Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň. Ulanylýan brauzer wersiýaňyzda CSS-iň çäkli goldawy bar. Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de gabat geliş tertibini öçüriň). Şol aralykda, üpjün etmek üçin dowamly goldaw, sahypany stil we JavaScript bolmazdan görkezeris.
Hv1 naprýa .eniýeli proton kanaly, iki naprýa senseniýän duýgur domenden (VSD) ybarat ölçegli toplum bolup, olaryň hersinde proton geçiş ýoly bar. Ölçeg sitoplazmatik örtükli domen domeni tarapyndan dolandyrylýar. Closedapyk ýagdaýdan geçiş. iki VSD-de açyk ýagdaýyň bilelikde ýüze çykýandygy mälimdir; muňa garamazdan, esasy mehanizmler barada az zat bilinýär. Intersubunit interfeýsleri allosteriki proseslerde möhüm rol oýnaýar; Şeýle-de bolsa, açyk Hv1 kanallarynda beýle interfeýsler kesgitlenmedi. Bu ýerde 2-guanidinotiazol önümleriniň iki Hv1 VSD-ni hyzmatdaşlykda bloklaýandygyny we bu birleşmeleriň birini açyk subunitleriň arasynda allosteriki baglanyşyk üçin synag hökmünde ulanýandygyny görkezýäris. VSD-iň ilkinji transmembran bölekleriniň soňy, birleşýän ýerleriň arasyndaky baglanyşygy ara alyp maslahatlaşýan intersubunit interfeýsini emele getirýär, şol bir wagtyň özünde örtülen rulon domeni bu prosese gönüden-göni gatnaşmaýar. Şeýle hem kanalyň proton-saýlaýjy süzgüçiniň blokirleýji baglanyşyk kooperatiwine gözegçilik edýändigini görkezýän güýçli subutnamalary tapdyk. .
Wolt bilen örtülen proton kanallary fitoplanktondan başlap adamlara çenli dürli organizmlerde möhüm rol oýnaýar. Öýjükleriň köpüsinde proton membranasyndan proton akymyny ara alyp barýar we NADPH oksidazynyň işini kadalaşdyrýar. HVCN1 geniniň önümi bolan Hv1 bolup durýar. hereketlilik9 we howa ýolunyň suwuklygynyň pH kadalaşdyrylyşy10. Bu kanal, B öýjükli näsazlyklar4,11 we döş we kolorektal rak keselleri ýaly rak kesellerinde aşa aşa gysylanlara gatnaşýar12,13. 11, 12 düwnük öýjükleriniň metastatiki potensialyny ýokarlandyrmak üçin aşa köp Hv1 işjeňligi tapyldy. Beýnimizde Hv1 aňladylýar. mikrogliýa arkaly we onuň işjeňligi işemiki insult modellerinde beýniniň zeperlenmesini güýçlendirýändigi görkezildi.
Hv1 belogynda S1-den S414 diýlip atlandyrylýan dört transmembran segmentinden ybarat naprýa senseniýäni duýýan domen (VSD) bar. Ciona gutis15. Bu beýleki beloklarda S4-iň C terminaly effektor modulyna, gözenek domenine ýa-da fermentine birikdirilýär. Hv1-de S4 membrananyň sitoplazmatiki tarapynda ýerleşýän örtükli rulon domeni (CCD) bilen baglanyşdyrylýar. .Kanaly iki sany VSD-den ybarat ölçegli toplum bolup, hersinde derwezeli proton geçiş ýoluny öz içine alýan16,17,18. Bu iki Hv1 subunitiniň bilelikde açyljakdygy anyklandy19,20,21,22, bu allosteriki birleşmäniň we subunitara täsirleriň oýnaýandygyny görkezýär. girelge prosesinde möhüm rol oýnaýar. Coapylan rulon domenindäki subunitleriň arasyndaky interfeýs gowy kesgitlenendir, sebäbi iki izolirlenen domeniň kristal gurluşlary bar 22,23. Beýleki tarapdan, membrananyň içindäki VSD-leriň interfeýsi ýok gowy düşünilýär. Hv1-CiVSP himiki belogyň kristal gurluşy bu interfeýs barada maglumat bermeýär, sebäbi kristallaşdyrylan kanal toplumynyň trimeriki guramasy, ýerli Hv1 CCD-iň hamyrmaýa leýus fermuar GCN424 bilen çalşylmagy netijesinde bolup biler.
Hv1 kanalynyň subunit guramasynyň ýakynda geçirilen gözleginde, iki sany S4 kysymly ikinji derejeli gurluşyň düýpli bozulmazdan KCD-e geçýändigi, membranadan we sitoplazma geçýän uzyn helelleriň döremegine sebäp boldy. bu gözleg, Hv1 VSD-leriň S4 segmenti boýunça biri-biri bilen habarlaşmagyny teklip edýär. Şeýle-de bolsa, beýleki gözlegler VSD-leriň arasynda alternatiw interfeýsleri teklip etdi. Bu interfeýslere S1 segmentleri 17, 21, 26 we S2 segmentiniň daşarky uçlary girýär. Bu gapma-garşylygyň sebäbi bolup biler. Bu gözlegleriň netijesi, VSD-leriň arasyndaky allosteriki baglanyşyk, ýapyk we açyk ýagdaýlara bagly bolan girelge prosesi bilen baglanyşykly gözden geçirildi we VSD-leriň interfeýsi dürli döwlet üýtgemelerinde üýtgäp biler.
Bu ýerde, 2-guanidinotiýazolyň iki açyk VSD-ni sinergistik taýdan baglanyşdyrmak arkaly Hv1 kanallaryny saklaýandygyny we açyk ýagdaýda subunitleriň özara täsirini barlamak üçin birleşmeleriň birini, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA) ulanandygyny gördük. interfeýs. GBTA baglaýjy egriniň mukdar modeli bilen gowy suratlandyrylyp bilinjekdigine göz ýetirdik, onda bir inhibitory bir subunit bilen baglanyşdyrmak, goňşy subunitiň baglanyşyk ýakynlygynyň ýokarlanmagyna sebäp bolýar. Şeýle hem, D112 galyndylarynyň, saýlama süzgüçleriniň bardygyny gördük. 27-nji kanal, 28-nji kanal we guanidini emele getirýän birleşýän ýeriň bir bölegi 29 GBTA baglanyşyk kooperatiwine gözegçilik edýär. Kärdeşler arkalaşygynyň H41 ölçeginde saklanýandygyny görkezýäris, bu ýerde KCD S4 segmentinden bölünip, KCD-de kesişýän interfeýsiň gönüden-göni ýokdugyny görkezýäris. GBTA baglanyşdyrýan saýtlaryň arasynda allosteriki birikdirmäni ara alyp maslahatlaşyň. Munuň tersine, S1 bölekleriniň subunitleriň arasyndaky interfeýsiň bir bölegidigine göz ýetirýäris we S4 gelixiniň öýjükden daşary ujy bilen ýanaşyk VSD-leriň ölçeg merkezinden uzakda ýerleşmegini teklip edýäris. S1 bölegi açyk ýagdaýda bolmaly.
Hv1-iň kiçi molekula inhibitorlary antikanserlendiriji dermanlar we newroprotektiki serişdeler hökmünde peýdalydyr. Şeýle-de bolsa, şu güne çenli az sanly birleşme kanaly saklap bildi30,31,32,33.Olaryň arasynda 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, birleşme [1]) . 1a) we emele gelenler protonlaryň kanal arkaly VSD29,32 geçmegini bökdeýär. Şeýle birleşmeleriň daşy iki açyk subunitde özbaşdak ýüze çykýar öýdülýär.2-guanidinobenzotiazol (GBTA, birleşme [2]) ozal 200 μM konsentrasiýasynda synag edilende Hv1-ni 2GBI ýaly täsirli diýen ýaly görkezýärdi (1b surat) .Biz beýleki tiazol önümlerini gözden geçirdik we käbirleriniň GBTA-dan has meňzeş ýa-da has güýçli kanaly saklaýandyklaryny gördük (1-nji surat we Goşmaça) tekst) .Bört sany tiazol emele gelenleriň konsentrasiýa jogap egrilerini kesgitledik (GBTA we birleşmeler [3], [6] we [11], 1c surat) we olaryň 2GBI-den has dikdigini anykladyk. Depe koeffisientleri (h) tiazol emele gelenleriň 1,109 ± 0.040 bilen 1,306 ± 0.033 aralygyndady (Surat. 1c we goşmaça 1-nji surat). Munuň tersine, 2GBI üçin depe koeffisiýenti 0.975 ± 0.024 29, 2a surat we goşmaça 1-nji surat). 1-den ýokardaky depe koeffisiýenti hökmany hyzmatdaşlygy görkezýär. Sebäbi her Hv1 subunitiniň öz inhibitory bar- baglaýjy sahypa, 29,32, bir tiazol önüminiň bir subunit bilen baglanyşdyrylmagy, ikinji inhibitor molekulasynyň goňşy subunit bilen baglanyşygyny güýçlendirip biler diýip pikir etdik. GBTA iň ýokary Hill koeffisiýenti bilen synag birleşmesi boldy. Şonuň üçin bu birleşmäni saýladyk sinergiýany baglamagyň mehanizmini mundan beýläk öwreniň we 2GBI-ni negatiw gözegçilik hökmünde ulandy.
(a) Synag birleşmeleri: [1] Hv1 inhibitory 2-guanidino-benzimidazol (2GBI). [2] 2-guanidino-benzotiýazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2 ýyl) guanidin, [4] nafto [1,2-d] -guanidin, [5] (4-metil-1,3-tiazol-2 ýyl) guanidin, [6] (5-bromo-4-metil-1,3-tiazol- 2 ýyl) guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksil turşusy etil ester, [9] 2-guanidino-4-metil Etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10] ] (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5 ýyl) etil asetat, [11] 1- [4- 12] 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3-tiazol-2 ýyl] guanidin. .Hv1 proton toklary -80 mV-den +120 mV çenli bolan depolýarlaşma jogap hökmünde Ksenopus oositleriniň içki plitalarynda ölçenildi. Her bir inhibitor 200 μM.pHi = pHo = 6.0 konsentrasiýasynda hammama goşuldy. Maglumatlar ortaça EM SEM (n≥4). 15 ölçege çenli. Çyzyk, 1-nji tablisada görkezilen görünýän Kd bahalaryny almak üçin ulanylýan depe laýyklygydyr .Hill koeffisiýentleri 1-nji suratda görkezilen gabat gelýänlerden kesgitlenildi: h (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033, h (3) = 1,25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (Usullara serediň).
(a) girizilen gistogrammalar 3-nji we 4-nji goşmaça suratlarda görkezilen gabat gelýänlerden kesgitlenildi. (A) -da görkezilen GBTA-nyň konsentrasiýa jogaby 1-nji suratdaky ýalydyr. Görkezilen Kd bahalary üçin goşmaça tablisa serediň. (c) Modellemek GBTA-nyň dimeriki Hv1 bilen bilelikde baglanyşygy - degişlilikde birinji we ikinji baglanyşyk hadysalarynyň bölüniş deňagramlylyk egrileri (Sub 1: OO + B ⇄ BO *, Kd1 = 290 ± 70 μM; 2-nji bölüm: BO * + B ⇄ B * O *, Kd2 = 29.3 ± 2,5 μM ) (d) Hv1 blokynyň teklip edilýän mehanizminiň shemasy ýokary ýakynlykdaky gök. Monomer Hv1 bilen baglanyşdyrmak üçin GBTA üçin reaksiýa üçin bölünme hemişelik: O ° + B ⇄ B ° Kd1 bilen Kd2 arasynda, ýöne ikinjisine has ýakyn (çal-gök zolaklar orta ýakynlygy görkezýär).
Hv1 kanallary, N- we C terminaly sitoplazmatiki domenlerini Ciona Içegäniň naprýatageeniýesine duýgur fosfataz CiVSP (Hv1NCCiVSP) degişli bölekleri bilen çalyşmak arkaly monomerizasiýa edilip bilner. olary dimeriki kanal (ýabany görnüşli) inhibisiýa bilen deňeşdirdi (2a surat, b) .Bu birleşmäniň arasyndaky baglanyşyk kooperatiwliginiň tapawudynyň monomer Hv1-de ýok edilendigini gördük, GBTA-nyň bir subunit bilen baglanyşygynyň artýandygyny düşündirýär. inhibitor üçin beýleki subunitiň ýakynlygy. Bir Hv1 subunit bilen baglanyşdyrylan GBTA, goňşy subunitiň boş baglanýan ýeriniň täzeden tertipleşdirilmegine sebäp boljak baglanyşyk ýeriniň täzeden tertipleşdirilmegine sebäp bolup biljekdigini pikir etdik. ýakynlyk.
GBTA-nyň bilelikdäki baglanyşygyny mukdar taýdan suratlandyrmak üçin, iki subunit bölünip çykýan hemişelik Kd1 bilen bimolekulýar reaksiýadan soň ilkinji inhibitor molekulasyny baglap bilýän modelini ulandyk (2-nji surat, Sub 1, OO + B ⇆ BO *). Baglamak, kanalyň galan boş subunitleriň, hemişelik Kd2 bilen üýtgeşik bimolekulýar reaksiýadan soň inhibitory baglanyşdyrýan ýagdaýyny kabul etmegine sebäp bolýar, bu ýerde Kd2
2c-nji suratda görkezilen gaty gara çyzyk, model deňlemesiniň eksperimental konsentrasiýa jogap egrisine laýyklygy bolup, Kd1 ~ 290 μM we Kd2 ~ 29 μM (Usullar bölümi, deňleme (6)) berýär. 2GBI baglanyşygy, bu ýerde Kd2 ≈ Kd1 = Kd (2d surat) .Hom1 monomerinde diňe bir baglanyşyk meýdançasy we bir Kdm (O ° + B ⇆ B °) bar. GBTA ýagdaýynda Kdm 54 töweregi μM, Kd2-den Kd1-e has meňzeş (2-nji surat). Başgaça aýdylanda, monomeriň baglaýjy ýeri pes derejä garanyňda ýokary ýakynlyk ýagdaýyna (BO *) has meňzeş konfigurasiýada (O °). ölçegdäki ýakynlyk ýagdaýy (OO), ähtimal subunitleriň arasyndaky interfeýsiň ýok edilmegi bilen baglanyşyklydyr.
Öň 2GBI32 üçin görkezilişi ýaly, GBTA Hv1 toklaryny açmagy kynlaşdyrmak däl-de, kanal açylanda blokirlemek arkaly basyp ýatyrdyk (2-nji surat, b, d) .2GBI-de guýruk akymlarynyň ýuwaş-ýuwaşdan çüýremegine sebäp bolýandygy mälimdir. membrananyň repolýarlaşmagyna jogap hökmünde, ýöne bu hadysa GBTA-da görülmedi (Goşmaça 2-nji surat). 2GBI bar bolan Hv1 hereketsizliginde, blokirleýji hökmany ýerden çykýança her subunitdäki derwezeler ýapylyp bilinmez (" aýak derwezesi ”mehanizmi) we 2GBI derwezelerden has haýal açylýar. Eger bir Hv1 subunit açylmasa we ýapyk bolsa, goňşy subunit petiklense, galan 2GBI molekulalarynyň birikdirilmegi haýallaşýar (blokirleýji ele almak). Uzak ýaşan kanal görnüşleri bilen. Diňe bir petiklenen subunit protonlary ýapmazdan ozal wagtlaýyn geçirýär we ýuwaş-ýuwaşdan çüýrän guýruk akymyna möhüm goşant goşýar.
GBTA (Goşmaça 2-nji surat) bar bolan ýagdaýynda Hv1 guýruk akymlarynyň çüýremeginiň ep-esli peselmändigi, bu bloklaýjy üçin sinergistik baglanyşyk mehanizmine laýyk gelýär (2-nji surat) .Bir gezek GBTA molekulasy Hv1 subunitinden çykmaýar. , bloklaýjynyň ýanaşyk subunit bilen ýakynlygy takmynan 10 esse azalýar we baglanyşyk prosesine goldaw berýär. Bu, GBTA-nyň ikinji molekulasynyň kanalda duzaga düşmezden ozal açylmak mümkinçiliginiň has ýokarydygyny aňladýar. Uzak ýaşan kanal görnüşleri Diňe bir bloklaýjy subunit öndüriň, GBTA-nyň barlygynda 2GBI-den has köp bolmagyna garaşylýar we netijede guýrugyň häzirki çüýremegine sebäp bolýar.
GBTA-nyň iki Hv1 kiçi bölümi bilen bilelikde baglanyşmagy üçin, hökmany saýtlar birmeňzeş birleşdirilmelidir. Her bir baglanyşyk sahypasy başarnykly bolmaly: 1) inhibitor bilen baglanyşykly goňşy subunitler bilen aragatnaşyk saklaýan wakalar zynjyryny döretmek we 2) araçylyk etmek pes baglanyşykdan ýokary baglanyşyk baglanyşygyna geçmek. Baglanyş meýdançasyndaky aýratyn galyndylar hyzmatdaşlyga goşant goşan bolsa, olaryň mutasiýasy Hv1-iň GBTA inhibisiýasynyň konsentrasiýa-jogap egrisiniň Hill koeffisiýentini üýtgetmelidir diýip pikir etdik. D112, F150 , S181 we R211 ozal 2GBI29 baglanyşyk gurşawynyň bir bölegi hökmünde görkezilipdi we olaryň hem GBTA baglanyşygyna gatnaşjakdygyny çakladyk (3A surat) .D112E, F150A, S181A mutant kanallary üçin GBTA-nyň inhibitor konsentrasiýa jogap egrilerini ölçedik. , we R211S (3-nji surat) we 2GBI-ni salgylanma hökmünde ulanyp, Hill koeffisiýentlerini Hv1 ýabany görnüşi bilen deňeşdirdi. Galyndy V109 S1 segmentiniň D112 bilen bir ýüzünde we öýjügiň içinde bir goşmaça öwrülişik bar. V109 2GBI29 baglanyşygyna gatnaşmady, gözegçilik hökmünde V109A mutantyny ulandyk (Surat. 3b).
(a) Guanidiniň emele gelmegine gatnaşýan Hv1 galyndylary. 2GBI29 birleşmesiniň dürli bölekleri bilen täsirleşýän öň teklip edilen gapdal zynjyrlary gurşap alýar. goýy gyzyl) .Her nokat 3-12 ölçegleriň ortaça päsgelçiligini aňladýar ± SD V109 otrisatel gözegçilik hökmünde. Egriler, görünýän Kd bahalaryny almak üçin ulanylýan depelerdir (Goşmaça tablisa 1 serediň) .Dag koeffisientleri (h) görkezilýär goşulan gistogrammalar 3-nji we 4-nji goşmaça suratlarda görkezilen gabat gelişlerden kesgitlenildi. Hv1 WT üçin salgylanma bahalary çyzyklar görnüşinde görkezilýär. Tebigatlar mutant we WT geçelgeleriniň arasynda statistik taýdan möhüm tapawudy görkezýär (sah. 0.05 / 14, Usullara serediň) .
D112E mutasiýa, Hill koeffisiýentini ep-esli peseldendigini gördük (p GBTA baglanyşygy üçin Hill koeffisiýentiniň Hv1 ölçeginde 1-den ýokarydygyny we monomer kanalynda ~ 1 bolmagyna (2-nji surat) iki bölümdäki baglanyşyk ýerleriniň arasynda allosteriki täsirleriň bardygyna laýyk gelýär. Eger şeýle bolsa ýagdaýynda, bloklaýjynyň bir subunit bilen baglanyşdyrýan ölçegi bilen baglanyşdyrýan GBTA Hill koeffisiýenti ~ 1.Bu çaklamany F150A ýakynlygy bolan Hv1 F150A-WT baglanyşdyrylan ölçegde (4a surat) synagdan geçirdik. GBTA üçin subunit, WT subunitinden has ýokary ululykdaky 2 sargytdan ýokarydy (1c we 3d suratlar). Soňra WT subunitiniň bazal konsentrasiýasynda 2 μM GBTA konsentrasiýa üçin konsentrasiýa jogap egrilerini ölçedik. , blokirleýjiniň F150A subunitiniň takmynan 99% -ini we WT subunitiniň (a) Bloklaýjy gemikaneli ({F150A} b-WT / BAO *) döretmek üçin ulanylýan F150A-WT birleşdiriji dimeriniň shemasy F150A subunitiniň ýakynlygy WT subunitinden has ýokary bolmagyna garaşylýar. (b) Membrananyň potensialynyň üýtgemegine jogap hökmünde ölçenen F150A-WT kanallaryndan proton toklary +120 mV.pHi = pHo = 6.0 .Greý yzlary inhibitoryň ýoklugynda ölçenýän toklary aňladýar. Gara yz (gözegçilik) 2 μM GBTA goşulandan soň ölçenen toky aňladýar. Bu konsentrasiýada WT subunit ep-esli päsgel bermedi, F150A subunit bolsa bolsa GBTA bilen diýen ýaly baglanyşdy. ({F150A} b-WT). GBTA konsentrasiýasynyň hasam ýokarlanmagy, WT subunitiniň (mämişi we gyzyl yzlar) petiklenmegine sebäp boldy. F150A subunit) .Her nokat 3-7 ölçegdäki ortaça inhibisiýany aňladýar. Egriler 1-nji tablisada görkezilen görünýän Kd bahalaryny almak üçin ulanylýan depelerdi. Giriş gistogrammalarynda görkezilen depe koeffisiýentleri 3-nji we 4-nji goşmaça suratlarda görkezilen ýerlerden kesgitlenildi. Hv1 WT-iň h bahalary çyzylan çyzyklar hökmünde görkezilýär.Asteriskler WT dimer Hv1 bilen deňeşdirilende statistik taýdan möhüm tapawutlary görkezýär (p Hv1-iň GBTA inhibisiýasy açyk kanalda ölçenilendigi sebäpli, GBTA baglanyşdyryjy kooperatiwiň açyk ýagdaýda intersubunit birikdirme mehanizmini öwrenmek üçin ulanylyp bilinjekdigini pikir etdik. Bu iki Hv1 subunitiniň öň 19,20,21, bilelikde açylandygy anyklandy. 22 we derwezä gatnaşýan intersubunit birikdirmesi sitoplazmatik örtükli rulon domeni (CCD) bilen araçylyk edilmegi teklip edildi 22,25. Şol sebäpden, açyk ýagdaýda GBTA baglanyşdyrýan ýerleriň arasyndaky baglanyşykda KCD-iň hem bardygyny ýa-da ýokdugyny soradyk. Triglisin S4 transmembran bölegi bilen örtülen rulon domeniniň arasyndaky interfeýsdäki mutasiýa, dimerizasiýa bitewiligini saklamak bilen bu domeni kanalyň galan böleginden bölmek üçin öňki barlaglarda görkezilipdi. Şonuň üçin V220G, K221G we T222G mutasiýa täsirini barladyk (Surat GBTA baglanyşdyryjy kooperatiwligi boýunça 5a, GGG mutant. Biz ýabany görnüş bilen deňeşdirilende GBTA kanallary bilen baglanyşdyrylýan Hill koeffisiýentiniň statistik taýdan ujypsyzdygyny (5-nji surat) gördük. iki sany subunit möhüm, ýöne KCD GBTA baglaýjy saýtlaryň arasynda kesişýän allosteriki birikmäni gönüden-göni ara alyp maslahatlaşmaýar.
(a) Sitoplazmatik örtükli rulon domeni (gök oklar) bilen araçylyk edilýän kesişýän birleşmäni bozmak üçin döredilen S4-iň içki ujundaky triglisin mutasiýa bilen Hv1 dimeriniň shemasy. (b) Hv1 ölçegleriniň shemalaýyn şekillendirilmegi subunitleriň (gök oklar) birleşmegine gatnaşýan S1 böleklerini barlamak üçin niýetlenen görkezilen mutasiýa. (c - h) 2GBI (sian) we GBTA (goýy gyzyl) görkezilen gurluşlary konsentrasiýa bagly görnüşde saklaýar. 3 3-10 ölçegli SD. Egrilik görnüp duran Kd bahalaryny almak üçin ulanylýan depe laýykdy (Goşmaça 1-nji tablisa serediň). Interpolirlenen gistogrammalardaky koeffisiýentler Usullar bölüminde görkezilişi ýaly kesgitlenildi (Goşmaça 3-nji we 4-nji suratlara serediň). Hv1 WT çyzykly çyzyklar hökmünde görkezilýär. Asterisks mutant we WT geçelgeleriniň arasynda statistik taýdan möhüm tapawutlary görkezýär (p GBD kooperatiwiniň gönüden-göni araçysy hökmünde KCD-den ýüz öwürendigimiz sebäpli, VSD-leriň arasyndaky baglanyşyklaryň hökmany saýtlaryň arasyndaky allosteriki birleşmä degişlidigini ýa-da ýokdugyny soradyk. GBTA bilen baglanyşykly hyzmatdaşlygyň ýerleşýän D112 galyndysynyň konserwatiw mutasiýasy bilen ýatyrylandygyny gördük (3-nji surat). S1 transmembran segmentinde. suw liniýalary arkaly D112-e çenli 36,37.Şonuň üçin, E119 we D123-iň GBTA baglanyşdyrýan ýerleriniň arasyndaky allosteriki birikdirmä degişlidigini ýa-da ýokdugyny barladyk (5-nji surat) .Taramaz gözegçilik hökmünde, D123-iň golaýynda ýerleşýän K125-de pozitiw zarýadly pozisiýany synagdan geçirdik. emma S1 gelixiniň beýleki tarapynda (5b surat).
E119A, D123A we K125A kanallarynyň konsentrasiýa bagly inhibisiýasyny 2GBI we GBTA bilen ölçedik we E119A we K125A mutasiýalarynyň ýabany görnüş bilen deňeşdirilende iki inhibitoryň Hill koeffisiýentini düýpgöter üýtgetmändigini anykladyk (sah. 0.05, 5d surat, i) ). Beýleki tarapdan, D123A mutasiýa, GBTA-nyň Hill koeffisiýentini ep-esli derejede peseltdi (p Iki kiçi bölümdäki 123-nji pozisiýadaky zarýady zyýansyzlandyrmak GBTA hökmany kooperatiwiniň güýçli üýtgemegine sebäp boldy, şol bir wagtyň özünde-de zarýadyň tersine öwrülmegi az täsir etdi, biz derňewiň kanaly bilen diňe bir subunit goşmak üçin derňewi uzaltdyk. C terminaly subunitinde D123R çalyşmagy bilen Hv1 baglanyşdyrylan ölçegleri döretdi (5b surat) we GBTA we 2GBI tarapyndan konsentrasiýa jogap inhibisiýasyny ölçedik. WT-D123R kanallary bilen baglanyşdyrýan GBTA Hill koeffisiýentiniň ep-esli ýokarydygyny gördük. ýabany görnüşli Hv1 (p Şeýle hem, D112E mutasiýa, WT-D123R fonda öndürilen GBTA baglaýjy depe koeffisiýentiniň ýokarlanmagyny ýatyrandygyny gördük (5b surat, h we goşmaça 4-nji surat). 2GBI baglanyşygynyň Hill koeffisiýentine täsiri hem ýok edildi ( 5h surat we goşmaça 3-nji surat) .Bu netijeler, 123-nji pozisiýadaky garşy zarýadlar sebäpli dörän subunitleriň arasyndaky güýçlendirilen allosteriki baglanyşygyň, D112 pozisiýasyndaky baglanyşyk meýdançasy bozulanda has berk baglanyşyk kooperatiwine öwrülmejekdigini görkezýär.
Goňşy açyk subunitlerdäki D123 galyndylary biri-biri bilen elektrostatiki täsirleşip bilýän bolsa, otrisatel zarýadlaryň arasyndaky ýigrenji täsir, aspartik kislotany arginine çalşyp, otrisatel we polo positiveitel zarýadlaryň birleşmesine öwrüler diýip pikir etdik. Olaryň arasynda özüne çekiji täsir. Bir subunit (WT-D123R dimer) .Aktratiw täsirleşmeler, S1 bölekleriniň daşky uçlarynyň arasyndaky interfeýsi güýçlendirip, subunitleriň arasynda has güýçli allosteriki birleşmä we GBTA baglanyşdyryjy hyzmatdaşlygyň ýokarlanmagyna sebäp bolup biler.
Bu çaklamany goldamak üçin, S3 segmentiniň daşky uçlarynyň arasyndaky interfeýsi berkitmegiň ýoluny gözledik, bu 123-nji pozisiýadaky zarýad kommutasiýasyndan tapawutlanýar. Görüň we ş.m. Hv1 galyndysynyň I127 sistine üýtgedilmegi öň tapyldy öz-özünden kesişýän birleşmä sebäp bolmak üçin 17. Mundan başga-da, Hv1-CiVSP himiki VSD-iň kristal gurluşy I127-iň S1 gelixiniň daşky ujundan diňe bir galyndy bilen bölünýändigini görkezýär24. Şonuň üçin kowalent baglanyşygyň emele gelýändigini soradyk. 121-nji pozisiýadaky sisteinler, has güýçli S1-S1 täsirleşmegine sebäp bolar diýlip garaşylýar, 123-nji pozisiýadaky zarýady üýtgetmek bilen deňeşdirilende GBTA baglanyşyk kooperatiwine täsir edýär.
10 mM merc-merkaptoanol (βME) (6a surat) barlygynda we ýoklugynda Hv1 I127C-iň konsentrasiýa bagly inhibisiýasyny GBTA we 2GBI bilen ölçedik. 6-njy surat). öýjükli öýjükli çözgüde agent goşulýar. Negativearamaz gözegçilik hökmünde diňe bir subunitde (WT-I127C) sistiniň çalyşmagy bilen baglanyşdyrylan dimer ulanyldy (6a surat) .Biz öz-özünden kesişýän birleşmäniň täsirini ölçäp bilmedik. 2GBI inhibisiýasyndaky I127C kiçi bölümleriniň arasynda, sebäbi H12 bilen baglanyşdyrylan I127C üçin Hill koeffisiýenti, βME bilen ýa-da bolmazdan, monosisteiniň ornuny tutýan ölçegleri bilen baglanyşykdan düýpgöter tapawutlanýar. Depe koeffisiýenti WT-I127C (6-njy surat we goşmaça 3-nji surat) tapawutlandyryp bilmedi. Munuň düýpgöter tersine, öz-özünden kesişýän arabaglanyşygyň GBTA inhibisiýasyna täsirini ölçedik. (özara baglanyşyk) βME (kesişme) barlygynda ýa-da ölçeýjini baglanyşdyrmak üçin WT-127C ulanylanda ep-esli ýokarydy (6-njy surat we goşmaça 4-nji surat), bu allosteriki birleşmäni görkezýär. baglaýjy ýerleriň arasynda S1 bölekleriniň daşky uçlarynyň arasynda disulfid baglanyşyklarynyň emele gelmegi bilen ep-esli güýçlenýär. Bu netijeler, WT-D123R ölçegindäki 123-nji pozisiýada aspartat bilen argininiň özüne çekiji elektrostatik täsiriniň arasynda allosteriki birleşmäniň ýokarlanýandygyna düşünmegimizi goldaýar. kiçi bölümler.
Açyk döwlet birikdirmesi, iki kiçi bölümdäki S1 segmentiniň daşky uçlarynyň arasynda göni fiziki täsirleşmeler arkaly töwella edilýär.
(a) Kesgitli sistein baglanyşyklarynyň GBTA baglanyşyk kooperatiwine nähili täsir edýändigini öwrenmek üçin döredilen mutant Hv1 ölçegleriniň we baglanyşdyryjy ölçegleriniň shematiki şekillendirilmegi. (bd) 2GBI (b, d) we GBTA (c, görkezilen gurluşlaryň konsentrasiýa bagly gadaganlygy e) öýjükden daşary erginde 10 mM βME barlygy ýa-da ýoklugy. Her nokat 3-10 ölçegdäki ortaça inhibisiýany aňladýar. Egrilik Kd bahalaryny almak üçin ulanylýan Depe laýykdy (Goşmaça 1-nji tablisa serediň) .Göçürilen gistogrammalardaky koeffisiýentler Goşmaça 3-nji we 4-nji suratlarda görkezilen ýerlerden kesgitlenildi, (c, e) ýyldyzlar statistik taýdan möhüm tapawutlary görkezýär dürli GBTA inhibisiýa şertleriniň arasynda (p 0.05).
Şeýle hem, βME ýok bolsa, D112E I127C Hv1 dimerine baglaýan GBTA-nyň Hill koeffisiýentiniň, azaldýan serişdeleriň barlygynda ölçeneninden ep-esli ýokarydygyny (6-njy surat we goşmaça 4-nji surat) D112E mutasiýasyny aňladýandygyny gördük. Sistin 127-iň biri-biri bilen baglanyşygy netijesinde GBTA baglanyşdyryjy hyzmatdaşlygyň ýokarlanmagyny ýatyrmady. D112E, I127C Hv1 ölçegleri bilen baglanyşdyrýan 2GBI depe koeffisiýenti, D112E mutasiýa (1-nji surat) .6d we Goşmaça goşmaça täsir etmedi. 3-nji surat).
Bu netijeler, GBTA baglanyşygynyň, özüne çekiji elektrostatik täsirleşmeler arkaly ýa-da çalşylan sistinleriň arasynda kowalent baglanyşyklaryň emele gelmegi bilen, S1 bölekleriniň daşarky uçlarynyň arasyndaky täsir arkaly güýçlenýändigini görkezýär. D112E mutasiýa arkaly özüne çekiji elektrostatiki täsirleriň kooperatiwlige edýän täsiri ýatyrylyp bilinýän bolsa, kowalent baglanyşyklaryň täsiri bolup bilmez.
Guanidin önümlerini Hv1 kanallary bilen baglanyşdyrmak üçin bar bolan himiki giňişligi öwrenenimizde, GBTA ýaly 2-guanidinotiazollaryň 2-guanidinobenzimidazollardan has berk konsentrasiýa baglydygyny gördük. we monomer kanallary (2a surat, b) we bir subunitiň ingibitor bilen öňünden baglanyşdyrylan dimerik kanalyna (4-nji surat) Hv1-iň GBTA tarapyndan gadagan edilmegi Hereket sinergistik prosesdir we Iki bölümdäki birleşmeleriň birleşdiriji ýerleri birmeňzeş birleşdirilýär. GBTA-nyň açyk kanal bilen baglanyşdyrýandygy, 2GBI32 bilen baglanyşykly birleşme üçin ozal görkezilişi ýaly, allosteriki birikmäniň açyk ýagdaýda aýratyn bahalandyrylyp bilinjekdigini görkezýär. Hv1-iň GBTA-nyň gadaganlygyny mukdar taýdan suratlandyryp bildi we 2GBI we GBTA-nyň membrananyň repolýarlaşmagyndan soň kanal guýruk akymlarynyň çüýremegine edýän dürli täsirlerini düşündirip bildi, bu bolsa baglaýjy prosesi düşündirmegimizi goldaýar.
Iki baglanyşyk meýdançasy bolan (Hv1 ýaly) allosteriki belokda gazanyp boljak iň ýokary depe koeffisiýenti 2. Hv1 I127C-de 1,88-e çenli ýokarlanan Hv1 ýabany görnüşini 1.31 koeffisiýenti bilen baglanyşdyrmak üçin GBTA ölçedik. sinergistik erkin energiýa, iň pes we iň ýakyn ýerlerdäki baglanyşdyryjy erkin energiýalaryň arasyndaky tapawut (Usullara serediň), Hv1 ýabany görnüşli ýagdaýynda 1,3 kkal / mole, Hv1 I127C ýagdaýynda 2,7 kkal / mole boldy. kislorod gemoglobine bilelikde işlemek prosesiniň iň meşhur we gowy öwrenilen mysalydyr. Adam gemoglobini (dört sany birleşdiriji baglanyşyk meýdançasy bolan tetramer) üçin Hill koeffisiýenti 2,5-3.0 aralygynda, bahalary 1,26 bilen 3.64 aralygyndadyr. kkal / mol, synag şertlerine baglylykda38.Şonuň üçin, global energiýa nukdaýnazaryndan, iki ulgamdaky dürli mukdarda belok subunitleri göz öňünde tutulanda, Hv1 bilen baglanyşdyrýan GBTA-nyň kooperatiwligi gemoglobine bagly O2 bilen düýpgöter tapawutlanmaýar.
Synergiýa modelimizde, GBTA molekulalarynyň bir subunit bilen baglanyşygy, goňşy subunitiň baglanyşyk ýakynlygynyň ýokarlanmagyna getirýär. Ilkinji baglanyşyk hadysasy (induksiýa laýyk) netijesinde baglaýjy gurşawyň täzeden tertipleşdirilmegine sebäp boljak bir prosesi göz öňüne getirýäris. subunitleriň arasyndaky täsirleriň üýtgemegi. Bu üýtgeşmelere jogap edip, ýanaşyk subunitler hökmany saýtlaryny üýtgedýärler, netijede GBTA has berkleşmegine sebäp bolýar. Bu prosesiň dowamynda S1 aspartat D112, baglanyşyk ýakynlygynyň ýokarlanmagy bilen baglanyşykly baglanyşyk sahypasynyň tertipleşdirilmegine jogapkärdir. D112 öň Hv1 protonyň geçiş ýolunyň bir bölegi we saýlama süzgüji27,28 hökmünde görkezilipdi. Netijelerimiz, iki Hv1 kiçi bölümdäki saýlama süzgüçleriň açyk ýagdaýda birleşdirilendigini görkezýär. 7a surat, GBTA baglaýjy ýeriniň takmynan ýerleşişini we Hv1 VSD esasly shema boýunça D112, D123, K125 we I127 galyndylarynyň ýerleşişini görkezýär. Hv1-CiVSP kimerasynyň kristal gurluşynda. S1-iň öýjügiň ujuna degişli allosteriki birikdirme üçin teklipler gara oklar bilen görkezilýär.
(a) Hv1 VSD-iň shemasy. Hv1-CiVSP kimerasynyň kristal gurluşyna esaslanyp, dik segmentler silindr görnüşinde görkezilýär. Bu konfigurasiýada S4 segmentiniň içki ujy KCD bilen birleşýär (görkezilmeýär). Baglanan GBTA-nyň çak edilýän ýerleri çal ýumurtga görnüşinde görkezilýär. Gara oklar iki ýanaşyk subunitdäki baglanyşyk ýerleriniň arasynda allosteriki birleşmä gatnaşýan ýollary görkezýär. Barlanylan S1 galyndylarynyň ýerleri reňkli sferalar bilen bellik edilýär. (B) Hv1 kiçi bölümleriniň shematiki şekili Membrananyň tekizliginden daşary tarapdan görlüşi ýaly iki dürli ölçegli konfigurasiýada. Çep panelde, dimer interfeýsi S4 gelix tarapyndan emele gelýär. Iki VSD-leriň membrananyň tekizligine perpendikulýar okuň töwereginde 20 gradus aýlanmagy. iki S4 dwigateliniň daşky uçlaryny bölmek (sag oklar), sag tarapda görkezilen tertibi döredýär. Bu konfigurasiýada goňşy bölümlerden D123 we I127 galyndylary ýakynlaşmaga rugsat berilýär. (c) CiVSP VSD-iň shematiki görnüşi 4G80 kristal gurluşynda tapylan ölçegli konfigurasiýada. CiVSP-de P140 pozisiýasy Hv1-de D123 pozisiýasyna gabat gelýär.
Netijelerimiz, 123 (123D / 123D ýa-da 123R / 123R) galyndylaryň arasyndaky ýigrenji elektrostatik täsiriň açyk ýagdaýda GBTA baglanyşdyryjy hyzmatdaşlygyň “adaty” derejesi bilen baglanyşyklydygyny we özara täsirini repulsiýadan Attract (123D / 123R) -e geçirýändigini görkezýär. , hyzmatdaşlygyň artmagy (5g surat) .Aliniň çalyşmagy bilen ýigrenji täsiriň aýrylmagy hem hyzmatdaşlygyň ýokarlanmagyna getirer diýlip garaşylýar. Şeýle-de bolsa, 123A / 123A ölçeginiň hyzmatdaşlygynyň peselmegi hasaba alyndy (5e surat) .Bu mümkin Düşündiriş, gidrofob galyndylaryny gidrofil gurşawyna ýerleşdirmegiň durnuksyzlaşdyryjy täsiri, D123 galyndylarynyň arasyndaky ýigrenji täsirleriň ýok edilmegi sebäpli durnuklaşdyryjy täsirden has ýokary bolup biler, netijede hökmany hyzmatdaşlygyň umumy azalmagyna sebäp bolýar. Mony et al.39 ýakynda habar berip biler Ciona gutis Ci-Hv1-iň D171 ýagdaýy (adam Hv1-de D123 gabat gelýär) işjeňleşdirilenden soň D123 açyk ýagdaýda gidrofil gurşawda ýerleşýär diýen düşünjäni goldaýar.
Hv1 kanallarynyň girelgesiniň birnäçe geçiş arkaly ýüze çykýandygy mälimdir19,20,26,39,40,41.Qiu we al26 membrananyň depolýarlaşmagyndan soň, Ci-Hv1 naprýa seneniýe datçiginiň kanalyň işjeňleşmegine sebäp bolýan sazlaşykly üýtgeşmä sezewar bolandygyny anyklady. , soň bolsa iki subunit ýolunda protonlaryň açyk geçmegine sebäp bolýan aýratyn geçiş. Naprýatageeniýe datçiginiň sazlaşykly üýtgemegi naprýatageeniýe gysgyç floresan tarapyndan gözegçilik edildi we ikinji geçişiň D171 pozisiýasyndaky mutasiýa bilen saýlanyp alnandygy anyklandy. Floresan signalyň perburbasiýasy, sazlaşykly üýtgeşmäniň reaksiýa koordinatlary boýunça belli bir wagtda ýanaşyk subunitleriň D171 galyndylarynyň arasynda elektrostatik täsirleriň barlygyna laýyk gelýär. Bu düşündiriş, D123 galyndysynyň açyk ýagdaýda elektrostatiki täsirleşýändigi baradaky netijämiz bilen gabat gelýär. we GBTA baglanyşdyryjy saýtlaryň arasynda allosteriki baglanyşygy ara alyp barýar.
Fujiwara we al25 sitoplazmatik örtükli rulon domeniniň has kiçi interfeýsiniň iki sany S4 helelini (7-nji surat, çep panel) saklamak üçin membrana ýaýramagyny teklip etdi. S4 geliçini we CCD-ni birleşdirýän sebitiň ähli VSD we funksional derňewi. Transmembran pH gradiýentiniň ýoklugynda Hv1 kanallary membrananyň depolýarlaşmagyny talap edýär we kanalyň köplenç ýapyk şertlerinde sistein baglanyşygy bolýar. Şonuň üçin ýüze çykarylan S4-S4 interfeýsi, döwletden daşary subunit konfigurasiýasyny görkezýär. Beýleki gözlegler, kanallaryň açyk we dürli subunit konfigurasiýalaryny kabul edip biljekdigini görkezýän 17,21,26 girelgesinde S1 we S2-leriň özara täsirleşmegine gatnaşygynyň subutnamasyny tapdy. ýapyk döwletler, Mony we başgalaryň netijelerine laýyk gelýän pikir. S1 girelge wagtynda 39 hereket edýär.
Bu ýerde, açyk ýagdaýda, S1 gelixiniň öýjükden daşary uçlarynyň, subunitleriň arasyndaky allosteriki baglanyşygy ara alyp maslahatlaşýan göni elektrostatik täsirleri goldamak üçin ýeterlik ýakyndygyny görkezýäris. biri-birinden gönüden-göni täsirleşmek üçin. Şeýle-de bolsa, iki VSD subunitiniň membrananyň tekizligine perpendikulýar okuň töwereginde 20 ° aýlanmagy, iki S4 dwigateliniň daşky uçlarynyň bölünmegi bilen S1-S1 konfigurasiýasyny berdi. tapyşlarymyz bilen (7b surat, sag panel) .Kanalyň açyk ýagdaýda bu konfigurasiýasyny maslahat berýäris.
CiVSP fermenti monomer hökmünde işleýär öýdülse-de, izolirlenen VSD-iň kristal gurluşy has garaňky ýagdaýda tutulýar. Bu ölçegdäki S1 helelleriniň daşky uçlary giňişlikde biri-birine ýakyn we umumy konfigurasiýa teklip edilýänlere meňzeýär Hv1 üçin. we CiVSP ölçegleri, bu beloklaryň VSD-leri S1-iň öýjükden daşary uçlarynyň özara täsirleşýän interfeýsini emele getirmek meýliniň bardygyny görkezýär.
Sperm öýjükleriniň işjeňleşmeginde Hv1-iň möhüm roly bu kanaly erkekleriň öndürijiligine gözegçilik etmek üçin özüne çekiji derman maksadyna öwürýär. Mundan başga-da, Hv1-iň mikroglýada işjeňleşmegi işemiki insultdan dikelişiň ýaramazlaşýandygy görkezildi. Hv1 işjeňliginiň pesligi bilen baglanyşyklydygy anyklandy Döş 12 ýa-da kolorektal düwnük keseli bolan näsaglarda diri galmak we B öýjükli näsazlyklara goşant goşar öýdülýär 11 .Şonuň üçin Hv1-ni nyşana alýan ownuk molekulaly dermanlar neýroprotektif serişdeleri ýa-da antikanser terapewtiki serişdeleri hökmünde ulanylyp bilner. açyk Hv1 subunit, baglanyşyk ýakynlygynyň ýokarlanmagyna sebäp bolup, Hv1 kanallaryny nyşana alýan has güýçli dermanlaryň ösmegine sebäp bolup biler.
Adam Hv1-iň saýta gönükdirilen mutagenezi adaty PCR usullary bilen ýerine ýetirildi. Hv1NCCiVSP gurluşynda Hv1-iň 1-96 we 228-273 galyndylary CiVSP18-iň 1-113 we 240-576 galyndylary bilen çalşyryldy. Hv1 bilen baglanyşykly ölçegde, bir subunitiň C terminaly, GGSGGSGGSGSGGSGG baglanyşdyryjysy arkaly ikinji subunitiň N terminaly bilen baglanyşdyrylýar. Dürli konstruksiýalary öz içine alýan pGEMHE plazmidleri Nhe1 ýa-da Sph1 çäklendiriji fermentleri (Täze Angliýa Biolabs) bilen RNK sintezi ýerine ýetirildi. T7 mMessage mMachine transkripsiýa toplumy (Ambion) .Elfofiziologiki ölçeglerden 1-3 gün öň, Ksenopus oositlerine (öýjük üçin 50 nl, 0,3-1,5 μg / μl) sanjym edildi .Ksenopus laewisinden (NASCO) V we VI oositler alyndy. Ekosit bioscience-den. RNK sanjymyndan soň, öýjükler 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mMgCl, 10 mM HEPES, 5 mM piruwat, 100 μg / ml gentamisin, pH 7.2 18 ° C bolan ND96 gurşawynda saklandy. .
2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2 ýyl) guanidin [5], (5-bromo-4-metil-1,3) -tiazol-2-ýyl) guanidin) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilat [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazol- 5-karboksilat [9] we (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5 ýyl) etil asetat [10] Sigma-Aldrihden. Famotidin [7] MP Biomedicals-dan. - (4-hlorofenil) -1,3-tiazol-2 ýyl] guanidin [11] we 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3- Tiazol-2 ýyl] guanidin [12] boldy Matrix Scientific-den. Bu birleşmeler täjirçilik taýdan iň ýokary arassalygyndadyr. 100 m aksiýa erginini öndürmek üçin gury DMSO-da eritildi, soňra islenýän jemleýji konsentrasiýada ýazgy ergininde eritildi. 3 we 4-nji goşundylar aşakda sintez edildi azyndan 99% arassalyk.
25 ml suw gidroklor kislotasynda (2,5 N) 2-amin-4- (trifluorometil) benzenetiýol gidrokloridiň (1,02 g, 4,5 mmol) togtadylmagy üçin gaty disikandiamid (380 mg, 4,5 mmol) goşuldy we netijede heterogen garyndy goşuldy. 4 sagatlap güýçli garyşyk bilen şöhlelendi. Reaksiýa garyndysy otag temperaturasyna sowadyldy we 10N kaliý gidroksidini kem-kemden goşmak bilen zyýansyzlandyryldy. Döredilen ak çökündiler süzüldi, sowuk suw bilen ýuwuldy (3 × 50 ml), peçde guradyldy ( 65 ° C) birnäçe sagatlap, soňra ak gaty (500 mg, 48%) bermek üçin etil asetat / nebit efirinden gaýtadan gurulýar; mp 221–222 ° C (ýagtylyk 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MGts, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (gaty giň s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MGts, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3,5 Hz), 117.5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m / z hasaplanan baha. C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416 tapyldy : 261.0419.
Öň düşündirilişi ýaly sintez edilen Nafto [1,2-d] tiazol-2-amin (300 mg, 1,5 mmol), kiçijik synag turbasyndaky ýag wannasynda 200 ° C çenli gyzdyryldy.300 mg (uly artykmaç) sianamid we 1,0 ml konk. Gyzgyn birleşmä çalt gidroklor kislotasy goşuldy we garyndy 2 minut töweregi ýag wannasynda saklandy, şol döwürde suwuň köp bölegi bugardy. Reaksiýa garyndysy otag temperaturasyna sowadyldy we emele gelen gaty material ownuk böleklere bölünip, açyk sary amorf gaty üpjün etmek üçin suw bilen ýuwuldy. (38 mg, 10%) mp 246-250 ° C; 1H NMR (500 MGts, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8,6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MGts, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123,6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m / z hasaplanan baha. C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , tapyldy: 243.0704.
Proton toklary, pClamp10 programma üpjünçiligi bilen Axon Digidata 1440A (Molekulýar Enjamlar) tarapyndan dolandyrylýan Axopatch 200B güýçlendirijisini ulanyp, dürli konstruksiýalary aňladýan oositleriň içki we daşarky ýamalarynda ölçenildi. Öýjükli we öýjükli çözgütler birmeňzeş kompozisiýa eýe: 100 mM 2- (N-morfolino) ) etanesulfon kislotasy (MES), 30 mM tetraetilamonium (TEA) mezilat, 5 mM TEA hlorid, 5 m etilen glikol-bis (2-aminoetil) -N, N, N ', N'-tetraasetik kislota (EGTA) pH 6.0 TEA gidroksidi bilen. Allhli ölçegler 22 ± 2 ° C-de geçirildi. Turbanyň giriş garşylygy 1,5–4 MΩ. Häzirki yzlar 1 kHz-da süzüldi, 5 kHz-da nusga alyndy we Clampfit10.2 (Molekulýar enjamlar) bilen analiz edildi. ) we Origin8.1 (OriginLab).
Hv1 inhibitorynyň dürli konsentrasiýalaryny öz içine alýan çözgütler we käbir ýagdaýlarda pClamp programma üpjünçiligi TTL (Transistor-) arkaly geçirilen VC-6 parfýuziýa klapan ulgamyna (Warner Instr.) Birikdirilen manifold arkaly 10 mM βME hammama girdi. Tranzistor Logika) duýduryşlary. Rapid perfuziýa synaglary, patch turbasynyň öňünde oturdylan 360 μm diametrli gowşuryş ujy bilen köp turbaly perfuziýa galam (AutoMate Sci.) Bilen geçirildi. +120 mV depolýarlaşdyryjy impuls. GV ölçegleri öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi 18,20. Guýruk toklary -20 mV-den +120 mV çenli dürli naprýa ateniýede depolýarlaşma ädimlerinden soň -40 mV-de hasaba alyndy. Synag impulsynyň öňündäki salgylanma impulsy Häzirki çüýremek üçin 18 ulanylýar .GV grafigi Boltzmann deňlemesine laýyk gelýär:
Kanallaryň we ingibitorlaryň dürli kombinasiýalary üçin görünýän bölünme yzygiderliligi (Goşmaça tablisa 1), inhibisiýanyň konsentrasiýa baglylygyny (ortaça% inhib bahalary) Hill deňlemesi bilen kesgitlemek arkaly kesgitlenildi:
bu ýerde [I] inhibitory I, h bolsa Hill koeffisiýenti. Dep koeffisiýentini hasaplamak üçin (2) deňleme aşakdaky ýaly tertipleşdirilýär:
Iş wagty: Iýun-07-2022
