การสอบปากคำอินเทอร์เฟซระหว่างหน่วยย่อยของช่องโปรตอน Hv1 แบบเปิดพร้อมโพรบคู่แบบอัลโลสเตอรี

ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจ สนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ช่องโปรตอนที่มีรั้วรอบขอบชิด Hv1 เป็นคอมเพล็กซ์ไดเมอริกที่ประกอบด้วยโดเมนตรวจจับแรงดันไฟฟ้า (VSD) สองโดเมน ซึ่งแต่ละโดเมนมีวิถีการซึมผ่านของโปรตอนที่มีรั้วรอบขอบชิด การแบ่งขนาดจะถูกควบคุมโดยโดเมนขดขดของไซโตพลาสซึม การเปลี่ยนจากสถานะปิดเป็น สถานะเปิดใน VSD ทั้งสองเป็นที่รู้กันว่าเกิดขึ้นร่วมกัน อย่างไรก็ตาม ยังไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับกลไกที่ซ่อนอยู่ ส่วนต่อประสานระหว่างหน่วยย่อยมีบทบาทสำคัญในกระบวนการอัลโลสเตอริก อย่างไรก็ตาม อินเทอร์เฟซดังกล่าวไม่ได้รับการระบุในช่อง Hv1 แบบเปิด ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าอนุพันธ์ 2-guanidinothiazole บล็อก Hv1 VSD สองตัวในลักษณะที่ให้ความร่วมมือ และใช้หนึ่งในสารประกอบเหล่านี้เป็นโพรบสำหรับการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric ระหว่างหน่วยย่อยแบบเปิด เราพบว่านอกเซลล์ ส่วนท้ายของชิ้นส่วนเมมเบรนแรกของ VSD จะสร้างอินเทอร์เฟซระหว่างหน่วยย่อยที่เป็นสื่อกลางในการมีเพศสัมพันธ์ระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพัน ในขณะที่โดเมนคอยล์คอยล์ไม่เกี่ยวข้องโดยตรงในกระบวนการนี้ นอกจากนี้เรายังพบหลักฐานที่ชัดเจนว่าตัวกรองแบบเลือกโปรตอนของแชนเนลควบคุมความร่วมมือที่มีผลผูกพันกับตัวบล็อก .
ช่องโปรตอนที่มีรั้วรอบขอบชิดมีบทบาทสำคัญในสิ่งมีชีวิตหลากหลายประเภท ตั้งแต่แพลงก์ตอนพืชไปจนถึงมนุษย์1.ในเซลล์ส่วนใหญ่ ช่องเหล่านี้ทำหน้าที่เป็นสื่อกลางในการไหลเวียนของโปรตอนจากเยื่อหุ้มโปรตอน และควบคุมการทำงานของ NADPH oxidase ช่องโปรตอนที่มีรั้วรอบขอบชิดเพียงช่องเดียวที่รู้จักในมนุษย์ คือ Hv1 ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ของยีน HVCN12,3.Hv1 (หรือที่เรียกว่า VSOP) แสดงให้เห็นว่ามีบทบาทในการเพิ่มจำนวนเซลล์บี4 การผลิตสายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาโดยระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ5,6,7,8, เซลล์อสุจิ การเคลื่อนไหว 9 และการควบคุม pH ของของเหลวบนทางเดินหายใจ 10 ช่องนี้เกี่ยวข้องกับการแสดงออกมากเกินไปในมะเร็งหลายประเภท เช่น มะเร็งบีเซลล์4,11 และมะเร็งเต้านมและมะเร็งลำไส้ใหญ่12,13 พบว่ากิจกรรมของ Hv1 ที่มากเกินไปจะเพิ่มศักยภาพในการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง 11, 12 ในสมอง Hv1 แสดงออก โดย microglia และกิจกรรมของมันแสดงให้เห็นว่าทำให้ความเสียหายของสมองรุนแรงขึ้นในรูปแบบของโรคหลอดเลือดสมองตีบ
โปรตีน Hv1 มีโดเมนการตรวจจับแรงดันไฟฟ้า (VSD) ซึ่งประกอบด้วยส่วนของทรานส์เมมเบรนสี่ส่วนที่เรียกว่า S1 ถึง S414 VSD มีลักษณะคล้ายกับโดเมนที่สอดคล้องกันของช่อง Na+, K+ และ Ca2+ ที่ควบคุมแรงดันไฟฟ้า และฟอสฟาเตสที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้า เช่น CiVSP จาก Ciona gutis15 ในโปรตีนอื่นๆ เหล่านี้ ปลาย C ของ S4 ติดอยู่กับโมดูลเอฟเฟกต์ โดเมนของรูพรุน หรือเอนไซม์ ใน Hv1 S4 เชื่อมโยงกับโดเมนขดขด (CCD) ซึ่งอยู่ที่ด้านไซโตพลาสซึมของเมมเบรน ช่องนี้เป็นไดเมอริกคอมเพล็กซ์ที่ประกอบด้วย VSD สองตัว โดยแต่ละอันมีเส้นทางการซึมผ่านของโปรตอนที่มีรั้วรอบขอบชิด พบว่าหน่วยย่อย Hv1 ทั้งสองนี้เปิดแบบร่วมมือกัน19,20,21,22 โดยแนะนำว่าการมีเพศสัมพันธ์แบบอัลโลสเตริกและการโต้ตอบระหว่างหน่วยย่อยเล่น มีบทบาทสำคัญในกระบวนการ gating อินเทอร์เฟซระหว่างหน่วยย่อยภายในโดเมนคอยล์ขดถูกกำหนดไว้อย่างดีเนื่องจากโครงสร้างผลึกของโดเมนที่แยกได้ทั้งสองนั้นพร้อมใช้งาน 22,23 ในทางกลับกัน อินเทอร์เฟซระหว่าง VSD ภายในเมมเบรนไม่ได้ เข้าใจดี โครงสร้างผลึกของไคเมอริกโปรตีน Hv1-CiVSP ไม่ได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับส่วนต่อประสานนี้ เนื่องจากการจัดระเบียบไตรเมอริกของแชนเนลเชิงซ้อนที่ตกผลึกอาจเป็นผลมาจากการแทนที่ Hv1 CCD ดั้งเดิมด้วยซิปลิวซีนของยีสต์ GCN424
การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ขององค์กรหน่วยย่อยของช่องสัญญาณ Hv1 ได้ข้อสรุปว่าเอนริเก้ S4 สองตัวเปลี่ยนไปสู่ ​​CCD โดยไม่รบกวนโครงสร้างทุติยภูมิอย่างรุนแรง ส่งผลให้เกิดเอนริเก้ยาวที่เริ่มต้นจากเมมเบรนและโปรเจ็กต์ไปสู่ไซโตพลาสซึม จากการวิเคราะห์การเชื่อมขวางของซิสเทอีน การศึกษานี้เสนอว่า Hv1 VSD ติดต่อซึ่งกันและกันตามเซ็กเมนต์ S4 อย่างไรก็ตาม การศึกษาอื่นๆ ได้เสนออินเทอร์เฟซทางเลือกระหว่าง VSD อินเทอร์เฟซเหล่านี้รวมถึงเซ็กเมนต์ S1 17, 21, 26 และปลายด้านนอกของเซ็กเมนต์ S2 21 เหตุผลที่เป็นไปได้สำหรับความขัดแย้ง ผลลัพธ์ของการศึกษาเหล่านี้คือการตรวจสอบการเชื่อมต่อแบบอัลโลสเตอริกระหว่าง VSD ซึ่งสัมพันธ์กับกระบวนการเกต ซึ่งขึ้นอยู่กับสถานะปิดและเปิด และอินเทอร์เฟซระหว่าง VSD อาจแตกต่างกันไปตามการเปลี่ยนแปลงสถานะที่แตกต่างกันในโครงสร้าง
ที่นี่ เราพบว่า 2-guanidinothiazole ยับยั้งช่องสัญญาณ Hv1 โดยการทำงานร่วมกันกับ VSD ที่เปิดอยู่สองตัว และใช้หนึ่งในสารประกอบ 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) เพื่อตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อยในสถานะเปิด อินเทอร์เฟซ เราพบว่าเส้นโค้งการเชื่อมโยง GBTA สามารถอธิบายได้ดีโดยแบบจำลองเชิงปริมาณซึ่งการเชื่อมโยงของตัวยับยั้งกับหน่วยย่อยหนึ่งส่งผลให้ความสัมพันธ์ในการจับของหน่วยย่อยที่อยู่ติดกันเพิ่มขึ้น เรายังพบว่าสารตกค้าง D112 ซึ่งเป็นตัวกรองการเลือกสรรสำหรับ ช่อง 27, 28 และส่วนหนึ่งของไซต์การจับอนุพันธ์ของ guanidine 29 ควบคุมการทำงานร่วมกันของการจับ GBTA เราแสดงให้เห็นว่าการเชื่อมโยงแบบมีส่วนร่วมนั้นได้รับการบำรุงรักษาในไดเมอร์ Hv1 โดยที่ CCD แยกออกจากเซ็กเมนต์ S4 โดยเสนอแนะว่าอินเทอร์เฟซระหว่างหน่วยย่อยใน CCD ไม่ได้โดยตรง เป็นสื่อกลางในการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric ระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพัน GBTA ในทางตรงกันข้ามเราพบว่าแฟรกเมนต์ S1 เป็นส่วนหนึ่งของอินเทอร์เฟซระหว่างหน่วยย่อยและเสนอการจัดเรียง VSD ที่อยู่ติดกันโดยมีปลายนอกเซลล์ของเกลียว S4 ห่างจากศูนย์กลางของ dimer เพื่อให้ ส่วน S1 ให้อยู่ในสถานะเปิด
สารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กของ Hv1 มีประโยชน์ในฐานะยาต้านมะเร็งและสารป้องกันระบบประสาท อย่างไรก็ตาม ในปัจจุบัน มีสารประกอบเพียงไม่กี่ชนิดที่สามารถยับยั้งช่องสัญญาณได้30,31,32,33 ในจำนวนนั้น 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, สารประกอบ [1] ในรูป .1a) และอนุพันธ์ของมันถูกค้นพบเพื่อปิดกั้นการซึมผ่านของโปรตอน VSD29,32 ผ่านช่องทาง การจับกันของสารประกอบดังกล่าวคิดว่าจะเกิดขึ้นอย่างอิสระในหน่วยย่อยเปิดทั้งสองหน่วย 2-guanidinobenzothiazole (GBTA, สารประกอบ [2] ในรูปที่ 1a) คือ ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้ง Hv1 ได้อย่างมีประสิทธิภาพเกือบเท่ากับ 2GBI เมื่อทดสอบที่ความเข้มข้น 200 μM (รูปที่ 1b) เราตรวจสอบอนุพันธ์ของ thiazole อื่น ๆ และพบว่าบางส่วนยับยั้งช่องทางที่มีความแรงใกล้เคียงกันหรือมากกว่า GBTA (รูปที่ 1 และเสริม) ข้อความ) เราได้กำหนดเส้นโค้งการตอบสนองความเข้มข้นของอนุพันธ์ไทอาโซลสี่ตัว (GBTA และสารประกอบ [3], [6] และ [11], รูปที่ 1c) และพบว่าพวกมันชันกว่าของ 2GBI ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ (h) ของอนุพันธ์ไทอาโซลอยู่ในช่วงตั้งแต่ 1.109 ± 0.040 ถึง 1.306 ± 0.033 (รูปที่. 1c และรูปที่ 1 เพิ่มเติม) ในทางตรงกันข้ามค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สำหรับ 2GBI เท่ากับ 0.975 ± 0.024 29, รูปที่ 2a และรูปที่ 1 เพิ่มเติม) ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ที่สูงกว่า 1 บ่งบอกถึงความร่วมมือที่มีผลผูกพัน เนื่องจากแต่ละหน่วยย่อย Hv1 มีตัวยับยั้งของตัวเอง - ไซต์ที่มีผลผูกพัน,29,32 เราให้เหตุผลว่าการจับของอนุพันธ์ไทอาโซลกับหน่วยย่อยหนึ่งสามารถเพิ่มการจับของโมเลกุลตัวยับยั้งที่สองกับหน่วยย่อยที่อยู่ติดกัน GBTA เป็นสารประกอบทดสอบที่มีค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สูงที่สุด ดังนั้นเราจึงเลือกสารประกอบนี้เพื่อ ศึกษากลไกของการประสานการทำงานร่วมกันเพิ่มเติม และใช้ 2GBI เป็นตัวควบคุมเชิงลบอ้างอิง
(ก) สารประกอบทดสอบ: [1] สารยับยั้ง Hv1 อ้างอิง 2-กัวนิดิโน-เบนซิมิดาโซล (2GBI)[2] 2-กัวนิดิโน-เบนโซไทอาโซล (GBTA), [3] (5-ไตรฟลูออโรเมทิล-1,3-เบนโซไทอะซอล-2-อิล)กัวนิดีน, [4] แนฟโท[1,2-d][1, 3] ไทอะซอล-2-อิล -กัวนิดีน, [5](4-เมทิล-1,3-ไทอะซอล-2-อิล)กัวนิดีน, [6](5-โบรโม-4-เมทิล-1,3-ไทอะซอล- 2-อิล)กัวนิดีน, [7] ฟาโมทิดีน, [8] 2-กัวนิดิโน-5-เมทิล-1,3-ไทอาโซล-4-คาร์บอกซิลิกแอซิด เอทิลเอสเตอร์, [9] 2-กัวนิดิโน-4-เมทิล เอทิล-1,3-ไทอาโซล-5-คาร์บอกซีเลท, [10 ](2-กัวนิดิโน-4-เมทิล-1,3-ไทอะซอล-5-อิล)เอทิล อะซิเตต, [11]1-[4-(4 -คลอโรฟีนิล)-1,3-ไทอะซอล-2-อิล]กัวนิดีน, [ 12]1-[4-(3,4-ไดเมทอกซีฟีนิล)-1,3-ไทอะซอล-2-อิล]กัวนิดีน .(b) การยับยั้งการออกฤทธิ์ของ Hv1 ของมนุษย์โดยกัวนิดิโนไทอาโซลที่ระบุและสารประกอบอ้างอิง 2GBI (แถบสีน้ำเงิน-เขียว) กระแสโปรตอน .Hv1 ถูกวัดในแผ่นจากด้านในออกของโอโอไซต์ Xenopus เพื่อตอบสนองต่อดีโพลาไรเซชันจากศักย์การกักเก็บที่ -80 มิลลิโวลต์ ถึง +120 มิลลิโวลต์ สารยับยั้งแต่ละตัวถูกเติมลงในอ่างที่ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ pHi = pHo = 6.0 ข้อมูลคือค่าเฉลี่ย±SEM (n≥4)(c) การยับยั้งที่ขึ้นกับความเข้มข้นของ Hv1 ของมนุษย์โดยสารประกอบ [2], [3], [6] และ [11] แต่ละจุดแสดงถึงการยับยั้งเฉลี่ย ± SD ของ 3 ถึง 15 การวัด เส้นนี้เป็นแบบ Hill Fit ที่ใช้เพื่อให้ได้ค่า Kd ที่ชัดเจนซึ่งรายงานในตารางเสริม 1 ค่าสัมประสิทธิ์ Hill ถูกกำหนดจากขนาดที่รายงานในรูปที่ 1 เพิ่มเติม: h (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (ดูวิธีการ)
(a,b) สารประกอบ 2GBI และ GBTA ยับยั้ง Hv1 แบบไดเมอริกและโมโนเมอร์ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น แต่ละจุดแสดงถึงการยับยั้งเฉลี่ย ± SD ของการวัด 3 ถึง 8 และเส้นโค้งเป็นแบบ Hill Fit ค่าสัมประสิทธิ์เนิน (h) แสดงใน ฮิสโตแกรมที่ใส่เข้าไปถูกกำหนดจากความพอดีที่รายงานในรูปที่ 3 และ 4 เพิ่มเติม การตอบสนองความเข้มข้นของ GBTA ที่แสดงใน (a) นั้นเหมือนกับในรูปที่ 1c ดูตารางเสริม 1 สำหรับค่า Kd ที่ชัดเจน (c) การสร้างแบบจำลองของ การเชื่อมโยงแบบมีส่วนร่วมของ GBTA กับ dimeric Hv1 เส้นทึบสีดำแสดงถึงความพอดีกับข้อมูลการทดลองโดยสมการ (6) ซึ่งอธิบายแบบจำลองการเชื่อมโยงที่แสดงใน (d) เส้นประที่มีข้อความว่า Sub 1 และ Sub 2 แสดงถึงการเชื่อมโยงระหว่างโมเลกุลสองโมเลกุล -เส้นโค้งสมดุลการแยกตัวของเหตุการณ์การจับครั้งแรกและครั้งที่สอง ตามลำดับ (ย่อย 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; ย่อย 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) แผนผังของกลไกที่เสนอของบล็อก Hv1 ในกรณีของ GBTA การเชื่อมโยงกับหน่วยย่อยที่เปิดหนึ่งหน่วยจะเพิ่มความสัมพันธ์ของหน่วยย่อยเปิดที่อยู่ติดกัน (Kd2 ช่อง Hv1 สามารถถูกทำให้เป็นโมโนเมอร์ได้โดยการแทนที่โดเมนไซโตพลาสซึมของเทอร์มินัล N และ C ด้วยส่วนที่สอดคล้องกันของฟอสฟาเตสที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้าของ Ciona Intestinalis CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 เราวัดการพึ่งพาความเข้มข้นของการยับยั้งโมโนเมอริก Hv1 โดย GBTA และ 2GBI และ เมื่อเปรียบเทียบกับการยับยั้งช่อง dimeric (ชนิดไวด์) (รูปที่ 2a, b) เราพบว่าความแตกต่างในการทำงานร่วมกันที่มีผลผูกพันระหว่างสารประกอบทั้งสองนั้นถูกกำจัดใน monomeric Hv1 ซึ่งสนับสนุนคำอธิบายที่ว่า GBTA เชื่อมโยงกับหน่วยย่อยหนึ่งจะเพิ่ม ความสัมพันธ์ของหน่วยย่อยอื่นสำหรับตัวยับยั้ง เราให้เหตุผลว่าการจับคู่ GBTA กับหน่วยย่อย Hv1 หนึ่งหน่วยอาจนำไปสู่การจัดเรียงไซต์การจับใหม่ (ทำให้เกิดความพอดี 35) ซึ่งจะกระตุ้นให้เกิดการจัดเรียงใหม่ของตำแหน่งการจับที่ว่างของหน่วยย่อยที่อยู่ติดกัน ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มการจับ ความสัมพันธ์กัน.
ในการอธิบายเชิงปริมาณการเชื่อมโยงแบบมีส่วนร่วมของ GBTA กับช่องสัญญาณ เราใช้แบบจำลองที่หน่วยย่อยใดหน่วยหนึ่งสามารถผูกโมเลกุลตัวยับยั้งตัวแรกหลังจากปฏิกิริยาทางโมเลกุลโดยมีค่าคงที่การแยกตัวออก Kd1 (รูปที่ 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*) การเชื่อมทำให้ช่องรับสถานะซึ่งหน่วยย่อยว่างที่เหลือจับกับตัวยับยั้งหลังจากปฏิกิริยาทางโมเลกุลเฉพาะซึ่งมีค่าคงที่การแยกตัว Kd2 โดยที่ Kd2 เส้นทึบสีดำในรูปที่ 2c คือความพอดีของสมการแบบจำลองกับกราฟการตอบสนองความเข้มข้น-การตอบสนองของการทดลอง โดยให้ค่า Kd1 ที่ ~290 μM และ Kd2 ที่ ~29 μM (ส่วนของวิธีการ สมการ (6)) นอกจากนี้แบบจำลองยังอธิบาย การเชื่อมโยงของ 2GBI โดยที่ Kd2 µ Kd1 = Kd (รูปที่ 2d) ในโมโนเมอร์ Hv1 มีไซต์การเชื่อมโยงเพียงแห่งเดียวและหนึ่ง Kdm (O° + B ⇆ B°) ในกรณีของ GBTA, Kdm มีค่าประมาณ 54 μM ซึ่งคล้ายกับ Kd1 มากกว่า Kd2 (รูปที่ 2d) กล่าวอีกนัยหนึ่ง ไซต์การจับของโมโนเมอร์อยู่ในโครงร่าง (O°) คล้ายกับสถานะความสัมพันธ์สูง (BO*) มากกว่าสถานะความสัมพันธ์ต่ำ (BO*) สถานะความสัมพันธ์ (OO) ของไดเมอร์ ส่วนใหญ่เกิดจากการกำจัดส่วนต่อประสานระหว่างหน่วยย่อย
ดังที่แสดงก่อนหน้านี้สำหรับ 2GBI32 เราพบว่า GBTA ระงับกระแส Hv1 โดยการปิดกั้นช่องเมื่อเปิดแทนที่จะทำให้เปิดยากขึ้น (รูปที่ 2a, b, d เพิ่มเติม) 2GBI เป็นที่รู้จักกันว่ากระตุ้นให้เกิดกระแสหางที่สลายตัวอย่างช้าๆ เพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนขั้วของเมมเบรน แต่ไม่พบปรากฏการณ์นี้ใน GBTA (รูปที่ 2c เพิ่มเติม) ในกรณีที่มีการปิดใช้งาน Hv1 ต่อหน้า 2GBI ประตูในแต่ละหน่วยย่อยจะไม่สามารถปิดได้จนกว่าตัวบล็อกจะออกจากไซต์ที่มีผลผูกพัน (" กลไก foot gate") และ 2GBI จะคลายช้ากว่าที่เกตปิด หากหน่วยย่อย Hv1 หนึ่งหน่วยถูกปลดบล็อกและปิด ในขณะที่หน่วยย่อยที่อยู่ติดกันยังคงถูกบล็อก การคลายโมเลกุล 2GBI ที่เหลือจะช้าลง (การจับตัวบล็อก) สายพันธุ์ช่องสัญญาณที่มีอายุยืนด้วย หน่วยย่อยที่ถูกบล็อกเพียงหน่วยเดียวเท่านั้นที่นำโปรตอนชั่วคราวก่อนที่จะปิด และมีส่วนสำคัญต่อกระแสหางที่ค่อยๆ สลายตัวอย่างช้าๆ
การค้นพบว่าการสลายตัวของกระแสหาง Hv1 ไม่ได้ชะลอตัวลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมี GBTA (รูปที่ 2c เสริม) นั้นสอดคล้องกับกลไกการเชื่อมโยงการทำงานร่วมกันสำหรับตัวบล็อกนี้ (รูปที่ 2d) เมื่อโมเลกุล GBTA ถูกปลดออกจากหน่วยย่อย Hv1 ความสัมพันธ์ของตัวบล็อกเกอร์กับหน่วยย่อยที่อยู่ติดกันลดลงประมาณ 10 เท่า ซึ่งสนับสนุนกระบวนการที่ไม่ผูกมัด ซึ่งหมายความว่าโมเลกุลตัวที่สองของ GBTA มีโอกาสสูงกว่ามากที่จะคลี่คลายก่อนที่จะติดอยู่ในช่องสัญญาณ สายพันธุ์ช่องอายุยืนที่ ผลิตหน่วยย่อยการบล็อกเพียงหน่วยเดียวซึ่งคาดว่าจะมีมากมายเมื่อมี GBTA มากกว่าเมื่อมี 2GBI ส่งผลให้เกิดการสลายตัวของกระแสหางเร็วขึ้น
เพื่อให้ GBTA เชื่อมโยงอย่างร่วมมือกับหน่วยย่อย Hv1 ทั้งสอง ไซต์ที่เชื่อมโยงจะต้องเชื่อมต่อกันแบบ allosterically แต่ละไซต์ที่เชื่อมโยงจะต้องสามารถ: 1) กระตุ้นสายโซ่ของเหตุการณ์ที่สื่อสารกับหน่วยย่อยที่อยู่ติดกันที่ผูกกับตัวยับยั้ง และ 2) เป็นสื่อกลาง การเปลี่ยนจากการจับที่มีสัมพรรคภาพต่ำไปเป็นการจับที่มีความสัมพันธ์สูง เราให้เหตุผลว่าหากสารตกค้างเฉพาะภายในตำแหน่งการจับมีส่วนทำให้เกิดกระบวนการร่วมมือ การกลายพันธุ์ของพวกมันควรเปลี่ยนค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของเส้นโค้งการตอบสนองความเข้มข้นของการยับยั้ง GBTA ของ Hv1 สารตกค้าง D112, F150 ก่อนหน้านี้ S181 และ R211 แสดงให้เห็นว่าเป็นส่วนหนึ่งของสภาพแวดล้อมการเชื่อมโยง 2GBI29 และเราตั้งสมมติฐานว่าพวกเขาจะมีส่วนร่วมในการผูก GBTA ในทำนองเดียวกัน (รูปที่ 3A) เราวัดเส้นโค้งการตอบสนองความเข้มข้นของการยับยั้งของ GBTA สำหรับช่องทางกลายพันธุ์ D112E, F150A, S181A และ R211S (รูปที่ 3) และเปรียบเทียบค่าสัมประสิทธิ์เนินกับค่าสัมประสิทธิ์ของ Hv1 wild-type โดยใช้ 2GBI เป็นข้อมูลอ้างอิง สารตกค้าง V109 อยู่บนหน้าเดียวกันกับส่วน S1 กับ D112 และมีการหมุนเกลียวพิเศษหนึ่งรอบภายในเซลล์ เนื่องจาก V109 ไม่เกี่ยวข้องกับการจับของ 2GBI29 เราใช้พันธุ์กลาย V109A เป็นตัวควบคุม (รูปที่ 3บี)
(a) สารตกค้าง Hv1 ที่แนะนำที่เกี่ยวข้องกับการจับอนุพันธ์ของกัวนิดีน เส้นโค้งสีน้ำเงินประล้อมรอบโซ่ด้านข้างที่เสนอก่อนหน้านี้ซึ่งมีปฏิกิริยากับส่วนต่าง ๆ ของสารประกอบ 2GBI29 (bf) การยับยั้งขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของการกลายพันธุ์ของ Hv1 ที่ระบุโดยสารประกอบ 2GBI (สีฟ้า) และ GBTA ( สีแดงเข้ม) แต่ละจุดแสดงถึงการยับยั้งเฉลี่ยของการวัด 3 ถึง 12 ครั้ง ± SD V109 เป็นตัวควบคุมเชิงลบ เส้นโค้งเป็นแบบ Hill Fit ที่ใช้เพื่อให้ได้ค่า Kd ที่ชัดเจน (ดูตารางเสริม 1) ค่าสัมประสิทธิ์ Hill (h) แสดงใน ฮิสโทแกรมที่ใส่เข้าไปถูกกำหนดจากความพอดีที่รายงานในมะเดื่อเสริม 3 และ 4 ค่าอ้างอิง h สำหรับ Hv1 WT จะแสดงเป็นเส้นประ เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างข้อความกลายพันธุ์และ WT (p เราพบว่าการกลายพันธุ์ของ D112E ลดค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ลงอย่างมีนัยสำคัญ (p การค้นพบว่าค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สำหรับการเชื่อมโยง GBTA นั้นสูงกว่า 1 ในตัวหรี่แสง Hv1 และกลายเป็น ~ 1 ในช่องโมโนเมอร์ (รูปที่ 2b) นั้นสอดคล้องกับการมีอยู่ของการโต้ตอบแบบ allosteric ระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพันในสองหน่วยย่อย หากเป็นเช่นนี้ ในกรณีนี้ ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ GBTA ที่เชื่อมโยงกับตัวหรี่แสงที่ตัวบล็อกเชื่อมโยงกับหนึ่งหน่วยย่อยควรเป็น ~ 1 เราทดสอบการทำนายนี้ในตัวหรี่แสงที่เชื่อมโยง Hv1 F150A-WT (รูปที่ 4a) โดยที่ความสัมพันธ์ของ F150A หน่วยย่อยสำหรับ GBTA มีขนาดมากกว่า 2 คำสั่งที่สูงกว่าหน่วยย่อย WT (รูปที่ 1c และ 3d) จากนั้นเราวัดเส้นโค้งการตอบสนองความเข้มข้นสำหรับการยับยั้งหน่วยย่อย WT ที่ความเข้มข้นพื้นฐานที่ 2 μM GBTA ที่ความเข้มข้นนี้ ตัวบล็อกคาดว่าจะจับประมาณ 99% ของหน่วยย่อย F150A และ (a) แผนผังของไดเมอร์ทางแยก F150A-WT ที่ใช้ในการสร้างเฮมิแชนแนลที่ปิดกั้น ({F150A}b-WT/BAO*) เพชรสีขาวแสดงตำแหน่งของการกลายพันธุ์ ในสถานะ BAO* และ BA*B* คาดว่าความสัมพันธ์ของหน่วยย่อย F150A จะสูงกว่าหน่วยย่อย WT (b) กระแสโปรตอนจากช่อง F150A-WT วัดเพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงศักยภาพของเมมเบรนจาก −80 mV ถึง +120 mV.pHi = pHo = 6.0 ร่องรอยสีเทาแสดงถึงกระแสที่วัดได้ในกรณีที่ไม่มีสารยับยั้ง ร่องรอยสีดำ (ควบคุม) แสดงถึงกระแสที่วัดได้หลังจากการเติม GBTA 2 μM ที่ความเข้มข้นนี้ หน่วยย่อย WT ไม่ได้ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่หน่วยย่อย F150A เชื่อมโยงกับ GBTA เกือบทั้งหมด ({F150A}b-WT) การเพิ่มขึ้นอีกในความเข้มข้นของ GBTA ส่งผลให้เกิดการอุดตันของหน่วยย่อย WT (ร่องรอยสีส้มและสีแดง) (c) การยับยั้งที่ขึ้นกับความเข้มข้นของไดเมอร์ {F150A}b-WT (สารยับยั้งที่ถูกจับไว้ล่วงหน้ากับ หน่วยย่อย F150A) แต่ละจุดแสดงถึงการยับยั้งเฉลี่ย ± SD ของการวัด 3 ถึง 7 ครั้ง เส้นโค้งเป็นแบบ Hill Fit ที่ใช้เพื่อให้ได้ค่า Kd ที่ชัดเจนซึ่งรายงานในตารางเสริม 1 ค่าสัมประสิทธิ์ Hill ที่แสดงในฮิสโทแกรมที่ใส่เข้าไปถูกกำหนดจาก Fit ที่รายงานในมะเดื่อเสริม 3 และ 4 ค่า h ของ Hv1 WT คือ แสดงเป็นเส้นประ เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับ WT dimer Hv1 (p เนื่องจากการยับยั้ง GBTA ของ Hv1 ถูกวัดในช่องเปิด เราจึงให้เหตุผลว่าความร่วมมือที่มีผลผูกพัน GBTA สามารถใช้เพื่อศึกษากลไกของการมีเพศสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อยในสถานะเปิด หน่วยย่อย Hv1 ทั้งสองนี้ก่อนหน้านี้พบว่ามีรั้วรอบขอบชิดแบบร่วมมือกัน 19,20,21 intersubunit ที่เกี่ยวข้องกับ gating ถูกเสนอให้เป็นสื่อกลางโดยโดเมนคอยล์คอยล์ของไซโตพลาสซึม (CCD) 22, 25 ดังนั้นเราจึงถามว่า CCD เกี่ยวข้องกับการมีเพศสัมพันธ์ระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพันกับ GBTA ในสถานะเปิดหรือไม่ ไตรกลีซีน การกลายพันธุ์ที่ส่วนต่อประสานระหว่างส่วนของเมมเบรน S4 และโดเมนขดขดถูกแสดงในการศึกษาก่อนหน้านี้เพื่อแยกโดเมนนี้ออกจากส่วนที่เหลือของช่องในขณะที่ยังคงรักษาความสมบูรณ์ของการลดขนาด ดังนั้นเราจึงทดสอบผลของการกลายพันธุ์ V220G, K221G และ T222G (รูปที่ .5a, GGG กลายพันธุ์) ในความร่วมมือที่มีผลผูกพัน GBTA เราพบว่าค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ GBTA ที่เชื่อมโยงกับช่อง GGG ลดลงไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 5c) แสดงให้เห็นว่าแม้จะมีบทบาทในการรักษา สองหน่วยย่อยเข้าด้วยกันมีความสำคัญ แต่ CCD ไม่ได้เป็นสื่อกลางโดยตรงในการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric ระหว่างหน่วยย่อยระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพัน GBTA
( a ) แผนผังไดอะแกรมของตัวหรี่ Hv1 ที่มีการกลายพันธุ์ของไตรกลีซีนที่ปลายด้านในของ S4 ที่ออกแบบมาเพื่อรบกวนการมีเพศสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อยที่เป็นสื่อกลางโดยโดเมนขดม้วนไซโตพลาสซึม (ลูกศรสีน้ำเงิน) ( b ) การแสดงแผนผังของตัวหรี่ Hv1 และตัวหรี่ ligation ด้วย การกลายพันธุ์ที่ระบุ ออกแบบมาเพื่อทดสอบชิ้นส่วน S1 ที่เกี่ยวข้องกับการมีเพศสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อย (ลูกศรสีน้ำเงิน) (c – h) 2GBI (สีฟ้า) และ GBTA (สีแดงเข้ม) ยับยั้งโครงสร้างที่ระบุในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น แต่ละจุดแสดงถึงการยับยั้งเฉลี่ย ± SD ของการวัด 3 ถึง 10 ครั้ง เส้นโค้งเป็นแบบฮิลล์ที่ใช้เพื่อให้ได้ค่า Kd ที่ชัดเจน (ดูตารางเสริม 1) ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ในฮิสโทแกรมที่ประมาณค่าถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการ (ดูรูปเพิ่มเติม 3 และ 4) ค่าอ้างอิง h สำหรับ Hv1 WT แสดงเป็นเส้นประ เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างข้อความกลายพันธุ์และ WT (p เนื่องจากเราแยก CCD ออกจากการเป็นสื่อกลางโดยตรงของการเชื่อมโยงสหกรณ์ GBTA เราจึงถามว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่าง VSD เกี่ยวข้องกับการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric ระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพันหรือไม่ เราพบว่าความร่วมมือที่มีผลผูกพันกับ GBTA ถูกยกเลิกโดยการกลายพันธุ์แบบอนุรักษ์นิยมของสารตกค้าง D112 (รูปที่ 3c) ซึ่งอยู่ ในส่วนของทรานส์เมมเบรน S1 S1 มีเรซิดิวที่มีประจุลบอีกสองตัวคือ E119 และ D123 ซึ่งอยู่บนด้านเดียวกันของเกลียวกับ D112 แต่ใกล้กับปลายด้านนอก 24 ของแฟรกเมนต์ การจำลองไดนามิกของโมเลกุลในช่วงแรกระบุว่าเรซิดิวเหล่านี้เชื่อมโยงกัน ถึง D112 ผ่านทางสายน้ำ ดังนั้นเราจึงทดสอบว่า E119 และ D123 เกี่ยวข้องกับการมีเพศสัมพันธ์แบบอัลโลสเตอริกระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพัน GBTA หรือไม่ (รูปที่ 5b) ในฐานะตัวควบคุมเชิงลบ เราได้ทดสอบตำแหน่งที่มีประจุบวกที่ได้รับการอนุรักษ์ K125 ซึ่งตั้งอยู่ใกล้กับ D123 แต่อยู่อีกด้านหนึ่งของเกลียว S1 (รูปที่ 5b)
เราวัดการยับยั้งที่ขึ้นกับความเข้มข้นของช่องสัญญาณ E119A, D123A และ K125A ด้วย 2GBI และ GBTA และพบว่าการกลายพันธุ์ของ E119A และ K125A ไม่ได้เปลี่ยนค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของตัวยับยั้งทั้งสองอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับประเภทไวด์ (p > 0.05, รูปที่ 5d, i) ). ในทางกลับกันการกลายพันธุ์ D123A ลดค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ GBTA ลงอย่างมาก (p 0.05/14)
เนื่องจากการทำให้ประจุเป็นกลางที่ตำแหน่ง 123 ในทั้งสองหน่วยย่อยส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมากในความร่วมมือที่มีผลผูกพัน GBTA ในขณะที่การกลับประจุในหน่วยย่อยทั้งสองมีผลเพียงเล็กน้อย เราจึงขยายการวิเคราะห์เพื่อรวมหน่วยย่อยเพียงหน่วยเดียวที่มีช่องทางการผกผันของประจุ เรา สร้างไดเมอร์ที่เชื่อมโยงกับ Hv1 ด้วยการทดแทน D123R ในหน่วยย่อย C-terminal (รูปที่ 5b) และวัดการยับยั้งการตอบสนองของความเข้มข้นโดย GBTA และ 2GBI เราพบว่าค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ GBTA ที่เชื่อมโยงกับช่อง WT-D123R นั้นสูงกว่านั้นอย่างมีนัยสำคัญ ของ Hv1 ประเภทไวด์ (p นอกจากนี้เรายังพบว่าการกลายพันธุ์ของ D112E ยกเลิกการเพิ่มค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ที่มีผลผูกพันกับ GBTA ที่ผลิตโดยพื้นหลัง WT-D123R (รูปที่ 5b, h และรูปที่ 4 เพิ่มเติม) ผลกระทบต่อค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของการรวม 2GBI ก็ถูกกำจัดเช่นกัน ( รูปที่ 5 ชม. และรูปที่ 3 เพิ่มเติม) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการมีเพศสัมพันธ์แบบอัลโลสเตอริกที่ได้รับการปรับปรุงระหว่างหน่วยย่อยที่เกิดจากประจุตรงข้ามที่ตำแหน่ง 123 ไม่ได้แปลเป็นความร่วมมือในการจับยึดที่แข็งแกร่งยิ่งขึ้นเมื่อไซต์การจับที่ตำแหน่ง D112 ถูกรบกวน
เราให้เหตุผลว่าหาก D123 ที่ตกค้างในหน่วยย่อยเปิดที่อยู่ติดกันอยู่ใกล้พอที่จะโต้ตอบกันด้วยไฟฟ้าสถิต ปฏิกิริยาที่น่ารังเกียจระหว่างประจุลบจะถูกแปลงเป็นการรวมกันของประจุลบและประจุบวกโดยการแทนที่กรดแอสปาร์ติกเป็นอาร์จินีน ปฏิสัมพันธ์ที่น่าดึงดูดระหว่างพวกเขาหนึ่งหน่วยย่อย (ตัวหรี่ WT-D123R) ปฏิสัมพันธ์ที่น่าดึงดูดสามารถเสริมความแข็งแกร่งให้กับส่วนต่อประสานระหว่างปลายด้านนอกของแฟรกเมนต์ S1 ซึ่งนำไปสู่การมีเพศสัมพันธ์แบบอัลโลสเตอริกที่แข็งแกร่งระหว่างหน่วยย่อยและเพิ่มความร่วมมือที่มีผลผูกพันกับ GBTA
เพื่อสนับสนุนสมมติฐานนี้ เรามองหาวิธีเสริมความแข็งแกร่งให้กับส่วนต่อประสานระหว่างปลายด้านนอกของกลุ่ม S1 ซึ่งแตกต่างจากการเปลี่ยนประจุที่ตำแหน่ง 123 ก่อนหน้านี้พบการกลายพันธุ์ของสารตกค้าง Hv1 I127 ไปเป็นซิสเทอีน เพื่อส่งผลให้เกิดการเชื่อมโยงข้ามระหว่างหน่วยย่อยที่เกิดขึ้นเอง17 นอกจากนี้ โครงสร้างผลึกของ Hv1-CiVSP chimeric VSD ยังบ่งชี้ว่า I127 ถูกแยกออกจากปลายด้านนอกของเกลียว S1 ด้วยสารตกค้างเพียงตัวเดียว24 ดังนั้นเราจึงถามว่าการก่อตัวของพันธะโควาเลนต์ระหว่าง ซีสเตอีนที่ตำแหน่ง 127 ซึ่งคาดว่าจะส่งผลให้เกิดปฏิกิริยา S1-S1 ที่แข็งแกร่งขึ้น มีผลกระทบต่อความร่วมมือที่มีผลผูกพัน GBTA คล้ายกับที่สังเกตได้จากการเปลี่ยนประจุที่ตำแหน่ง 123
เราวัดการยับยั้งที่ขึ้นกับความเข้มข้นของ Hv1 I127C โดย GBTA และ 2GBI ในที่ที่มีและไม่มี 10 mM β-mercaptothanolol (βME) (รูปที่ 6a) ในเวลาเดียวกันกับที่สารยับยั้งถูกเพิ่มเข้าไปในสารละลายในเซลล์ การลดลง มีการเพิ่มตัวแทนลงในสารละลายนอกเซลล์ มีการใช้ไดเมอร์ที่เชื่อมโยงกับการทดแทนซีสเตอีนในหน่วยย่อยเดียว (WT-I127C) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ (รูปที่ 6a) เราไม่สามารถวัดผลกระทบใด ๆ ของการเชื่อมโยงข้ามระหว่างหน่วยย่อยที่เกิดขึ้นเอง ระหว่างหน่วยย่อย I127C ในการยับยั้ง 2GBI เนื่องจากค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สำหรับ I127C ที่จับกับ Hv1 โดยมีหรือไม่มี βME นั้นแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สำหรับการจับกับ dimers ทดแทน monocysteine ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ไม่สามารถแยกความแตกต่าง WT-I127C (รูปที่ 6b และรูปที่ 3 เพิ่มเติม) ในทางตรงกันข้ามโดยสิ้นเชิงเราวัดผลกระทบที่น่าทึ่งของการเชื่อมโยงข้ามหน่วยย่อยที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติต่อการยับยั้ง GBTA ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สำหรับการจับกับ Hv1 I127C ในกรณีที่ไม่มี βME (เปิดการเชื่อมขวาง) สูงกว่าการวัดอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมี βME (ปิดการเชื่อมขวาง) หรือใช้ WT-127C เพื่อเชื่อมโยงตัวหรี่แสง (ในกรณีที่ไม่มีการเชื่อมขวาง) (รูปที่ 6c และรูปที่ 4 เพิ่มเติม) บ่งชี้ว่าการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric ระหว่างตำแหน่งที่มีผลผูกพันได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นอย่างมากโดยการก่อตัวของพันธะไดซัลไฟด์ระหว่างปลายด้านนอกของชิ้นส่วน S1 ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนการตีความของเราว่าอันตรกิริยาทางไฟฟ้าสถิตที่น่าสนใจของแอสพาร์เทตและอาร์จินีนที่ตำแหน่ง 123 ในไดเมอร์ WT-D123R ส่งผลให้เกิดการคัปปลิ้งแบบ allosteric เพิ่มขึ้นระหว่าง หน่วยย่อย
การมีเพศสัมพันธ์แบบเปิดสถานะถูกสื่อกลางโดยการโต้ตอบทางกายภาพโดยตรงระหว่างปลายด้านนอกของเซ็กเมนต์ S1 ในสองหน่วยย่อย
(a) การแสดงแผนผังของไดเมอร์ Hv1 กลายพันธุ์และไดเมอร์ลิงก์เกอร์ ออกแบบมาเพื่อตรวจสอบว่าครอสลิงก์ซิสเทอีนระหว่างหน่วยย่อยส่งผลต่อความร่วมมือที่มีผลผูกพัน GBTA อย่างไร (bd) การยับยั้งขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของโครงสร้างที่ระบุโดย 2GBI (b,d) และ GBTA (c, e) เมื่อมีหรือไม่มี 10 mM βME ในสารละลายนอกเซลล์ แต่ละจุดแสดงถึงการยับยั้งเฉลี่ย ± SD ของการวัด 3 ถึง 10 ครั้ง เส้นโค้งเป็นแบบฮิลล์ที่ใช้เพื่อรับค่า Kd (ดูตารางเสริม 1) ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ในฮิสโทแกรมที่ใส่เข้าไปถูกกำหนดจากขนาดที่รายงานในมะเดื่อเสริม 3 และ 4 เครื่องหมายดอกจันใน (c, e) บ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ ระหว่างเงื่อนไขการยับยั้ง GBTA ที่แตกต่างกัน (p 0.05)
นอกจากนี้เรายังพบว่าในกรณีที่ไม่มี βME ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ GBTA ที่เชื่อมโยงกับตัวหรี่แสง D112E I127C Hv1 นั้นสูงกว่าค่าที่วัดได้อย่างมีนัยสำคัญเมื่อมีสารรีดิวซ์ (รูปที่ 6e และรูปที่ 4 เพิ่มเติม) ซึ่งหมายความว่าการกลายพันธุ์ของ D112E ไม่ได้ยกเลิกการเพิ่มความร่วมมือในการผูกมัด GBTA ซึ่งเป็นผลมาจากการเชื่อมโยงข้ามของซีสเตอีน 127 ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ 2GBI ที่ผูกกับ D112E, I127C Hv1 dimers ก็ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากการกลายพันธุ์ของ D112E (รูปที่ 1) 6d และเสริม รูปที่ 3)
เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเชื่อมโยง GBTA ได้รับการปรับปรุงโดยการทำงานร่วมกันระหว่างปลายด้านนอกของชิ้นส่วน S1 ในหน่วยย่อย Hv1 ที่อยู่ติดกัน ผ่านการโต้ตอบทางไฟฟ้าสถิตที่น่าดึงดูด หรือผ่านการก่อตัวของพันธะโควาเลนต์ระหว่างซีสเตอีนที่ถูกแทนที่ การมีเพศสัมพันธ์แบบ Allosteric ระหว่างไซต์เพิ่มขึ้นและส่งผลให้เกิดความร่วมมือที่มีผลผูกพัน แม้ว่าผลกระทบของปฏิกิริยาระหว่างไฟฟ้าสถิตที่ดึงดูดใจต่อความร่วมมือสามารถยกเลิกได้ด้วยการกลายพันธุ์ D112E แต่ผลของพันธะโควาเลนต์ไม่สามารถทำได้
ในการสำรวจพื้นที่ทางเคมีที่มีอยู่สำหรับการจับอนุพันธ์ของ guanidine กับช่อง Hv1 เราพบว่า 2-guanidinothiazoles เช่น GBTA มีการพึ่งพาความเข้มข้นที่สูงชันกว่า 2-guanidinobenzimidazoles (รูปที่ 1c) การวิเคราะห์ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ของ GBTA ผูกพันกับทั้ง dimeric และช่องโมโนเมอริก (รูปที่ 2a, b) และไปยังช่องไดเมอริกที่หน่วยย่อยหนึ่งถูกผูกไว้ล่วงหน้ากับตัวยับยั้ง (รูปที่ 4) ทำให้เราสรุปได้ว่าการยับยั้งของ Hv1 โดย GBTA การกระทำเป็นกระบวนการเสริมฤทธิ์กัน และ ตำแหน่งที่มีผลผูกพันของสารประกอบในหน่วยย่อยทั้งสองนั้นเชื่อมต่อกันแบบ allosterically การค้นพบว่า GBTA ผูกกับช่องสัญญาณเปิดดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้สำหรับสารประกอบ 2GBI32 ที่เกี่ยวข้อง แสดงให้เห็นว่าการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric สามารถประเมินได้โดยเฉพาะในสถานะเปิด โมเดลการมีผลผูกพันแบบมีส่วนร่วมของเรา สามารถอธิบายเชิงปริมาณการยับยั้งของ Hv1 โดย GBTA (รูปที่ 2c) และอธิบายผลกระทบที่แตกต่างกันของ 2GBI และ GBTA ต่อการสลายตัวของกระแสหางของช่องสัญญาณหลังจากการรีโพลาไรเซชันของเมมเบรน ซึ่งสนับสนุนการตีความกระบวนการจับของเรา
ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์สูงสุดที่สามารถทำได้ในโปรตีนอัลโลสเตอริกที่มีตำแหน่งการจับสองตำแหน่ง (เช่น Hv1) ​​​​คือ 2 เราวัด GBTA เพื่อจับประเภทไวด์ Hv1 ด้วยค่าสัมประสิทธิ์ 1.31 ซึ่งเพิ่มขึ้นเป็น 1.88 ใน Hv1 I127C พลังงานอิสระที่เสริมฤทธิ์กัน ความแตกต่างระหว่างพลังงานอิสระการจับของตำแหน่งความสัมพันธ์ต่ำสุดและสูงสุด (ดูวิธีการ) คือ 1.3 กิโลแคลอรี/โมล ในกรณีของประเภท Hv1 wild และ 2.7 กิโลแคลอรี/โมล ในกรณีของ Hv1 I127C การจับ ของออกซิเจนต่อฮีโมโกลบินเป็นตัวอย่างที่มีชื่อเสียงและได้รับการศึกษามาเป็นอย่างดีของกระบวนการทำงานร่วมกัน38 สำหรับฮีโมโกลบินของมนุษย์ (tetramer ที่มีจุดจับคู่แบบ allosterically 4 ตำแหน่ง) ค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์จะอยู่ในช่วง 2.5-3.0 โดยมีค่าอยู่ระหว่าง 1.26 ถึง 3.64 kcal/mol ขึ้นอยู่กับเงื่อนไขการทดลอง38 ดังนั้น ในแง่ของพลังงานทั่วโลก การทำงานร่วมกันของ GBTA ที่เกาะกับ Hv1 จึงไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากการที่ O2 จับกับฮีโมโกลบินเมื่อพิจารณาจำนวนหน่วยย่อยของโปรตีนที่แตกต่างกันในทั้งสองระบบ
ในโมเดลการทำงานร่วมกันของเรา การเชื่อมโยงโมเลกุล GBTA กับหน่วยย่อยหนึ่งส่งผลให้ความสัมพันธ์ในการผูกมัดของหน่วยย่อยที่อยู่ติดกันเพิ่มขึ้น เรามองเห็นกระบวนการที่การจัดเรียงสภาพแวดล้อมการผูกมัดใหม่อันเป็นผลมาจากเหตุการณ์การผูกมัดครั้งแรก (เหนี่ยวนำให้พอดี) นำไปสู่ การเปลี่ยนแปลงในการโต้ตอบระหว่างหน่วยย่อย เพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ หน่วยย่อยที่อยู่ติดกันจะเปลี่ยนตำแหน่งการเชื่อมโยงของพวกเขา ส่งผลให้เกิดการเชื่อมโยง GBTA ที่เข้มงวดมากขึ้น ในระหว่างกระบวนการนี้ S1 aspartate D112 มีหน้าที่รับผิดชอบในการจัดเรียงใหม่ของไซต์การเชื่อมโยงที่เกี่ยวข้องกับความสัมพันธ์ในการผูกที่เพิ่มขึ้น D112 ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าเป็นส่วนหนึ่งของเส้นทางการซึมผ่านของโปรตอน Hv1 และทำหน้าที่เป็นตัวกรองการเลือกสรร ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าตัวกรองการเลือกในหน่วยย่อย Hv1 ทั้งสองนั้นเชื่อมต่อกันแบบ allosterically ในสถานะเปิด รูปที่ 7a แสดงตำแหน่งโดยประมาณของไซต์การรวม GBTA และตำแหน่งของสิ่งตกค้าง D112, D123, K125 และ I127 บนแผนผังของ Hv1 VSD ที่ใช้ บนโครงสร้างผลึกของคิเมรา Hv1-CiVSP คำแนะนำสำหรับการคัปปลิ้งอัลโลสเตอริกที่เกี่ยวข้องกับส่วนปลายนอกเซลล์ของ S1 จะแสดงด้วยลูกศรสีดำ
(a) แผนผังของ Hv1 VSD ตามโครงสร้างผลึกของไคเมร่า Hv1-CiVSP ส่วนขดลวดจะแสดงเป็นทรงกระบอก ในการกำหนดค่านี้ ปลายด้านในของเซ็กเมนต์ S4 จะผสานกับ CCD (ไม่แสดง) ตำแหน่งที่คาดการณ์ของ GBTA ที่ถูกผูกไว้จะแสดงเป็นวงรีสีเทา ลูกศรสีดำบ่งบอกถึงเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการมีเพศสัมพันธ์แบบอัลโลสเตอริกระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพันในสองหน่วยย่อยที่อยู่ติดกัน ตำแหน่งของสิ่งตกค้าง S1 ที่ตรวจสอบจะถูกทำเครื่องหมายด้วยทรงกลมสี (b) ภาพประกอบแผนผังของหน่วยย่อย Hv1 ที่จัดเรียง ในการกำหนดค่าไดเมอร์ที่แตกต่างกันสองแบบเมื่อมองจากด้านนอกเซลล์ของระนาบเมมเบรน บนแผงด้านซ้าย ส่วนต่อประสานไดเมอร์จะถูกสร้างขึ้นโดยเกลียว S4 การหมุนของ VSD ทั้งสอง 20 องศาตามเข็มนาฬิการอบแกนที่ตั้งฉากกับระนาบเมมเบรน พร้อมด้วย การแยกปลายด้านนอกของเอนริเก้ S4 ทั้งสอง (ลูกศรประ) ทำให้เกิดการจัดเรียงที่แสดงทางด้านขวา ในการกำหนดค่านี้ สิ่งตกค้าง D123 และ I127 จากหน่วยย่อยที่อยู่ติดกันได้รับอนุญาตให้เข้ามาใกล้กัน (c) การแสดงแผนผังของ CiVSP VSD ในการกำหนดค่าไดเมอร์ที่พบในโครงสร้างคริสตัล 4G80 ตำแหน่ง P140 ใน CiVSP สอดคล้องกับตำแหน่ง D123 ใน Hv1
ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าปฏิกิริยาระหว่างไฟฟ้าสถิตที่น่ารังเกียจระหว่างสารตกค้าง 123 (123D/123D หรือ 123R/123R) มีความสัมพันธ์กับระดับ "ปกติ" ของความร่วมมือที่มีผลผูกพันกับ GBTA ในสถานะเปิด และเปลี่ยนปฏิสัมพันธ์จากการผลักเป็นดึงดูด (123D/123R) , เพิ่มความร่วมมือ (รูปที่ 5g) คาดว่าการกำจัดปฏิสัมพันธ์ที่น่ารังเกียจด้วยการทดแทนอะลานีนจะนำไปสู่ความร่วมมือที่เพิ่มขึ้นด้วย อย่างไรก็ตาม พบว่าความร่วมมือลดลงของไดเมอร์ 123A/123A (รูปที่ 5e) สิ่งหนึ่งที่เป็นไปได้ คำอธิบายก็คือผลกระทบที่ทำให้ไม่คงตัวของการวางสารตกค้างที่ไม่ชอบน้ำในสภาพแวดล้อมที่ชอบน้ำอาจมีค่ามากกว่าผลการรักษาเสถียรภาพเนื่องจากการกำจัดปฏิกิริยาที่น่ารังเกียจระหว่างสารตกค้าง D123 ส่งผลให้ความร่วมมือโดยรวมลดลง Mony และคณะ 39 รายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่าการเข้าถึงตัวทำละลายที่ ตำแหน่ง D171 ของ Ciona gutis Ci-Hv1 (ตรงกับ D123 ใน Hv1 ของมนุษย์) ​​จะเพิ่มขึ้นเมื่อมีการกระตุ้น ซึ่งสนับสนุนแนวคิดที่ว่า D123 ตั้งอยู่ในสภาพแวดล้อมที่ชอบน้ำในสถานะเปิด
เป็นที่ทราบกันว่าการเกตของช่อง Hv1 นั้นเกิดขึ้นผ่านการเปลี่ยนหลายครั้ง 19,20,26,39,40,41.Qiu และคณะ พบว่าเมื่อมีการเปลี่ยนขั้วของเมมเบรน เซ็นเซอร์แรงดันไฟฟ้าของ Ci-Hv1 จะผ่านการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ทำให้ช่องเปิดใช้งานแต่ยังคงปิดอยู่ ตามด้วยการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนที่ทำให้โปรตอนเปิดการนำไฟฟ้าในทั้งสองเส้นทางของหน่วยย่อย การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของเซ็นเซอร์แรงดันไฟฟ้าได้รับการตรวจสอบโดยฟลูออเรสเซนต์แบบแคลมป์แรงดันไฟฟ้า และพบว่าการเปลี่ยนแปลงครั้งที่สองถูกรบกวนโดยการคัดเลือกโดยการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง D171 การรบกวนของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์นั้นสอดคล้องกับการมีอยู่ของปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตระหว่าง D171 ที่ตกค้างของหน่วยย่อยที่อยู่ติดกัน ณ จุดใดจุดหนึ่งตามพิกัดปฏิกิริยาของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง การตีความนี้สอดคล้องกับการค้นพบของเราว่า D123 ที่ตกค้างมีปฏิกิริยาทางไฟฟ้าสถิตในสถานะเปิด และเป็นสื่อกลางในการมีเพศสัมพันธ์แบบ allosteric ระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพัน GBTA
Fujiwara และคณะ เสนอว่าอินเทอร์เฟซ dimer ของโดเมนคอยล์ขดไซโตพลาสซึมขยายเข้าไปในเมมเบรนเพื่อให้มีเอนริเก้ S4 สองตัว (รูปที่ 7b แผงด้านซ้าย) แบบจำลองของการโต้ตอบระหว่างหน่วยย่อยนี้ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์การเชื่อมโยงข้ามซีสเตอีนที่ครอบคลุม VSD ทั้งหมดและการวิเคราะห์เชิงฟังก์ชันของภูมิภาคที่เชื่อมต่อเกลียว S4 และ CCD ในกรณีที่ไม่มีการไล่ระดับ pH ของเมมเบรน ช่อง Hv1 จำเป็นต้องมีการเปลี่ยนขั้วเมมเบรนอย่างมากเพื่อเปิด และการเชื่อมขวางของซิสเตอีนจะเกิดขึ้นภายใต้เงื่อนไขที่ช่องถูกปิดอย่างเด่นชัด ดังนั้นอินเทอร์เฟซ S4-S4 ที่ตรวจพบน่าจะสะท้อนถึงการกำหนดค่าหน่วยย่อยนอกสถานะ การศึกษาอื่น ๆ พบหลักฐานสำหรับการมีส่วนร่วมของ S1 และ S2 ในการโต้ตอบระหว่างหน่วยย่อยในระหว่างการเกตติ้ง แนะนำว่าช่องสัญญาณอาจใช้การกำหนดค่าหน่วยย่อยที่แตกต่างกันในแบบเปิดและ รัฐปิด ซึ่งเป็นแนวคิดที่สอดคล้องกับข้อค้นพบของโมนี และคณะ S1 เคลื่อนที่ 39 ระหว่างการเกต
ที่นี่ เราแสดงให้เห็นว่าในสถานะเปิด ส่วนปลายนอกเซลล์ของเกลียว S1 อยู่ใกล้พอที่จะรองรับปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตโดยตรงที่เป็นสื่อกลางในการมีเพศสัมพันธ์แบบอัลโลสเตอริกระหว่างหน่วยย่อย ในการกำหนดค่าหรี่แสงที่มีการโต้ตอบ S4-S4 แบบขยาย เอนริเก้ S1 นั้นอยู่ไกลเกินไป แยกจากกันเพื่อโต้ตอบโดยตรง อย่างไรก็ตาม การหมุนตามเข็มนาฬิกา 20° ของหน่วยย่อย VSD ทั้งสองรอบแกนที่ตั้งฉากกับระนาบเมมเบรน รวมกับการแยกปลายด้านนอกของเอนริเก้ S4 ทั้งสอง ทำให้ได้การกำหนดค่า S1-S1 ที่สอดคล้องกัน จากการค้นพบของเรา (รูปที่ 7b แผงด้านขวา) เราขอแนะนำการกำหนดค่านี้สำหรับช่องสัญญาณในสถานะเปิด
แม้ว่าเอนไซม์ CiVSP จะถูกคิดว่าทำหน้าที่เป็นโมโนเมอร์ แต่โครงสร้างผลึกของ VSD ที่แยกได้ของมันจะถูกจับในสถานะหรี่ลง ปลายด้านนอกของเอนริเก้ S1 ในไดเมอร์นี้อยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่ และโครงร่างโดยรวมก็คล้ายคลึงกับที่นำเสนอ สำหรับ Hv1 (รูปที่ 7c) ใน dimer CiVSP สารตกค้างที่ใกล้ที่สุดจากหน่วยย่อยที่อยู่ติดกันคือ proline ที่ตำแหน่ง 140 (รูปที่ 7c) สิ่งที่น่าสนใจคือ P140 ใน CiVSP สอดคล้องกับตำแหน่ง D123 ใน Hv1 ความคล้ายคลึงกันในการกำหนดค่าหน่วยย่อยระหว่าง Hv1 และ CiVSP dimers แสดงให้เห็นว่า VSD ของโปรตีนเหล่านี้มีแนวโน้มที่แท้จริงในการสร้างส่วนต่อประสานที่ส่วนปลายนอกเซลล์ของ S1 มีปฏิกิริยาโต้ตอบ
บทบาทที่สำคัญของ Hv1 ในการกระตุ้นเซลล์อสุจิทำให้ช่องทางนี้เป็นเป้าหมายยาที่น่าสนใจสำหรับการควบคุมภาวะเจริญพันธุ์ของผู้ชาย นอกจากนี้ การกระตุ้นของ Hv1 ใน microglia ยังแสดงให้เห็นว่าการฟื้นตัวจากโรคหลอดเลือดสมองตีบแย่ลง พบว่ากิจกรรมของ Hv1 ที่ปรับปรุงแล้วมีความสัมพันธ์กับการลด การอยู่รอดในผู้ป่วยมะเร็งเต้านม 12 หรือมะเร็งลำไส้ใหญ่ 13 และคิดว่ามีส่วนทำให้เกิดมะเร็งเซลล์บี 11 ดังนั้น ยาโมเลกุลขนาดเล็กที่มุ่งเป้าไปที่ Hv1 จึงสามารถใช้เป็นสารป้องกันระบบประสาทหรือการรักษาต้านมะเร็งได้ การค้นพบว่าอนุพันธ์ของ guanidinothiazole สามารถทำให้เกิดการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ใน หน่วยย่อย Hv1 แบบเปิด ซึ่งนำไปสู่ความสัมพันธ์ที่ผูกพันเพิ่มขึ้น อาจนำไปสู่การพัฒนายาที่มีศักยภาพมากขึ้นโดยมุ่งเป้าไปที่ช่อง Hv1
การกลายพันธุ์ที่มุ่งตรงที่ตำแหน่งของ Hv1 ของมนุษย์ถูกดำเนินการโดยใช้เทคนิค PCR มาตรฐาน ในโครงสร้าง Hv1NCCiVSP เรซิดิว 1-96 และ 228-273 ของ Hv1 ถูกแทนที่ด้วยเรซิดิว 1-113 และ 240-576 ของ CiVSP18 ในไดเมอร์ที่เชื่อมโยงกับ Hv1 ปลาย C ของหน่วยย่อยหนึ่งเชื่อมโยงกับปลาย N ของหน่วยย่อยที่สองผ่านตัวเชื่อมโยง GGSGGSGGSGSGGSGG พลาสมิด pGEMHE ที่มีโครงสร้างต่างๆ ถูกทำให้เป็นเส้นตรงด้วยเอนไซม์จำกัด Nhe1 หรือ Sph1 (New England Biolabs) และการสังเคราะห์ RNA ดำเนินการด้วย T7 mMessage mMachine transcription kit (Ambion) 1-3 วันก่อนการตรวจวัดทางไฟฟ้าสรีรวิทยา cRNA ถูกฉีดเข้าไปในโอโอไซต์ของ Xenopus (50 nl ต่อเซลล์, 0.3-1.5 μg/μl) ได้รับโอโอไซต์ของ Stage V และ VI จาก Xenopus laevis (NASCO) จาก Ecocyte Bioscience หลังจากการฉีด RNA เซลล์ได้รับการบำรุงรักษาในตัวกลาง ND96 ที่ประกอบด้วย NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl 1.8 mM, MgCl 1 mM, HEPES 10 mM, ไพรูเวต 5 mM, เจนตามิซิน 100 μg/ml, pH 7.2 18°C .
2-กัวนิดิโน-เบนซิมิดาโซล[1], 2-กัวนิดิโน-เบนโซไทอาโซล[2], (4-เมทิล-1,3-ไทอาซอล-2-อิล)กัวนิดีน [5], (5-โบรโม-4 -เมทิล-1,3 -ไทอะซอล-2-อิล)กัวนิดีน) [6], เอทิล 2-กัวนิดิโน-5-เมทิล-1,3-ไทอาโซล-4-คาร์บอกซีเลท [8], เอทิล 2-กัวนิดิโน-4- เมทิล-1,3-ไทอาโซล- 5-carboxylate [9] และ (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate [10] มาจาก Sigma-Aldrich Famotidine [7] มาจาก MP Biomedicals.1- [4 -(4-คลอโรฟีนิล)-1,3-ไทอะซอล-2-อิล]กัวนิดีน[11] และ 1-[4-(3,4-ไดเมทอกซีฟีนิล)-1,3- ไทอะซอล-2-อิล]กัวนิดีน [12] คือ จาก Matrix Scientific สารประกอบเหล่านี้มีความบริสุทธิ์สูงสุดที่มีจำหน่ายในท้องตลาด พวกมันถูกละลายใน DMSO แบบแห้งเพื่อสร้างสารละลายสต็อก 100 มิลลิโมลาร์ ซึ่งจากนั้นถูกเจือจางในสารละลายการบันทึกที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการ สารประกอบ 3 และ 4 ถูกสังเคราะห์ด้านล่างด้วย ความบริสุทธิ์อย่างน้อย 99%
ไปยังสารแขวนลอยของ 2-อะมิโน-4-(ไตรฟลูออโรเมทิล)เบนซีนไทออล ไฮโดรคลอไรด์ (1.02 กรัม, 4.5 มิลลิโมล) ใน 25 มิลลิลิตรของกรดไฮโดรคลอริกที่มีน้ำ (2.5 นอร์ตัน) ถูกเติมไดไซยาไมด์ที่เป็นของแข็ง (380 มก., 4.5 มิลลิโมล) และของผสมที่ต่างกันที่เป็นผลลัพธ์ ถูกไหลย้อนกลับด้วยการกวนอย่างแรงเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ส่วนผสมของปฏิกิริยาถูกทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้องและทำให้เป็นกลางโดยการเติมโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ 10N อย่างค่อยเป็นค่อยไป ตะกอนสีขาวที่เกิดขึ้นถูกกรอง ล้างด้วยน้ำเย็น (3 × 50 มล.) ทำให้แห้งในเตาอบ ( 65 °C) เป็นเวลาหลายชั่วโมง และจากนั้นตกผลึกซ้ำจากเอทิลอะซิเตต/ปิโตรเลียม อีเทอร์เพื่อให้เป็นของแข็งสีขาว (500 มก., 48 %); mp 221–222 °C (แสง 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (s กว้างมาก, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 เฮิร์ตซ์).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z ค่าที่คำนวณได้ สำหรับ C9H8F3N4S (M + H)+: 261.0416 พบ : 261.0419.
แนฟโธ[1,2-d]ไทอาซอล-2-เอมีน (300 มก., 1.5 มิลลิโมล) สังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ถูกให้ความร้อนที่ 200 °C ในอ่างน้ำมันในหลอดทดลองขนาดเล็ก ไซยานาไมด์ 300 มก. (มากเกินไป) และ เข้มข้น 1.0 มิลลิลิตร เติมกรดไฮโดรคลอริกอย่างรวดเร็วลงในสารประกอบร้อนและของผสมถูกเก็บไว้ในอ่างน้ำมันเป็นเวลาประมาณ 2 นาที ในระหว่างนั้นน้ำส่วนใหญ่ระเหยไป จากนั้นของผสมปฏิกิริยาถูกทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้องและผลลัพธ์ที่ได้คือวัสดุแข็งตัว แตกเป็นชิ้นเล็กๆ แล้วล้างด้วยน้ำเพื่อให้ได้ของแข็งอสัณฐานสีเหลืองอ่อน (38 มก., 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8.6 เฮิรตซ์), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 เฮิรตซ์), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 เฮิรตซ์), 8.35 (d , 1 H, J = 8.3 เฮิรตซ์).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): ค่าที่คำนวณได้ m/z สำหรับ C12H11N4S (M + H)+: 243.0699 พบ: 243.0704.
วัดกระแสโปรตอนในส่วนภายในและภายนอกของโอโอไซต์ซึ่งแสดงโครงสร้างที่แตกต่างกันโดยใช้เครื่องขยายสัญญาณ Axopatch 200B ที่ควบคุมโดย Axon Digidata 1440A (อุปกรณ์ระดับโมเลกุล) พร้อมซอฟต์แวร์ pClamp10 สารละลายในเซลล์และนอกเซลล์มีองค์ประกอบเหมือนกัน: 100 มิลลิโมลาร์ 2-(N-morpholino )กรดอีเทนซัลโฟนิก (MES), เมไซเลตเตตระเอทิลแอมโมเนียม (TEA) 30 มิลลิโมลาร์, TEA คลอไรด์ 5 มิลลิโมลาร์, เอทิลีนไกลคอล-บิส(2-อะมิโนเอทิล)-N,N,N',N'-เตตระอะซิติก (EGTA) 5 มิลลิโมลาร์ ปรับเป็น pH 6.0 ด้วย TEA ไฮดรอกไซด์ การวัดทั้งหมดดำเนินการที่ 22 ± 2 °C ปิเปตมีความต้านทานในการเข้าถึง 1.5–4 MΩ ร่องรอยปัจจุบันถูกกรองที่ 1 kHz ตัวอย่างที่ 5 kHz และวิเคราะห์ด้วย Clampfit10.2 (อุปกรณ์ระดับโมเลกุล) ) และ Origin8.1 (OriginLab)
สารละลายที่มีความเข้มข้นต่างๆ ของตัวยับยั้ง Hv1 และในบางกรณี 10 มิลลิโมลาร์ βME ถูกนำเข้าไปในอ่างโดยแรงโน้มถ่วงผ่านท่อร่วมที่เชื่อมต่อกับระบบวาล์วกระจาย VC-6 (Warner Instr.) ซึ่งถูกส่งผ่านซอฟต์แวร์ pClamp TTL (ทรานซิสเตอร์- สัญญาณของทรานซิสเตอร์ลอจิก) การทดลองการกำซาบอย่างรวดเร็วดำเนินการโดยใช้ดินสอการกำซาบแบบหลายหลอด (AutoMate Sci.) โดยมีปลายนำส่งเส้นผ่านศูนย์กลาง 360 μm ติดตั้งอยู่ด้านหน้าปิเปตแพตช์ การยับยั้งช่องถูกกำหนดโดยการวัดไอโซโครนัลแอมเพอโรเมตริกที่ส่วนท้ายของ พัลส์ดีโพลาไรซ์ +120 มิลลิโวลต์ การวัด GV ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้18,20 กระแสส่วนท้ายถูกบันทึกที่ -40 มิลลิโวลต์ หลังจากขั้นตอนการดีโพลาไรซ์ที่แรงดันไฟฟ้าที่แตกต่างกันตั้งแต่ -20 มิลลิโวลต์ ถึง +120 มิลลิโวลต์ เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น พัลส์อ้างอิงที่อยู่ข้างหน้าพัลส์ทดสอบคือ ใช้เพื่อแก้ไขการสลายตัวของกระแสไฟฟ้า 18 กราฟ GV เหมาะกับสมการของ Boltzmann:
ค่าคงที่การแยกตัวที่ชัดเจน (Kd) สำหรับการรวมกันของช่องทางและสารยับยั้งที่แตกต่างกัน (ตารางเสริม 1) ถูกกำหนดโดยการปรับการพึ่งพาความเข้มข้นของการยับยั้ง (ค่าเฉลี่ย% ค่ายับยั้ง) ด้วยสมการฮิลล์:
โดยที่ [I] คือความเข้มข้นของตัวยับยั้ง I และ h คือค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ ในการคำนวณค่าสัมประสิทธิ์ฮิลล์ สมการ (2) จะถูกจัดเรียงใหม่เป็น: