Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta alang sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro padayon nga suporta, ipakita namo ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang Hv1 voltage-gated proton channel maoy usa ka dimeric complex nga gilangkuban sa duha ka voltage-sensing domains (VSDs), nga ang matag usa adunay sulod nga gated proton permeation pathway. Ang dimerization kontrolado sa cytoplasmic coiled-coil domain. ang bukas nga estado sa duha ka VSD nahibal-an nga mahitabo sa kooperatiba; bisan pa, gamay ra ang nahibal-an bahin sa nagpahiping mga mekanismo. Ang mga interface sa intersubunit adunay hinungdanon nga papel sa mga proseso sa allosteric; bisan pa, ang ingon nga mga interface wala mailhi sa bukas nga mga channel sa Hv1. Dinhi gipakita namon nga ang 2-guanidinothiazole derivatives nag-block sa duha ka Hv1 VSD sa usa ka kooperatiba nga paagi ug gigamit ang usa niini nga mga compound ingon usa ka pagsusi alang sa allosteric nga pagdugtong tali sa bukas nga mga subunit. katapusan sa unang transmembrane fragment sa VSD nagporma sa usa ka intersubunit interface nga nagpataliwala sa pagkabit tali sa nagbugkos nga mga dapit, samtang ang coiled-coil domain dili direkta nga nalangkit niini nga proseso.Nakakita usab kami lig-on nga ebidensya nga ang channel sa proton-selective filter nagkontrol sa blocker-binding kooperatiba .
Ang mga agianan sa proton nga adunay boltahe adunay hinungdanon nga papel sa lainlaing mga organismo, gikan sa phytoplankton hangtod sa mga tawo1.Sa kadaghanan nga mga selyula, kini nga mga agianan nagpataliwala sa proton efflux gikan sa proton membrane ug nag-regulate sa kalihokan sa NADPH oxidase. mao ang Hv1, nga mao ang produkto sa HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) gipakita nga adunay papel sa B cell proliferation4, produksyon sa reactive oxygen species pinaagi sa natural nga immune system5,6,7,8, sperm cell motility9 ug pH regulation sa airway surface fluid10. Kini nga channel nalangkit sa ubay-ubay nga Overexpressed sa mga matang sa kanser sama sa B-cell malignancies4,11 ug breast ug colorectal cancers12,13. Ang sobra nga Hv1 nga kalihokan nakit-an nga nagdugang sa metastatic nga potensyal sa mga selula sa kanser 11, 12 .Sa utok, ang Hv1 gipahayag pinaagi sa microglia, ug ang kalihokan niini gipakita nga makapasamot sa kadaot sa utok sa mga modelo sa ischemic stroke.
Ang Hv1 nga protina adunay sulod nga boltahe-sensing domain (VSD), nga naglangkob sa upat ka transmembrane nga mga bahin nga gitawag S1 ngadto sa S414. Ang VSD susama sa katugbang nga mga dominyo sa boltahe-gated Na+, K+ ug Ca2+ channels ug boltahe-sensitive phosphatases, sama sa CiVSP gikan sa Ciona gutis15.Niining ubang mga protina, ang C-terminus sa S4 gilakip sa usa ka effector module, ang pore domain o enzyme.Sa Hv1, ang S4 nalambigit sa coiled-coil domain (CCD) nga nahimutang sa cytoplasmic nga bahin sa lamad. .Ang channel usa ka dimeric complex nga gilangkuban sa duha ka VSDs, ang matag usa adunay usa ka gated proton permeation pathway16,17,18.Kining duha ka Hv1 subunits nakit-an nga nag-abli sa kooperatiba19,20,21,22, nagsugyot nga ang allosteric coupling ug inter-subunit nga mga interaksyon nagdula usa ka importante nga papel sa proseso sa gating.Ang interface tali sa mga subunits sulod sa coiled coil domain maayo nga gihubit tungod kay ang kristal nga mga istruktura sa duha ka hilit nga mga domain anaa22,23. Sa laing bahin, ang interface tali sa VSDs sulod sa lamad dili nasabtan pag-ayo.Ang kristal nga istruktura sa Hv1-CiVSP chimeric protein wala maghatag og impormasyon mahitungod niini nga interface, tungod kay ang trimeric nga organisasyon sa crystallized channel complex mahimong resulta sa pag-ilis sa lumad nga Hv1 CCD sa yeast leucine zipper GCN424.
Usa ka bag-o nga pagtuon sa subunit nga organisasyon sa Hv1 channel mihinapos nga ang duha ka S4 helices transisyon ngadto sa CCD nga walay grabe nga pagkabalda sa secondary nga gambalay, nga miresulta sa taas nga helices nga magsugod gikan sa lamad ug proyekto ngadto sa cytoplasm.Based sa cysteine crosslinking analysis, kini nga pagtuon nagsugyot nga ang Hv1 VSDs magkontakay sa usag usa ubay sa S4 nga bahin.Apan, ang ubang mga pagtuon nagsugyot ug alternatibong mga interface tali sa VSDs.Kini nga mga interface naglakip sa S1 nga mga bahin 17, 21, 26 ug sa gawas nga mga tumoy sa S2 nga bahin 21. Usa ka posible nga rason sa nagkasumpaki Ang mga resulta niini nga mga pagtuon mao nga ang allosteric coupling tali sa mga VSD gisusi kalabot sa proseso sa gating, nga nagdepende sa sirado ug bukas nga mga estado, ug ang interface tali sa mga VSD mahimong magkalahi sa lain-laing mga kausaban sa estado sa conformation.
Dinhi, nahibal-an namon nga ang 2-guanidinothiazole nagpugong sa mga channel sa Hv1 pinaagi sa synergistically nga pagbugkos sa duha ka bukas nga VSD, ug gigamit ang usa sa mga compound, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), aron susihon ang interaksyon tali sa mga subunit sa bukas nga estado. interface.Among nakit-an nga ang GBTA binding curve mahimong maayo nga gihulagway sa usa ka quantitative model diin ang pagbugkos sa usa ka inhibitor ngadto sa usa ka subunit moresulta sa pagtaas sa binding affinity sa kasikbit nga subunit.We also found that residues D112, selectivity filters para sa channel 27, 28 ug bahin sa guanidine derivative binding site 29 nagkontrol sa GBTA binding cooperativity.Gipakita namo nga ang cooperative binding gipadayon sa Hv1 dimer, diin ang CCD mibulag gikan sa S4 nga bahin, nga nagsugyot nga ang intersubunit interface sa CCD dili direkta nagpataliwala sa allosteric coupling tali sa GBTA-binding sites.Sa kasukwahi, atong makita nga ang S1 fragment kabahin sa interface tali sa mga subunits ug nagsugyot og usa ka kahikayan sa kasikbit nga VSDs nga adunay extracellular end sa S4 helix nga layo sa sentro sa dimer aron tugutan ang tipik sa S1 nga naa sa bukas nga estado.
Ang gagmay nga mga molekula nga inhibitor sa Hv1 mapuslanon isip anticancer nga mga tambal ug neuroprotective nga mga ahente.Apan, sa pagkakaron, pipila ka mga compound ang nakahimo sa pagpugong sa channel30,31,32,33. Lakip kanila, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, compound [1] sa Fig .1a) ug ang mga derivatives niini nakit-an nga nagbabag sa VSD29,32 permeation sa mga proton pinaagi sa channel. kaniadto gipakita nga makapugong sa Hv1 halos sama ka epektibo sa 2GBI sa dihang gisulayan sa usa ka konsentrasyon nga 200 μM (Figure 1b) .Among gisusi ang ubang mga thiazole derivatives ug nakit-an nga ang uban niini nagpugong sa channel nga adunay susama o mas dako nga potency kay sa GBTA (Fig. 1 ug Supplementaryo). text) .Among gitino ang mga kurba sa pagtubag sa konsentrasyon sa upat ka thiazole derivatives (GBTA ug mga compound [3], [6] ug [11], Fig. 1c) ug nakit-an nga sila mas titip kay sa 2GBI.The Hill coefficients (h) sa thiazole derivatives gikan sa 1.109 ± 0.040 ngadto sa 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c ug Supplementary Fig. 1). Sa kasukwahi, ang Hill coefficient alang sa 2GBI mao ang 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a ug Supplementary Fig. 1). Ang usa ka Hill coefficient sa ibabaw sa 1 nagpakita nga nagbugkos nga kooperatiba. Tungod kay ang matag Hv1 subunit adunay kaugalingong inhibitor- binding site,29,32 nangatarongan kami nga ang pagbugkos sa usa ka thiazole derivative sa usa ka subunit makapauswag sa pagbugkos sa ikaduhang inhibitor nga molekula sa kasikbit nga subunit. Ang GBTA mao ang test compound nga adunay pinakataas nga Hill coefficient. Busa, gipili namo kini nga compound sa dugang nga pagtuon sa mekanismo sa pagbugkos synergy ug gigamit 2GBI ingon nga usa ka reference negatibo nga kontrol.
(a) Test compounds: [1] Reference Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10] ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Pagdili sa kalihokan sa Hv1 sa tawo pinaagi sa gipakita nga guanidinothiazoles ug ang reference compound 2GBI (blue-green bars) .Hv1 proton nga mga sulog gisukod sa sulod-gawas nga mga plake sa Xenopus oocytes agig tubag sa depolarization gikan sa usa ka naghupot nga potensyal sa -80 mV ngadto sa +120 mV.Ang matag inhibitor gidugang sa kaligoanan sa usa ka konsentrasyon sa 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Ang mga datos mao ang mean±SEM (n≥4).(c) Concentration-dependent inhibition sa human Hv1 pinaagi sa compounds [2], [3], [6] ug [11].Ang matag punto nagrepresentar sa mean inhibition ± SD sa 3 ngadto sa 15 ka sukod. Ang linya kay usa ka Hill fit nga gigamit aron makuha ang dayag nga Kd values nga gitaho sa Supplementary Table 1. Ang Hill coefficients gitino gikan sa mga haom nga gitaho sa Supplementary Fig. 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (tan-awa ang Mga Pamaagi).
(a, b) Ang mga compound nga 2GBI ug GBTA nagpugong sa dimeric ug monomeric Hv1 sa usa ka paagi nga nagsalig sa konsentrasyon. Ang matag punto nagrepresentar sa mean inhibition ± SD sa 3 ngadto sa 8 nga mga pagsukod ug ang kurba usa ka Hill fit.The Hill coefficients (h) nga gipakita sa ang inset histograms gitino gikan sa mga haom nga gitaho sa Supplementary Figs 3 ug 4. Ang konsentrasyon nga tubag sa GBTA nga gipakita sa (a) parehas sa Fig. 1c. Tan-awa ang Supplementary Table 1 alang sa dayag nga Kd values.(c) Modeling of ang kooperatiba nga pagbugkos sa GBTA ngadto sa dimeric Hv1. Ang solid nga itom nga linya nagrepresentar sa angay sa eksperimento nga datos pinaagi sa equation (6), nga naghulagway sa binding model nga gipakita sa (d). -dissociation equilibrium curves sa una ug ikaduha nga nagbugkos nga mga panghitabo, matag usa (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Schematic diagram sa gisugyot nga mekanismo sa Hv1 block.Sa kaso sa GBTA, ang pagbugkos sa usa ka open subunit nagdugang sa affinity sa kasikbit nga open subunit (Kd2 Ang mga channel sa Hv1 mahimong monomerized pinaagi sa pag-ilis sa ilang N- ug C-terminal cytoplasmic domain nga adunay katugbang nga mga bahin sa Ciona Intestinalis voltage-sensitive phosphatase CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34. Gisukod namo ang pagsalig sa konsentrasyon sa pagdili sa monomeric Hv1 sa GBTA ug 2GBI ug itandi kini sa dimeric channel (wild-type) nga pagdili (Fig. 2a, b). Among nakita nga ang kalainan sa pagbugkos sa kooperatiba tali sa duha ka mga compound giwagtang sa monomeric Hv1, nga nagsuporta sa pagpatin-aw nga ang GBTA nga nagbugkos sa usa ka subunit nagdugang sa Affinity sa laing subunit alang sa inhibitor.Nangatarungan kami nga ang GBTA nga nagbugkos sa usa ka Hv1 nga subunit mahimong mosangpot sa pag-usab sa binding site (pag-aghat sa fit35), nga magpahinabo sa pag-usab sa bakanteng binding site sa kasikbit nga subunit, nga mosangpot sa dugang nga pagbugkos pagkasuod.
Sa quantitatively nga paghulagway sa kooperatiba nga pagbugkos sa GBTA ngadto sa channel, gigamit namo ang usa ka modelo diin ang bisan unsang subunit makagapos sa unang inhibitor nga molekula human sa bimolecular nga reaksyon nga adunay dissociation constant Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO + B ⇆ BO *). Ang pagbugkos hinungdan nga ang channel mosagop sa usa ka estado diin ang nahabilin nga walay sulod nga mga subunit nagbugkos sa inhibitor nga nagsunod sa usa ka talagsaon nga bimolecular nga reaksyon nga adunay usa ka dissociation constant Kd2, diin Kd2 Ang solid nga itom nga linya sa Figure 2c mao ang angay sa modelo nga equation sa eksperimental nga konsentrasyon-response curve, nga naghatag og Kd1 sa ~ 290 μM ug usa ka Kd2 sa ~ 29 μM (Methods section, equation (6)). ang pagbugkos sa 2GBI, diin ang Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d).Sa monomeric Hv1, adunay usa lamang ka binding site ug usa ka Kdm (O° + B ⇆ B°).Sa kaso sa GBTA, ang Kdm anaa sa palibot sa 54 μM, nga mas susama sa Kd1 kay sa Kd2 (Fig. 2d). affinity state (OO) sa dimer, lagmit tungod sa pagwagtang sa interface tali sa mga subunit.
Sama sa gipakita kaniadto alang sa 2GBI32, among nakita nga ang GBTA nagpugong sa Hv1 nga mga sulog pinaagi sa pag-ali sa channel sa dihang kini bukas kay sa paghimo niini nga mas lisud sa pag-abli (Supplementary Fig. 2a, b, d). agig tubag sa repolarization sa lamad, apan kini nga panghitabo wala maobserbahan sa GBTA (Supplementary Fig. 2c). Sa presensya sa Hv1 inactivation sa presensya sa 2GBI, ang mga ganghaan sa matag subunit dili makasira hangtud nga ang blocker mobiya sa binding site (ang " foot gate” nga mekanismo), ug 2GBI unbinds mas hinay kay sa mga gate close. Kung ang usa ka Hv1 subunit ma-unblock ug sirado, samtang ang kasikbit nga subunit magpabilin nga gibabagan, ang unbinding sa nahabilin nga 2GBI molecules mahimong mas hinay (blocker capture).Long-lived channel species nga adunay usa lamang ka gibabagan nga subunit ang nagpahigayon sa mga proton nga temporaryo sa dili pa magsira ug makahimo og dakong kontribusyon sa hinay nga pagkadunot nga ikog nga sulog.
Ang pagpangita nga ang pagkadunot sa Hv1 tail currents dili kaayo hinay sa presensya sa GBTA (Supplementary Fig. 2c) nahiuyon sa usa ka synergistic binding mechanism alang niini nga blocker (Fig. 2d). , ang affinity sa blocker ngadto sa kasikbit nga subunit mikunhod mga 10 ka pilo, nga gipaboran ang dili pagbugkos nga proseso. Kini nagpasabot nga ang ikaduha nga molekula sa GBTA adunay mas taas nga kahigayonan sa pag-unraveling sa dili pa kini ma-trap sa channel. Long-lived channel species nga makahimo lamang sa usa ka blocking subunit gilauman nga mas daghan sa atubangan sa GBTA kay sa atubangan sa 2GBI, nga moresulta sa mas paspas nga ikog kasamtangan nga pagkadunot.
Aron ang GBTA maghiusa sa pagbugkos sa duha ka Hv1 nga mga subunit, ang mga binding site kinahanglan nga allosterically coupled. Ang matag binding site kinahanglan nga makahimo sa: 1) pag-trigger sa usa ka kutay sa mga panghitabo nga nakigsulti sa kasikbit nga mga subunit nga gigapos sa inhibitor, ug 2) pagpataliwala sa transisyon gikan sa low-affinity ngadto sa high-affinity binding.Nangatarungan kami nga kung ang piho nga mga residu sa sulod sa binding site nakatampo sa proseso sa kooperatiba, ang ilang mutation kinahanglan nga mag-usab sa Hill coefficient sa concentration-response curve sa GBTA inhibition sa Hv1.Residues D112, F150 , S181 ug R211 kaniadto gipakita nga kabahin sa 2GBI29 binding environment ug among hypothesized nga parehas sila nga maapil sa GBTA binding (Fig. 3A). Among gisukod ang inhibitory concentration-response curves sa GBTA alang sa mutant channels D112E, F150A, S181A. , ug R211S (Figure 3) ug gitandi ang ilang Hill coefficients sa mga Hv1 wild-type, gamit ang 2GBI isip reference.Residue V109 anaa sa samang nawong sa S1 nga bahin sa D112 ug adunay usa ka extra helical turn sa sulod sa cell. Ang V109 wala maapil sa pagbugkos sa 2GBI29, gigamit namon ang V109A mutant ingon usa ka kontrol (Fig. 3b).
(a) Gisugyot nga Hv1 residues nga nalangkit sa guanidine derivative binding.Ang mga naputol nga asul nga kurba naglibot sa gisugyot kaniadto nga mga side chain nga nakig-uban sa lain-laing mga bahin sa compound 2GBI29.(bf) Concentration-dependent inhibition sa gipakita nga Hv1 mutants pinaagi sa compounds 2GBI (cyan) ug GBTA ( itom nga pula).Ang matag punto nagrepresentar sa mean inhibition sa 3 ngadto sa 12 ka sukod ± SD V109 isip negatibong kontrol. Ang mga kurba maoy mga Hill nga angayan nga gigamit aron makuha ang dayag nga Kd values (tan-awa ang Supplementary Table 1). Ang Hill coefficients (h) gipakita sa ang inset histograms gitino gikan sa mga haom nga gitaho sa Supplementary Figs 3 ug 4. Reference h values para sa Hv1 WT gipakita isip dashed lines. Ang mga asterisk nagpakita sa istatistikal nga mahinungdanong kalainan tali sa mutant ug WT nga mga tudling (p Among nakit-an nga ang D112E mutation dako nga pagkunhod sa Hill coefficient (p Ang pagpangita nga ang Hill coefficient alang sa GBTA binding mas taas kay sa 1 sa Hv1 dimer ug nahimong ~1 sa monomeric channel (Fig. 2b) nahiuyon sa paglungtad sa allosteric nga mga interaksyon tali sa mga binding sites sa duha ka subunits. ang kaso, ang Hill coefficient sa GBTA nga nagbugkos sa dimer diin ang blocker gigapos sa usa ka subunit kinahanglan nga ~ 1. Among gisulayan kini nga panagna sa Hv1 F150A-WT nga nalambigit nga dimer (Fig. 4a), diin ang affinity sa F150A subunit alang sa GBTA labaw pa sa 2 nga mga order sa magnitude nga mas taas kay sa WT subunit (Fig. 1c ug 3d). Dayon among gisukod ang konsentrasyon-response curves alang sa pagdili sa WT subunit sa basal nga konsentrasyon sa 2 μM GBTA. Niini nga konsentrasyon , ang blocker gilauman nga mogapos sa gibana-bana nga 99% sa F150A subunit ug (a) Schematic diagram sa F150A-WT junction dimer nga gigamit sa pagmugna sa blocking hemichannel ({F150A}b-WT/BAO*).Gipakita sa puti nga mga diamante ang lokasyon sa mutation. ang affinity sa F150A subunit gilauman nga mas taas kay sa WT subunit.(b) Proton currents gikan sa F150A-WT channels gisukod isip tubag sa mga kausaban sa membrane potential gikan sa −80 mV ngadto sa +120 mV.pHi = pHo = 6.0 .Grey nga mga pagsubay nagrepresentar sa mga sulog nga gisukod sa pagkawala sa tigpugong.Ang itom nga pagsubay (kontrol) nagrepresentar sa kasamtangan nga gisukod human sa pagdugang sa 2 μM GBTA.Niini nga konsentrasyon, ang WT subunit wala kaayo gipugngan, samtang ang F150A subunit gigapos hapit sa hingpit sa GBTA ({F150A}b-WT).Usa ka dugang nga pagtaas sa GBTA nga konsentrasyon miresulta sa pagbabag sa WT subunit (orange ug pula nga mga pagsubay).(c) Concentration-dependent inhibition sa {F150A}b-WT dimer (inhibitor pre-bound to F150A subunit) .Ang matag punto nagrepresentar sa mean inhibition ± SD sa 3 ngadto sa 7 nga pagsukod. Ang mga kurba kay Hill nga gigamit aron makuha ang dayag nga Kd values nga gitaho sa Supplementary Table 1. Ang Hill coefficients nga gipakita sa inset histograms gitino gikan sa mga haom nga gitaho sa Supplementary Figs 3 ug 4. Ang h values sa Hv1 WT kay gipakita isip dashed nga mga linya.Ang mga asterisk nagpakita sa istatistikal nga mahinungdanong kalainan kon itandi sa WT dimer Hv1 (p Tungod kay ang GBTA inhibition sa Hv1 gisukod sa open channel, kami nangatarongan nga ang GBTA binding cooperativity mahimong magamit sa pagtuon sa mekanismo sa intersubunit coupling sa open state.Kining duha ka Hv1 subunits kaniadto nakit-an nga cooperatively gated 19,20,21, 22 ug ang intersubunit coupling nga nalambigit sa gating gisugyot nga ipataliwala sa cytoplasmic coiled-coil domain (CCD) 22, 25. Busa, nangutana kami kung ang CCD ba usab nalambigit sa pagdugtong tali sa GBTA-binding sites sa open state.Triglycine Ang mga mutasyon sa interface tali sa S4 transmembrane fragment ug sa coiled-coil domain gipakita sa naunang mga pagtuon aron sa pag-decouple niini nga domain gikan sa ubang bahin sa channel samtang nagmintinar sa dimerization integrity.Busa, among gisulayan ang epekto sa mutations V220G, K221G ug T222G (Fig .5a, GGG mutant) sa GBTA binding cooperativity.Nakit-an namo ang usa ka estatistika nga dili importante (p> 0.05) nga pagkunhod sa Hill coefficient sa GBTA nga nagbugkos sa GGG channels kumpara sa wild type (Fig. 5c), nga nagsugyot nga bisan pa sa papel niini sa pagpadayon sa duha ka subunit nga magkauban importante, apan ang CCD dili direkta nga nagpataliwala sa intersubunit allosteric coupling tali sa GBTA binding sites.
(a) Schematic diagram sa Hv1 dimer nga adunay triglycine mutation sa sulod nga tumoy sa S4 nga gidisenyo aron mabalda ang intersubunit coupling nga gipataliwad-an sa cytoplasmic coiled-coil domain (blue arrows).(b) Schematic representation sa Hv1 dimers ug ligation dimers nga adunay Gipakita nga mga mutasyon, nga gidisenyo aron sulayan ang mga tipik sa S1 nga nalangkit sa pagdugtong sa taliwala sa mga subunits (asul nga mga pana).(c-h) Ang 2GBI (cyan) ug GBTA (dark red) nagpugong sa gipakita nga mga konstruksyon sa usa ka paagi nga nagsalig sa konsentrasyon. Ang matag punto nagrepresentar sa mean inhibition ± SD sa 3 hangtod 10 ka sukod. Ang kurba kay usa ka Hill fit nga gigamit sa pagkuha sa dayag nga Kd values (tan-awa ang Supplementary Table 1). Ang Hill coefficients sa interpolated histograms gitino nga gihulagway sa Methods section (tan-awa ang Supplementary Figs 3 ug 4). Reference h values para sa Ang Hv1 WT gipakita isip mga dashed nga linya. Ang mga asterisk nagpakita sa istatistikal nga mahinungdanong kalainan tali sa mutant ug WT nga mga tudling (p Tungod kay among gisalikway ang CCD isip direktang tigpataliwala sa GBTA nga kooperatiba nga pagbugkos, among gipangutana kung ang mga interaksyon tali sa mga VSD nalangkit sa allosteric coupling tali sa mga binding sites.Among nakit-an nga ang GBTA-binding cooperativity giwagtang pinaagi sa konserbatibong mutation sa residue D112 (Fig. 3c) nga nahimutang sa S1 transmembrane nga bahin.S1 naglangkob sa duha ka laing negatibo nga gikarga residues, E119 ug D123, nga nahimutang sa sama nga kilid sa helix sama sa D112, apan mas duol sa gawas nga tumoy 24 sa tipik. Ang sayo nga molekular dynamics simulations nagpakita nga kini nga mga residues nalambigit ngadto sa D112 pinaagi sa waterlines36,37.Busa, among gisulayan kon ang E119 ug D123 nalangkit sa allosteric coupling tali sa GBTA-binding sites (Fig 5b). apan sa pikas bahin sa S1 helix (Fig. 5b).
Among gisukod ang konsentrasyon nga nagsalig sa pagpugong sa E119A, D123A ug K125A nga mga kanal sa 2GBI ug GBTA ug nakit-an nga ang E119A ug K125A mutations wala kaayo makausab sa Hill coefficient sa bisan hain nga inhibitor kumpara sa wild type (p> 0.05, Fig. 5d,i) ). Sa laing bahin, ang mutation D123A mahinungdanon nga nakunhuran ang Hill coefficient sa GBTA (p 0.05/14).
Tungod kay ang pag-neutralize sa bayad sa posisyon nga 123 sa duha ka mga subunit miresulta sa usa ka kusog nga pagbag-o sa GBTA binding cooperativity, samtang ang pag-reverse sa charge sa duha ka mga subunit adunay gamay ra nga epekto, among gipalapdan ang pag-analisar aron maapil ang usa lamang ka subunit nga adunay inversion channel sa bayad.Kami nakamugna og Hv1-linked dimers nga adunay D123R substitution sa C-terminal subunit (Fig. 5b) ug gisukod ang konsentrasyon-response inhibition sa GBTA ug 2GBI.Among nakit-an nga ang Hill coefficient sa GBTA nga nagbugkos sa mga channel sa WT-D123R mas taas kay niana sa wild-type nga Hv1 (p Nakita usab namo nga ang mutation sa D112E nagwagtang sa pagtaas sa GBTA-binding Hill coefficient nga gihimo sa WT-D123R background (Fig. 5b, h ug Supplementary Fig. 4). Ang epekto sa Hill coefficient sa 2GBI binding giwagtang usab ( Fig. 5h ug Supplementary Fig. 3). Kini nga mga nahibal-an nagsugyot nga ang gipaayo nga allosteric coupling tali sa mga subunit nga gipahinabo sa kaatbang nga mga singil sa posisyon nga 123 wala maghubad ngadto sa mas lig-on nga pagbugkos sa kooperatiba kung ang binding site sa posisyon D112 nadisturbo.
Nangatarungan kami nga kung ang mga nahabilin nga D123 sa kasikbit nga bukas nga mga subunit hapit nga magkasuod sa electrostatically sa usag usa, ang dili maayo nga interaksyon tali sa negatibo nga mga singil mabag-o sa kombinasyon sa negatibo ug positibo nga mga singil pinaagi sa pag-ilis sa aspartic acid sa arginine. madanihon nga interaksyon tali kanila.Usa ka subunit (WT-D123R dimer) .Ang madanihon nga mga interaksyon makapalig-on sa interface tali sa gawas nga mga tumoy sa tipik sa S1, nga mosangpot ngadto sa mas lig-on nga allosteric coupling tali sa mga subunits ug nagdugang sa GBTA-binding cooperativity.
Aron masuportahan kini nga pangagpas, nangita kami usa ka paagi aron mapalig-on ang interface tali sa gawas nga mga tumoy sa bahin sa S1, nga lahi sa pagbalhin sa bayad sa posisyon nga 123. Lee ug uban pa. aron moresulta sa kusog nga intersubunit nga cross-linking17. Dugang pa, ang kristal nga istruktura sa Hv1-CiVSP chimeric VSD nagpakita nga ang I127 gibulag gikan sa gawas nga tumoy sa S1 helix pinaagi sa usa lamang ka residue24. Busa nangutana kami kung ang pagporma sa usa ka covalent bond tali sa cysteinees sa posisyon 127, nga gilauman nga moresulta sa usa ka mas lig-on nga S1-S1 nga interaksyon, adunay epekto sa GBTA binding cooperativity susama sa naobserbahan pinaagi sa pagbag-o sa singil sa posisyon 123.
Among gisukod ang konsentrasyon nga nagsalig sa pagpugong sa Hv1 I127C sa GBTA ug 2GBI sa presensya ug pagkawala sa 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fig. 6a). Sa samang higayon nga ang inhibitor gidugang sa intracellular solution, ang pagkunhod ahente gidugang ngadto sa extracellular solution.Usa ka nalambigit nga dimer nga adunay cysteine substitution sa usa lang ka subunit (WT-I127C) gigamit isip negatibong kontrol (Fig. 6a). tali sa I127C subunits sa 2GBI inhibition, tungod kay ang Hill coefficient alang sa I127C nga nagbugkos sa Hv1, nga adunay o wala ang βME, lahi kaayo kay sa paggapos sa monocysteine substituted dimers. Ang Hill coefficient dili makalahi sa WT-I127C (Fig. 6b ug Supplementary Fig. 3). Sa dakong kalainan, among gisukod ang dramatikong epekto sa kusog nga intersubunit crosslinking sa GBTA inhibition. Ang Hill coefficient alang sa pagbugkos sa Hv1 I127C sa pagkawala sa βME (crosslink on) mas taas kay sa gisukod sa presensya sa βME (crosslink off) o paggamit sa WT-127C aron masumpay ang dimer (kon walay crosslink) (Fig. 6c ug Supplementary Fig. 4), nga nagpakita nga ang allosteric coupling tali sa mga nagbugkos nga mga dapit gipauswag pag-ayo pinaagi sa pagporma sa disulfide bonds tali sa gawas nga mga tumoy sa mga tipik sa S1. Kini nga mga resulta nagsuporta sa among interpretasyon nga ang madanihon nga electrostatic interaction sa aspartate ug arginine sa posisyon nga 123 sa WT-D123R dimer moresulta sa dugang nga allosteric coupling tali sa ang mga subunit.
Ang open-state coupling gipataliwala pinaagi sa direktang pisikal nga interaksyon tali sa gawas nga tumoy sa S1 nga bahin sa duha ka subunits.
(a) Ang eskematiko nga representasyon sa mutant Hv1 dimer ug linker dimer, gidesinyo sa pag-imbestigar kon sa unsang paagi ang intersubunit cysteine crosslinks makaapekto sa GBTA binding cooperativity.(bd) Concentration-dependent inhibition sa gipakitang constructs sa 2GBI (b,d) ug GBTA (c, e) sa presensya o pagkawala sa 10 mM βME sa extracellular solution.Ang matag punto nagrepresentar sa mean inhibition ± SD sa 3 ngadto sa 10 measurements. Ang kurba maoy usa ka Hill fit nga gigamit aron makakuha og Kd values (tan-awa ang Supplementary Table 1). Ang mga coefficient sa bungtod sa inset histograms gitino gikan sa mga haom nga gitaho sa Supplementary Figs 3 ug 4. Ang mga asterisk sa (c,e) nagpaila sa mahinungdanong mga kalainan sa istatistika. tali sa lain-laing mga kondisyon sa pagdili sa GBTA (p Nakita usab namo nga sa pagkawala sa βME, ang Hill coefficient sa GBTA nga nagbugkos sa D112E I127C Hv1 dimer mas taas kay sa gisukod sa presensya sa mga pagkunhod sa ahente (Fig. 6e ug Supplementary Fig. 4), nga nagpasabot nga Ang D112E mutation wala giwagtang ang pagtaas sa GBTA binding cooperativity nga resulta sa cross-linking sa cysteine 127. Ang Hill coefficient sa 2GBI nga nagbugkos sa D112E, I127C Hv1 dimers wala usab maapektuhan sa D112E mutation (Figure 1).6d ug Supplementary Fig. 3).
Gihiusa, kini nga mga nahibal-an nagsugyot nga ang pagbugkos sa GBTA gipauswag pinaagi sa interaksyon tali sa gawas nga mga tumoy sa mga tipik sa S1 sa kasikbit nga mga subunit sa Hv1 pinaagi sa madanihon nga mga interaksyon sa electrostatic o pinaagi sa pagporma sa mga covalent bond tali sa gipuli nga mga cysteinees Ang Allosteric nga pagdugtong sa taliwala sa mga site nagdugang ug nagresulta sa pagbugkos sa kooperatiba. Samtang ang epekto sa madanihon nga mga interaksyon sa electrostatic sa kooperatiba mahimong mawagtang pinaagi sa mutation D112E, ang epekto sa covalent bonds dili mahimo.
Sa among eksplorasyon sa kemikal nga luna nga anaa alang sa pagbugkos sa guanidine derivatives ngadto sa Hv1 channels, among nakita nga ang 2-guanidinothiazoles sama sa GBTA adunay mas taas nga konsentrasyon nga pagsalig kay sa 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). ug monomeric channels (Fig. 2a, b) ug sa dimeric channel diin ang usa ka subunit pre-bound sa inhibitor (Fig. 4) nagdala kanato sa paghinapos nga ang pagdili sa Hv1 sa GBTA Ang aksyon usa ka synergistic nga proseso, ug ang mga binding sites sa compounds sa duha ka subunits allosterically coupled.Ang pagkadiskobre nga ang GBTA nagbugkos sa open channel, sama sa gipakita kaniadto alang sa may kalabutan nga compound 2GBI32, nagsugyot nga ang allosteric coupling mahimong espesipikong masusi sa open state.Our cooperative binding model nakahimo sa quantitatively paghulagway sa pagdili sa Hv1 sa GBTA (Fig. 2c) ug pagpatin-aw sa lain-laing mga epekto sa 2GBI ug GBTA sa pagkadunot sa channel ikog sulog human sa lamad repolarization, nga nagsuporta sa atong paghubad sa proseso sa pagbugkos.
Ang pinakataas nga Hill coefficient nga mahimong makab-ot sa allosteric protein nga adunay duha ka binding sites (sama sa Hv1) mao ang 2.Among gisukod ang GBTA aron mabugkos ang Hv1 wild-type nga adunay coefficient nga 1.31, nga misaka ngadto sa 1.88 sa Hv1 I127C. Ang synergistic nga libre nga enerhiya, ang kalainan tali sa nagbugkos nga libre nga kusog sa labing ubos ug labing taas nga mga lugar sa pagkadugtong (tan-awa ang Mga Pamaagi), mao ang 1.3 kcal/mole sa kaso sa Hv1 wild-type ug 2.7 kcal/mole sa kaso sa Hv1 I127C.Ang pagbugkos sa oxygen ngadto sa hemoglobin mao ang labing inila ug maayo nga gitun-an nga panig-ingnan sa collaborative nga proseso38.Alang sa tawhanong hemoglobin (usa ka tetramer nga adunay upat ka allosterically coupled binding sites), ang Hill coefficient gikan sa 2.5-3.0, nga adunay mga kantidad gikan sa 1.26 ngadto sa 3.64 kcal/mol, depende sa eksperimento nga mga kondisyon38. Busa, sa mga termino sa global energetics, ang kooperatiba sa GBTA nga nagbugkos sa Hv1 dili dako nga kalainan gikan sa O2 nga nagbugkos sa hemoglobin sa diha nga ang lain-laing mga gidaghanon sa mga protina subunits sa duha ka mga sistema gikonsiderar.
Sa among synergy nga modelo, ang pagbugkos sa mga molekula sa GBTA ngadto sa usa ka subunit moresulta sa pag-usbaw sa binding affinity sa kasikbit nga subunit.Among gilantaw ang usa ka proseso diin ang pag-usab sa binding environment nga resulta sa unang binding event (induced fit) mosangpot ngadto sa pagbag-o sa mga interaksyon tali sa mga subunit.Agig tubag niini nga mga pagbag-o, ang kasikbit nga mga subunit nagbag-o sa ilang mga binding site, nga miresulta sa mas hugot nga pagbugkos sa GBTA.Atol niini nga proseso, ang S1 aspartate D112 maoy responsable sa pag-usab sa binding site nga nalangkit sa dugang nga binding affinity.D112 gipakita kaniadto nga bahin sa Hv1 proton permeation pathway ug molihok isip selectivity filter27,28. Ang among mga resulta nagpakita nga ang selectivity filters sa duha ka Hv1 subunits allosterically combed sa open state.Figure 7a nagpakita sa gibana-bana nga lokasyon sa GBTA binding site ug ang lokasyon sa residues D112, D123, K125 ug I127 sa usa ka schematic sa Hv1 VSD based sa kristal nga estraktura sa Hv1-CiVSP chimera.Gisugyot nga mga direksyon alang sa allosteric coupling nga naglambigit sa extracellular end sa S1 gipakita uban sa itom nga mga pana.
(a) Schematic sa Hv1 VSD.Base sa kristal nga estraktura sa Hv1-CiVSP chimera, ang helical nga mga bahin gipakita nga cylindrical.Niini nga configuration, ang sulod nga tumoy sa S4 nga bahin naghiusa sa CCD (wala gipakita). Ang gitagna nga mga lokasyon sa gihigot nga GBTA gipakita nga gray nga mga oval. Ang itom nga mga pana nagpakita sa mga agianan nga nalambigit sa allosteric nga pagdugtong tali sa mga nagbugkos nga mga dapit sa duha ka kasikbit nga mga subunit. sa duha ka lain-laing mga dimer configurations ingon nga makita gikan sa extracellular nga bahin sa membrane plane.Sa wala nga panel, ang dimer interface naporma sa S4 helix.Rotation sa duha ka VSDs 20 degrees clockwise sa palibot sa usa ka axis perpendicular sa lamad eroplano, inubanan sa pagbulag sa gawas nga mga tumoy sa duha ka S4 helice (dashed arrows), nagpatungha sa kahikayan nga gipakita sa tuo.Niini nga configuration, ang mga residues D123 ug I127 gikan sa kasikbit nga mga subunit gitugotan nga magkaduol.(c) Schematic representation sa CiVSP VSD sa dimer configuration nga makita sa 4G80 crystal structure.Position P140 sa CiVSP katumbas sa posisyon D123 sa Hv1.
Gipakita sa among mga resulta nga ang repulsive electrostatic interaction tali sa residue 123 (123D / 123D o 123R / 123R) nalangkit sa usa ka "normal" nga lebel sa GBTA-binding cooperativity sa open state ug gibalhin ang interaksyon gikan sa repulsion ngadto sa Attracted (123D / 123R) , dugang nga kooperasyon (Fig. 5g). Gilauman nga ang pagtangtang sa makasukol nga interaksyon sa alanine substitution mosangpot usab sa dugang nga kooperatiba. Apan, ang pagkunhod sa kooperatiba sa 123A / 123A dimer naobserbahan (Fig. 5e). Usa ka posible Ang pagpatin-aw mao nga ang destabilizing nga epekto sa pagbutang sa hydrophobic residues sa usa ka hydrophilic environment mahimong mas labaw pa sa stabilizing effect tungod sa pagwagtang sa mga repulsive interaction tali sa D123 residues, nga moresulta sa usa ka kinatibuk-ang pagkunhod sa binding cooperativity. Mony et al.39 bag-o lang nagtaho nga solvent accessibility sa Ang posisyon D171 sa Ciona gutis Ci-Hv1 (katumbas sa D123 sa Hv1 sa tawo) nadugangan sa pagpaaktibo, nga nagsuporta sa ideya nga ang D123 nahimutang sa usa ka hydrophilic nga palibot sa bukas nga estado.
Ang gating sa Hv1 channels nahibal-an nga mahitabo pinaagi sa daghang mga transisyon19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 nakit-an nga sa depolarization sa lamad, ang sensor sa boltahe sa Ci-Hv1 nakaagi sa usa ka pagbag-o sa conformational nga nagbilin sa channel nga aktibo apan sirado gihapon. , Gisundan sa usa ka lahi nga transisyon nga maoy hinungdan sa mga proton sa pag-abli sa conduction sa duha ka subunits nga agianan.Ang conformational nga pagbag-o sa boltahe sensor gimonitor sa boltahe-clamp fluorescence, ug kini nakit-an nga ang ikaduha nga transisyon pinili nga gisamok sa mutation sa posisyon D171. Ang perturbation sa fluorescent signal nahiuyon sa presensya sa electrostatic interaksyon tali sa D171 residues sa kasikbit nga mga subunits sa usa ka punto ubay sa reaksyon nga mga coordinate sa conformational change.Kini nga interpretasyon nahiuyon sa among pagpangita nga ang D123 residue electrostatically interaksyon sa open state. ug nagpataliwala sa allosteric coupling tali sa GBTA binding sites.
Gisugyot ni Fujiwara et al25 nga ang dimer interface sa cytoplasmic coiled-coil domain moabot ngadto sa lamad nga adunay duha ka S4 helices (Fig. 7b, left panel). Usa ka modelo niini nga intersubunit interaction gibase sa cysteine cross-linking analysis nga naglangkob ang tibuok VSD ug functional analysis sa rehiyon nga nagkonektar sa S4 helix ug sa CCD. Kung walay transmembrane pH gradient, ang Hv1 nga mga channel nanginahanglan og igo nga depolarization sa lamad aron maablihan, ug ang cysteine crosslinking mahitabo ubos sa mga kondisyon diin ang channel kasagarang sirado. Busa, ang nakit-an nga S4-S4 nga interface lagmit nagpakita sa off-state nga subunit configuration.Ang ubang mga pagtuon nakakaplag og ebidensya sa pagkalambigit sa S1 ug S2 sa intersubunit nga interaksyon atol sa gating17,21,26 nga nagsugyot nga ang mga channel mahimong mosagop sa lain-laing mga subunit configurations sa bukas ug sirado nga mga estado, usa ka ideya nga nahiuyon sa mga nahibal-an ni Mony et al. Ang S1 naglihok 39 atol sa pag-gating.
Dinhi, gipakita namo nga, sa bukas nga estado, ang mga extracellular nga tumoy sa S1 helix igo nga duol sa pagsuporta sa direktang electrostatic nga mga interaksyon nga nagpataliwala sa allosteric coupling tali sa mga subunits. gawas sa usag usa nga direktang makig-interact.Bisan pa, ang usa ka 20 ° clockwise rotation sa duha ka VSD subunits sa palibot sa usa ka axis perpendicular sa membrane plane, inubanan sa pagbulag sa gawas nga tumoy sa duha ka S4 helices, miresulta sa usa ka S1-S1 configuration makanunayon. uban sa among mga nahibal-an (Fig. 7b, tuo nga panel).Among girekomendar kini nga configuration alang sa channel sa open state.
Bisan tuod ang CiVSP enzyme gituohan nga naglihok isip monomer, ang kristal nga istruktura sa nahilit nga VSD niini nakuha sa usa ka dimer nga estado. alang sa Hv1 (Fig. 7c) .Sa CiVSP dimer, ang pinakaduol nga residue gikan sa kasikbit nga subunit mao ang proline sa posisyon nga 140 (Fig. 7c). Makaiikag, P140 sa CiVSP katumbas sa posisyon D123 sa Hv1.Ang pagkaparehas sa subunit configuration tali sa Hv1. ug ang mga dimer sa CiVSP nagsugyot nga ang mga VSD niini nga mga protina adunay intrinsic nga kalagmitan nga mahimong usa ka interface diin ang mga extracellular nga tumoy sa S1 nakig-uban.
Ang hinungdanon nga papel sa Hv1 sa pagpaaktibo sa sperm cell naghimo niini nga channel nga usa ka madanihon nga target sa tambal alang sa pagkontrol sa pagkamabungahon sa lalaki. survival sa mga pasyente nga adunay breast 12 o colorectal cancer 13 ug gituohan nga makatampo sa B-cell malignancies 11 .Busa, ang gagmay nga molekula nga mga tambal nga nagpunting sa Hv1 mahimong gamiton isip neuroprotective agents o anticancer therapeutics. bukas nga subunit sa Hv1, nga motultol sa dugang nga pagbugkos nga kalambigitan, mahimong mosangpot sa pag-uswag sa mas kusgan nga mga tambal nga nagpunting sa Hv1 nga mga channel.
Ang mutagenesis nga gitumong sa site sa tawo Hv1 gihimo gamit ang standard nga mga teknik sa PCR.Sa Hv1NCCiVSP construct, residues 1-96 ug 228-273 sa Hv1 gipulihan sa residues 1-113 ug 240-576 sa CiVSP18.Sa Hv1-linked dimer, ang C-terminus sa usa ka subunit nalambigit sa N-terminus sa ikaduhang subunit pinaagi sa GGSGGSGGSGSGGSGG linker.Ang pGEMHE plasmids nga naglangkob sa lain-laing mga constructs kay linearized sa Nhe1 o Sph1 restriction enzymes (New England Biolabs) ug RNA synthesis gihimo uban sa T7 mMessage mMachine transcription kit (Ambion).1-3 ka adlaw sa wala pa ang electrophysiological measurements, ang cRNA gi-inject sa Xenopus oocytes (50 nl kada cell, 0.3-1.5 μg/μl). Stage V ug VI oocytes gikan sa Xenopus laevis (NASCO) nakuha. gikan sa Ecocyte Bioscience.Pagkasunod sa RNA injection, ang mga selula gimentinar sa ND96 medium nga adunay 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gentamicin, pH 18 °C.2 .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole[2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- Ang 5-carboxylate [9] ug (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate [10] gikan sa Sigma-Aldrich. Ang Famotidine [7] gikan sa MP Biomedicals.1-[4 -(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] ug 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-yl]guanidine [12] maoy gikan sa Matrix Scientific.Kini nga mga compound adunay labing taas nga kaputli nga magamit sa komersyo.Gitunaw sila sa uga nga DMSO aron makamugna og 100 mM stock solution, nga dayon lasaw sa recording solution sa gusto nga katapusang konsentrasyon.Ang mga compound 3 ug 4 gi-synthesize sa ubos sa labing menos 99% kaputli.
Sa usa ka suspension sa 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) sa 25 mL sa tubigon nga hydrochloric acid (2.5 N) gidugang solid dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), ug ang resulta heterogeneous mixture ang refluxed uban sa kusog nga stirring alang sa 4 ka oras. Ang reaksyon sagol nga gipabugnaw sa lawak temperatura ug neutralized pinaagi sa hinay-hinay nga pagdugang sa 10N potassium hydroxide. 65 °C) sulod sa pipila ka oras, ug dayon i-recrystallize gikan sa ethyl acetate/petroleum ether aron makahatag ug puti nga solid (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (kahayag 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (lapad kaayo nga s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z kalkulado nga bili.Alang sa C9H8F3N4S (M + H)+: 261.04. : 261.0419.
Ang Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), gi-synthesize sama sa gihulagway kaniadto, gipainit sa 200 °C sa usa ka oil bath sa gamay nga test tube.300 mg (dako nga sobra) cyanamide ug 1.0 ml conc.Ngadto sa init nga compound gidugang hydrochloric acid paspas ug ang sagol nga gitipigan sa lana bath alang sa mga 2 minutos, sa panahon nga ang kadaghanan sa tubig evaporated.Ang reaksyon sagol nga unya cooled sa lawak temperatura ug ang resulta solidified materyal gibuak sa gagmay nga mga piraso ug gihugasan sa tubig aron makahatag usa ka luspad nga dalag nga amorphous solid.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150) MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI) , nakit-an: 243.0704.
Ang mga sulog sa proton gisukod sa internal ug eksternal nga mga patsa sa mga oocytes nga nagpahayag sa lainlaing mga konstruksyon gamit ang usa ka Axopatch 200B amplifier nga kontrolado sa usa ka Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) nga adunay pClamp10 software. Ang mga solusyon sa intracellular ug extracellular adunay parehas nga komposisyon: 100 mM 2-(N-morpholino) )ethanesulfonic acid (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM TEA chloride, 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), gipasibo sa pH 6.0 nga adunay TEA hydroxide.Ang tanan nga mga pagsukod gihimo sa 22 ± 2 °C.Ang pipette adunay access resistance nga 1.5-4 MΩ.Ang kasamtangan nga mga pagsubay gisala sa 1 kHz, na-sample sa 5 kHz ug gisusi sa Clampfit10.2 (Molecular Devices) ) ug Origin8.1 (OriginLab).
Ang mga solusyon nga adunay lainlaing mga konsentrasyon sa Hv1 inhibitor ug sa pipila ka mga kaso ang 10 mM βME gipaila sa kaligoanan pinaagi sa grabidad pinaagi sa usa ka manifold nga konektado sa usa ka VC-6 perfusion valve system (Warner Instr.), nga gipasa pinaagi sa pClamp software TTL (Transistor- Transistor Logic) nga mga signal.Ang paspas nga perfusion nga mga eksperimento gihimo gamit ang multi-tube perfusion pencil (AutoMate Sci.) nga adunay 360 μm diameter nga delivery tip nga gitaod atubangan sa usa ka patch pipette.Ang pagdili sa channel gitino pinaagi sa isochronal amperometric measurements sa katapusan sa +120 mV depolarizing pulse.GV measurements gihimo sama sa naunang gihulagway18,20. Tail currents natala sa -40 mV human sa depolarization nga mga lakang sa lain-laing mga boltahe gikan sa -20 mV ngadto sa +120 mV gawas kon ipahayag.Ang reference pulse nga nag-una sa test pulse mao ang gigamit sa pagtul-id sa kasamtangang pagkadunot 18 .Ang GV graph mohaum sa Boltzmann equation:
Ang dayag nga dissociation constants (Kd) alang sa lain-laing mga kombinasyon sa mga channels ug inhibitors (Supplementary Table 1) gitino pinaagi sa pagpahaum sa pagsalig sa konsentrasyon sa pagdili (mean% inhib values) uban sa Hill equation:
diin ang [I] mao ang konsentrasyon sa inhibitor I ug ang h mao ang Hill coefficient.
Oras sa pag-post: Hun-07-2022
