay hindi gaanong naiiba sa O2 na nagbubuklod sa hemoglobin kapag ang magkaibang bilang ng mga subunit ng protina sa dalawang sistema ay isinasaalang-alang.
Sa aming modelo ng synergy, ang pagbubuklod ng mga molekula ng GBTA sa isang subunit ay nagreresulta sa pagtaas ng pagkakaugnay na pagkakaugnay ng katabing subunit. Naiisip namin ang isang proseso kung saan ang muling pagsasaayos ng kapaligirang nagbubuklod na nagreresulta mula sa unang kaganapang nagbubuklod (induced fit) ay humahantong sa mga pagbabago sa mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga subunit. Bilang tugon sa mga pagbabagong ito, binabago ng mga katabing subunit ang kanilang mga binding site, na nagreresulta sa mas mahigpit na pagbubuklod ng GBTA. Sa prosesong ito, ang S1 aspartate D112 ay may pananagutan para sa muling pagsasaayos ng binding site na nauugnay sa tumaas na pagkakaugnay-ugnay.D112 ay dati nang ipinakita bilang bahagi ng Hv1 proton permeation pathway at kumilos bilang selectivity filter27,28. Ipinapakita ng aming mga resulta na ang mga selectivity filter sa dalawang Hv1 subunits ay allosterically na pinagsama sa open state. Ipinapakita ng Figure 7a ang tinatayang lokasyon ng GBTA binding site at ang lokasyon ng mga residue D112, D123, K125 at I127 sa isang schematic ng Hv1 VSD based sa kristal na istraktura ng Hv1-CiVSP chimera. Ang mga iminungkahing direksyon para sa allosteric coupling na kinasasangkutan ng extracellular na dulo ng S1 ay ipinapakita na may mga itim na arrow.
(a) Schematic ng Hv1 VSD.Batay sa kristal na istraktura ng Hv1-CiVSP chimera, ang mga helical na segment ay ipinapakita na cylindrical. Ang mga hinulaang lokasyon ng nakatali na GBTA ay ipinapakita bilang mga gray na oval. Ang mga itim na arrow ay nagpapahiwatig ng mga pathway na kasangkot sa allosteric coupling sa pagitan ng mga binding site sa dalawang katabing subunit. sa dalawang magkaibang dimer configuration gaya ng nakikita mula sa extracellular side ng membrane plane. Sa kaliwang panel, ang dimer interface ay nabuo ng S4 helix. Ang pag-ikot ng dalawang VSD 20 degrees clockwise sa paligid ng isang axis na patayo sa membrane plane, na sinamahan ng ang paghihiwalay ng mga panlabas na dulo ng dalawang S4 helice (mga dashed arrow), ay gumagawa ng kaayusan na ipinapakita sa kanan. Sa pagsasaayos na ito, ang mga residue D123 at I127 mula sa magkatabing mga subunit ay pinapayagang magkalapit.(c) Schematic na representasyon ng CiVSP VSD sa dimer configuration na makikita sa 4G80 crystal structure. Posisyon P140 sa CiVSP ay tumutugma sa posisyon D123 sa Hv1.
Ipinapakita ng aming mga resulta na ang repulsive electrostatic interaction sa pagitan ng residue 123 (123D/123D o 123R/123R) ay nauugnay sa isang "normal" na antas ng GBTA-binding cooperativity sa open state at inililipat ang pakikipag-ugnayan mula sa repulsion patungo sa Attracted (123D/123R) , nadagdagan ang kooperasyon (Larawan 5g). Inaasahan na ang pag-alis ng salungat na pakikipag-ugnayan sa pagpapalit ng alanine ay hahantong din sa pagtaas ng kooperatiba. Gayunpaman, ang pagbaba sa kooperatiba ng 123A/123A dimer ay naobserbahan (Larawan 5e). Ang paliwanag ay ang destabilizing effect ng paglalagay ng hydrophobic residues sa isang hydrophilic na kapaligiran ay maaaring mas malaki kaysa sa stabilizing effect dahil sa pag-aalis ng mga salungat na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng D123 residues, na nagreresulta sa isang pangkalahatang pagbawas sa nagbubuklod na kooperatiba. Mony et al.39 kamakailan ay nag-ulat na ang solvent accessibility sa ang posisyon D171 ng Ciona gutis Ci-Hv1 (naaayon sa D123 sa Hv1 ng tao) ay nadagdagan sa pag-activate, na sumusuporta sa paniwala na ang D123 ay matatagpuan sa isang hydrophilic na kapaligiran sa bukas na estado.
Ang pag-gating ng mga Hv1 channel ay kilala na nagaganap sa pamamagitan ng maramihang mga transition19,20,26,39,40,41. Nalaman ng Qiu et al26 na sa depolarization ng lamad, ang boltahe sensor ng Ci-Hv1 ay sumasailalim sa pagbabago ng conformational na nag-iiwan sa channel na aktibo ngunit nakasara pa rin. , na sinusundan ng isang natatanging transition na nagiging sanhi ng mga proton na magbukas ng pagpapadaloy sa parehong landas ng mga subunit. Ang pagbabago ng conformational ng sensor ng boltahe ay sinusubaybayan ng fluorescence ng boltahe-clamp, at nalaman na ang pangalawang paglipat ay piling nababagabag ng mutation sa posisyon D171. Ang perturbation ng fluorescent signal ay pare-pareho sa pagkakaroon ng electrostatic interaction sa pagitan ng D171 residues ng mga katabing subunits sa ilang punto kasama ang reaction coordinates ng conformational change. Ang interpretasyong ito ay pare-pareho sa aming natuklasan na ang D123 residue electrostatically interaksyon sa open state. at namamagitan sa allosteric coupling sa pagitan ng GBTA binding sites.
Iminungkahi ng Fujiwara et al25 na ang dimer interface ng cytoplasmic coiled-coil domain ay umaabot sa lamad upang maglaman ng dalawang S4 helices (Fig. 7b, kaliwang panel). Ang isang modelo ng intersubunit na interaksyon na ito ay batay sa cysteine cross-linking analysis na sumasaklaw sa ang buong VSD at functional analysis ng rehiyon na nagkokonekta sa S4 helix at CCD. Kung walang transmembrane pH gradient, ang mga Hv1 channel ay nangangailangan ng malaking depolarization ng lamad upang mabuksan, at ang cysteine crosslinking ay nangyayari sa ilalim ng mga kondisyon kung saan ang channel ay higit na nakasara. Samakatuwid, ang nakitang interface ng S4-S4 ay malamang na sumasalamin sa pagsasaayos ng mga subunit sa labas ng estado. Ang ibang mga pag-aaral ay nakahanap ng ebidensya para sa pagkakasangkot ng S1 at S2 sa mga intersubunit na pakikipag-ugnayan sa panahon ng gating17,21,26 na nagmumungkahi na ang mga channel ay maaaring magpatibay ng iba't ibang mga pagsasaayos ng subunit sa bukas at saradong estado, isang ideya na naaayon sa mga natuklasan ni Mony et al. S1 gumagalaw 39 sa panahon ng gating.
Dito, ipinapakita namin na, sa bukas na estado, ang mga extracellular na dulo ng S1 helix ay sapat na malapit upang suportahan ang mga direktang electrostatic na pakikipag-ugnayan na namamagitan sa allosteric coupling sa pagitan ng mga subunit. bukod sa isa't isa upang direktang makipag-ugnayan. Gayunpaman, ang 20° clockwise na pag-ikot ng dalawang VSD subunit sa paligid ng isang axis na patayo sa membrane plane, na sinamahan ng paghihiwalay ng mga panlabas na dulo ng dalawang S4 helice, ay nagbunga ng pare-parehong configuration ng S1-S1 kasama ang aming mga natuklasan (Larawan 7b, kanang panel). Inirerekomenda namin ang configuration na ito para sa channel sa bukas na estado.
Bagama't ang CiVSP enzyme ay naisip na gumana bilang isang monomer, ang kristal na istraktura ng nakahiwalay na VSD nito ay nakuha sa isang dimer na estado. Ang mga panlabas na dulo ng S1 helice sa dimer na ito ay spatially na magkakadikit, at ang pangkalahatang configuration ay katulad ng iminungkahing para sa Hv1 (Larawan 7c). Sa CiVSP dimer, ang pinakamalapit na nalalabi mula sa katabing subunit ay proline sa posisyon 140 (Larawan 7c). Kapansin-pansin, ang P140 sa CiVSP ay tumutugma sa posisyon D123 sa Hv1. at ang mga dimer ng CiVSP ay nagmumungkahi na ang mga VSD ng mga protina na ito ay may likas na hilig na bumuo ng isang interface kung saan nakikipag-ugnayan ang mga extracellular na dulo ng S1.
Ang mahalagang papel na ginagampanan ng Hv1 sa sperm cell activation ay ginagawang kaakit-akit na target ng gamot ang channel na ito para kontrolin ang pagkamayabong ng lalaki. Higit pa rito, ang pag-activate ng Hv1 sa microglia ay ipinakita upang lumala ang paggaling mula sa ischemic stroke. Ang pinahusay na aktibidad ng Hv1 ay natagpuang nauugnay sa mas mababang kaligtasan ng buhay sa mga pasyenteng may breast 12 o colorectal cancer 13 at naisip na nag-aambag sa B-cell malignancies 11 . Samakatuwid, ang mga maliliit na molekula na gamot na nagta-target sa Hv1 ay maaaring gamitin bilang mga neuroprotective agent o anticancer therapeutics. bukas na Hv1 subunit, na humahantong sa tumaas na pagkakaugnay-ugnay, ay maaaring humantong sa pagbuo ng mas makapangyarihang mga gamot na nagta-target sa mga Hv1 channel.
Ang mutagenesis na nakadirekta sa site ng Hv1 ng tao ay isinagawa gamit ang karaniwang mga pamamaraan ng PCR. Sa Hv1NCCiVSP construct, ang mga residue 1-96 at 228-273 ng Hv1 ay pinalitan ng mga residue 1-113 at 240-576 ng CiVSP18. Sa Hv1-linked dimer, ang C-terminus ng isang subunit ay naka-link sa N-terminus ng pangalawang subunit sa pamamagitan ng GGSGGSGGSGSGGSGG linker. Ang pGEMHE plasmids na naglalaman ng iba't ibang mga construct ay na-linearize sa Nhe1 o Sph1 restriction enzymes (New England Biolabs) at RNA synthesis ay isinagawa kasama ang T7 mMessage mMachine transcription kit (Ambion) mula sa Ecocyte Bioscience. Kasunod ng RNA injection, ang mga cell ay pinananatili sa ND96 medium na naglalaman ng 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gentamicin, pH 18°C.2. .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole[2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- Ang 5-carboxylate [9] at (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate [10] ay mula sa Sigma-Aldrich. Ang Famotidine [7] ay mula sa MP Biomedicals.1-[4 -(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] at 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-yl]guanidine [12] ay mula sa Matrix Scientific.Ang mga compound na ito ay may pinakamataas na kadalisayan na magagamit sa komersyo. Ang mga ito ay natunaw sa tuyong DMSO upang makabuo ng 100 mM stock solution, na pagkatapos ay diluted sa recording solution sa nais na panghuling konsentrasyon. Ang mga compound 3 at 4 ay na-synthesize sa ibaba ng hindi bababa sa 99% na kadalisayan.
Sa isang suspensyon ng 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) sa 25 mL ng aqueous hydrochloric acid (2.5 N) ay idinagdag solid dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), at ang nagresultang heterogenous mixture ay refluxed na may malakas na pagpapakilos para sa 4 na oras. Ang reaksyon timpla ay cooled sa room temperatura at neutralized sa pamamagitan ng unti-unting pagdaragdag ng 10N potassium hydroxide. Ang puting precipitate nabuo ay sinala, hugasan ng malamig na tubig (3 × 50 ml), tuyo sa isang oven ( 65 °C) sa loob ng ilang oras, at pagkatapos ay i-recrystallize mula sa ethyl acetate/petroleum ether upang magbigay ng puting solid (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (liwanag 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (napakalawak na s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z na nakalkulang halaga. Para sa C9H8F3N4S (M + H)+ nahanap: 261,0. : 261.0419.
Ang Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), na synthesize gaya ng naunang inilarawan, ay pinainit hanggang 200 °C sa isang oil bath sa isang maliit na test tube.300 mg (malaking labis) cyanamide at 1.0 ml conc. Sa mainit na tambalan ay mabilis na idinagdag ang hydrochloric acid at ang pinaghalong ito ay itinago sa oil bath para sa mga 2 minuto, kung saan ang karamihan sa tubig ay sumingaw. ay pinaghiwa-hiwalay at hinugasan ng tubig upang magbigay ng maputlang dilaw na amorphous solid.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d , 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9.122.7 , natagpuan: 243.0704.
Ang mga alon ng proton ay sinusukat sa panloob at panlabas na mga patch ng mga oocytes na nagpapahayag ng iba't ibang mga konstruksyon gamit ang isang Axopatch 200B amplifier na kinokontrol ng isang Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) na may pClamp10 software. Ang mga intracellular at extracellular na solusyon ay may parehong komposisyon: 100 mM 2-(N-morpholino). )ethanesulfonic acid (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM TEA chloride, 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), inayos sa pH 6.0 na may TEA hydroxide. Ang lahat ng mga sukat ay isinagawa sa 22 ± 2 °C. Ang pipette ay may access resistance na 1.5–4 MΩ. Ang mga kasalukuyang bakas ay na-filter sa 1 kHz, na-sample sa 5 kHz at nasuri gamit ang Clampfit10.2 (Molecular Devices ) at Origin8.1 (OriginLab).
Ang mga solusyon na naglalaman ng iba't ibang konsentrasyon ng Hv1 inhibitor at sa ilang mga kaso 10 mM βME ay ipinakilala sa paliguan sa pamamagitan ng gravity sa pamamagitan ng manifold na konektado sa isang VC-6 perfusion valve system (Warner Instr.), na ipinasa sa pClamp software TTL (Transistor- Mga signal ng Transistor Logic. Ang mga eksperimento sa mabilis na perfusion ay isinagawa gamit ang isang multi-tube perfusion pencil (AutoMate Sci.) na may 360 μm diameter na tip sa paghahatid na naka-mount sa harap ng isang patch pipette. Ang channel inhibition ay tinutukoy ng isochronal amperometric measurements sa dulo ng +120 mV depolarizing pulse. Ang mga pagsukat ng GV ay isinagawa gaya ng naunang inilarawan18,20. Ang mga alon ng buntot ay naitala sa -40 mV pagkatapos ng mga hakbang ng depolarization sa iba't ibang mga boltahe mula -20 mV hanggang +120 mV maliban kung iba ang nakasaad. Ang reference pulse na nauuna sa test pulse ay ginamit upang itama para sa kasalukuyang pagkabulok 18 . Ang GV graph ay umaangkop sa Boltzmann equation:
Ang maliwanag na dissociation constants (Kd) para sa iba't ibang kumbinasyon ng mga channel at inhibitor (Karagdagang Talahanayan 1) ay natukoy sa pamamagitan ng pag-angkop sa pag-asa sa konsentrasyon ng pagsugpo (ibig sabihin %inhib na mga halaga) sa equation ng Hill:
kung saan ang [I] ay ang konsentrasyon ng inhibitor I at h ay ang Hill coefficient. Upang kalkulahin ang Hill coefficient, ang equation (2) ay muling inayos bilang:
Oras ng post: Hun-07-2022
