Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS এর জন্য সীমিত সমর্থন রয়েছে। সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা Internet Explorer-এ সামঞ্জস্য মোড বন্ধ করুন)। ইতিমধ্যে, নিশ্চিত করতে অব্যাহত সমর্থন, আমরা শৈলী এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট প্রদর্শন করবে.
Hv1 ভোল্টেজ-গেটেড প্রোটন চ্যানেল হল একটি ডাইমেরিক কমপ্লেক্স যা দুটি ভোল্টেজ-সেন্সিং ডোমেন (ভিএসডি) নিয়ে গঠিত, যার প্রতিটিতে একটি গেটেড প্রোটন পারমিয়েশন পাথওয়ে রয়েছে। ডাইমারাইজেশন সাইটোপ্লাজমিক কয়েলড-কয়েল ডোমেন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। বদ্ধ অবস্থা থেকে রূপান্তরিত হয় উভয় VSD-তে খোলা অবস্থা সমবায়ভাবে ঘটতে পরিচিত; যাইহোক, অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়া সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। ইন্টারসুবুনিট ইন্টারফেসগুলি অ্যালোস্টেরিক প্রক্রিয়াগুলিতে মূল ভূমিকা পালন করে; যাইহোক, এই ধরনের ইন্টারফেসগুলি খোলা Hv1 চ্যানেলগুলিতে চিহ্নিত করা হয়নি৷ এখানে আমরা দেখাই যে 2-গুয়ানিডিনোথিয়াজোল ডেরিভেটিভগুলি একটি সমবায় পদ্ধতিতে দুটি Hv1 VSD ব্লক করে এবং এই যৌগগুলির একটিকে খোলা সাবইউনিটের মধ্যে অ্যালোস্টেরিক সংযোগের জন্য একটি প্রোব হিসাবে ব্যবহার করে৷ আমরা দেখতে পেয়েছি যে বহিরাগত কোষ VSD-এর প্রথম ট্রান্সমেমব্রেন ফ্র্যাগমেন্টের শেষে একটি ইন্টারসাবুনিট ইন্টারফেস তৈরি করে যা বাঁধাই সাইটগুলির মধ্যে সংযোগের মধ্যস্থতা করে, যেখানে কয়েলড-কয়েল ডোমেন সরাসরি এই প্রক্রিয়ার সাথে জড়িত নয়৷ আমরা আরও শক্তিশালী প্রমাণ পেয়েছি যে চ্যানেলের প্রোটন-সিলেক্টিভ ফিল্টার ব্লকার-বাইন্ডিং সহযোগিতা নিয়ন্ত্রণ করে৷ .
ফাইটোপ্ল্যাঙ্কটন থেকে মানুষ পর্যন্ত বিভিন্ন জীবের মধ্যে ভোল্টেজ-গেটেড প্রোটন চ্যানেলগুলি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে 1। বেশিরভাগ কোষে, এই চ্যানেলগুলি প্রোটন ঝিল্লি থেকে প্রোটন প্রবাহের মধ্যস্থতা করে এবং NADPH অক্সিডেসের কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করে। মানুষের মধ্যে একমাত্র পরিচিত ভোল্টেজ-গেটেড প্রোটন চ্যানেল। হল Hv1, যা HVCN1 জিন 2,3.Hv1 (ওরফে VSOP) বি কোষের বিস্তার 4, সহজাত ইমিউন সিস্টেম দ্বারা প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির উত্পাদন 5,6,7,8, শুক্রাণু কোষের ভূমিকা পালন করতে দেখা গেছে গতিশীলতা9 এবং শ্বাসনালী পৃষ্ঠের তরল 10 এর pH নিয়ন্ত্রণ। এই চ্যানেলটি বিভিন্ন ধরণের ক্যান্সারের সাথে জড়িত যেমন বি-সেল ম্যালিগন্যান্সি 4,11 এবং স্তন এবং কোলোরেক্টাল ক্যান্সার 12,13। অত্যধিক Hv1 কার্যকলাপ ক্যান্সার কোষের মেটাস্ট্যাটিক সম্ভাবনা 11, 12 বৃদ্ধি করতে পাওয়া গেছে। মস্তিষ্কে, Hv1 প্রকাশ করা হয় মাইক্রোগ্লিয়া দ্বারা, এবং এর কার্যকলাপ ইস্কেমিক স্ট্রোকের মডেলগুলিতে মস্তিষ্কের ক্ষতিকে বাড়িয়ে তুলতে দেখানো হয়েছে।
Hv1 প্রোটিনে একটি ভোল্টেজ-সেন্সিং ডোমেন (VSD) রয়েছে, যা S1 থেকে S414 নামে চারটি ট্রান্সমেমব্রেন সেগমেন্ট নিয়ে গঠিত। ভিএসডি ভোল্টেজ-গেটেড Na+, K+ এবং Ca2+ চ্যানেল এবং ভোল্টেজ-সংবেদনশীল ফসফেটেসের মতো সিভিএসপি-এর অনুরূপ ডোমেনগুলির সাথে সাদৃশ্যপূর্ণ। Ciona gutis15. এই অন্যান্য প্রোটিনে, S4-এর C-টার্মিনাস একটি ইফেক্টর মডিউল, ছিদ্র ডোমেন বা এনজাইমের সাথে সংযুক্ত থাকে৷ Hv1-এ, S4 ঝিল্লির সাইটোপ্লাজমিক দিকে অবস্থিত কয়েলড-কয়েল ডোমেনের (CCD) সাথে সংযুক্ত থাকে৷ চ্যানেলটি দুটি ভিএসডি নিয়ে গঠিত একটি ডাইমেরিক কমপ্লেক্স যার প্রতিটিতে একটি গেটেড প্রোটন পারমিয়েশন পাথওয়ে রয়েছে 16,17,18৷ এই দুটি Hv1 সাবইউনিটগুলিকে সহযোগিতামূলকভাবে 19,20,21,22 খোলার জন্য পাওয়া গেছে, যা প্রস্তাব করে যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিং এবং আন্তঃ-সাবুনিট ইন্টারঅ্যাকশনগুলি খেলতে পারে৷ গেটিং প্রক্রিয়ায় একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা। কুণ্ডলীকৃত কয়েল ডোমেনের মধ্যে সাবইউনিটগুলির মধ্যে ইন্টারফেসটি ভালভাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে কারণ দুটি বিচ্ছিন্ন ডোমেনের স্ফটিক কাঠামো উপলব্ধ 22,23। অন্যদিকে, ঝিল্লির মধ্যে ভিএসডিগুলির মধ্যে ইন্টারফেস নেই ভালভাবে বোঝা যায়। Hv1-CiVSP কাইমেরিক প্রোটিনের স্ফটিক গঠন এই ইন্টারফেস সম্পর্কে তথ্য প্রদান করে না, কারণ ক্রিস্টালাইজড চ্যানেল কমপ্লেক্সের ট্রাইমেরিক সংগঠনটি ইস্ট লিউসিন জিপার GCN424 দ্বারা নেটিভ Hv1 সিসিডি প্রতিস্থাপনের ফলে হতে পারে।
Hv1 চ্যানেলের সাবইউনিট অর্গানাইজেশনের একটি সাম্প্রতিক গবেষণায় এই সিদ্ধান্তে উপনীত হয়েছে যে দুটি S4 হেলিস সিসিডিতে গৌণ কাঠামোর গুরুতর ব্যাঘাত ছাড়াই স্থানান্তরিত হয়, যার ফলে দীর্ঘ হেলিসগুলি ঝিল্লি থেকে শুরু হয় এবং সাইটোপ্লাজমে প্রজেক্ট হয়। সিস্টাইন ক্রসলিংকিং বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে, এই সমীক্ষাটি প্রস্তাব করে যে Hv1 VSDs S4 সেগমেন্ট বরাবর একে অপরের সাথে যোগাযোগ করে। যাইহোক, অন্যান্য গবেষণায় VSD-এর মধ্যে বিকল্প ইন্টারফেস প্রস্তাব করা হয়েছে। এই ইন্টারফেসের মধ্যে S1 সেগমেন্ট 17, 21, 26 এবং S2 সেগমেন্ট 21-এর বাইরের প্রান্ত রয়েছে। বিরোধের সম্ভাব্য কারণ এই অধ্যয়নের ফলাফল হল যে ভিএসডিগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংকে গেটিং প্রক্রিয়ার সাথে সম্পর্কিত পরীক্ষা করা হয়েছিল, যা বন্ধ এবং খোলা অবস্থার উপর নির্ভর করে এবং ভিএসডিগুলির মধ্যে ইন্টারফেস বিভিন্ন অবস্থার পরিবর্তনে পরিবর্তিত হতে পারে।
এখানে, আমরা দেখতে পেলাম যে 2-গুয়ানিডিনোথিয়াজোল Hv1 চ্যানেলগুলিকে দুইটি খোলা ভিএসডির সাথে সিনারজিস্টিকভাবে আবদ্ধ করে বাধা দেয় এবং উন্মুক্ত অবস্থায় সাবইউনিটের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া তদন্তের জন্য যৌগগুলির একটি, 2-গুয়ানিডিনোবেনজোথিয়াজোল (GBTA) ব্যবহার করে। interface.আমরা দেখেছি যে GBTA বাইন্ডিং বক্ররেখা একটি পরিমাণগত মডেল দ্বারা ভালভাবে বর্ণনা করা যেতে পারে যেখানে একটি সাবইউনিটে একটি ইনহিবিটরকে আবদ্ধ করার ফলে সন্নিহিত সাবইউনিটের বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি বৃদ্ধি পায়৷ আমরা আরও খুঁজে পেয়েছি যে অবশিষ্টাংশগুলি D112, সিলেক্টিভিটি ফিল্টারগুলির জন্য চ্যানেল 27, 28 এবং গুয়ানিডিন ডেরিভেটিভ বাইন্ডিং সাইটের অংশ 29 GBTA বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটি নিয়ন্ত্রণ করে। আমরা দেখাই যে সমবায় বাইন্ডিং Hv1 ডাইমারে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়, যেখানে সিসিডি S4 সেগমেন্ট থেকে আলাদা হয়, পরামর্শ দেয় যে সিসিডিতে ইন্টারসাবুনিট ইন্টারফেস সরাসরি নয়। জিবিটিএ-বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংকে মধ্যস্থতা করুন৷ বিপরীতে, আমরা দেখতে পাই যে S1 খণ্ডটি সাবইউনিটের মধ্যে ইন্টারফেসের অংশ এবং অনুমতি দেওয়ার জন্য S4 হেলিক্সের বহির্মুখী প্রান্তের সাথে ডাইমারের কেন্দ্র থেকে দূরে সংলগ্ন ভিএসডিগুলির একটি বিন্যাস প্রস্তাব করে৷ S1 খণ্ডটি খোলা অবস্থায় থাকতে হবে।
Hv1 এর ছোট অণু প্রতিরোধক ক্যান্সার প্রতিরোধক ওষুধ এবং নিউরোপ্রোটেক্টিভ এজেন্ট হিসাবে কার্যকর। তবে, আজ পর্যন্ত, কয়েকটি যৌগ চ্যানেল30,31,32,33কে বাধা দিতে সক্ষম হয়েছে। তাদের মধ্যে, 2-গুয়ানিডিনোবেনজিমিডাজল (2GBI, যৌগ [1] চিত্রে । 200 μM (চিত্র 1b) এর ঘনত্বে পরীক্ষা করার সময় Hv1কে প্রায় 2GBI-এর মতোই কার্যকরভাবে প্রতিরোধ করতে দেখানো হয়েছে। আমরা অন্যান্য থিয়াজোল ডেরিভেটিভস পরীক্ষা করে দেখেছি যে তাদের মধ্যে কিছু GBTA (চিত্র 1 এবং পরিপূরক) এর তুলনায় অনুরূপ বা বেশি শক্তির সাথে চ্যানেলকে বাধা দেয়। টেক্সট)। আমরা চারটি থিয়াজোল ডেরিভেটিভস (GBTA এবং যৌগগুলি [3], [6] এবং [11], চিত্র 1c) এর ঘনত্ব প্রতিক্রিয়া বক্ররেখা নির্ধারণ করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে তারা 2GBI-এর তুলনায় খাড়া। হিল কোফিসিয়েন্ট (h) থিয়াজোল ডেরিভেটিভের পরিসীমা 1.109 ± 0.040 থেকে 1.306 ± 0.033 পর্যন্ত (চিত্র। 1c এবং পরিপূরক চিত্র 1)। বিপরীতে, 2GBI-এর হিল সহগ ছিল 0.975 ± 0.024 29, চিত্র 2a এবং পরিপূরক চিত্র 1)। 1-এর উপরে একটি হিল সহগ বাঁধাই সমবায় নির্দেশ করে। কারণ প্রতিটির নিজস্ব Hv1-এর সাব-অনবিট রয়েছে। বাইন্ডিং সাইট,29,32 আমরা যুক্তি দিয়েছিলাম যে একটি সাবইউনিটে একটি থিয়াজোল ডেরিভেটিভের বাঁধন পার্শ্ববর্তী সাবইউনিটে দ্বিতীয় ইনহিবিটর অণুর বাঁধনকে বাড়িয়ে তুলতে পারে। জিবিটিএ ছিল সর্বোচ্চ হিল সহগ সহ পরীক্ষার যৌগ। তাই, আমরা এই যৌগটিকে বেছে নিয়েছি বাইন্ডিং সিনার্জির প্রক্রিয়াটি আরও অধ্যয়ন করে এবং রেফারেন্স নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে 2GBI ব্যবহার করে।
(ক) টেস্ট যৌগ: [১] রেফারেন্স Hv1 ইনহিবিটর 2-গুয়ানিডিনো-বেনজিমিডাজল (2GBI)। 2-গুয়ানিডিনো-বেনজোথিয়াজোল (GBTA), [3] (5-ট্রাইফ্লুরোমিথাইল-1,3-বেনজোথিয়াজল-2-ইএল) গুয়ানিডিন, [4] ন্যাপথো[1,2-ডি][1, 3] থিয়াজল-2-ইএল -গুয়ানিডিন, [৫](৪-মিথাইল-১,৩-থিয়াজল-২-ইএল)গুয়ানিডিন, [৬](৫-ব্রোমো-৪-মিথাইল-১,৩-থিয়াজল-২-ইএল)গুয়ানিডিন, [৭] famotidine, [8] 2-guanidino-5-মিথাইল-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-মিথাইল ইথাইল-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-গুয়ানিডিনো-4-মিথাইল-1,3-থিয়াজল-5-ইএল)ইথাইল অ্যাসিটেট, [11]1-[4-(4 -ক্লোরোফেনাইল)-1,3-থিয়াজল-2-ইএল]গুয়ানিডিন, [ 12]1-[4-(3,4-ডাইমেথোক্সিফেনাইল)-1,3-থিয়াজল-2-ইএল]গুয়ানিডিন। (খ) নির্দেশিত গুয়ানিডিনোথিয়াজোলস এবং রেফারেন্স যৌগ 2GBI (নীল-সবুজ বার) দ্বারা মানুষের Hv1 কার্যকলাপের বাধা .Hv1 প্রোটন স্রোতগুলি -80 mV থেকে +120 mV ধারণ ক্ষমতা থেকে বিধ্বংসীকরণের প্রতিক্রিয়া হিসাবে Xenopus oocytes-এর ভিতরের-আউট প্লেকগুলিতে পরিমাপ করা হয়েছিল৷ প্রতিটি ইনহিবিটারকে 200 μM.pHi = pHo = 6.0 ঘনত্বে স্নানে যুক্ত করা হয়েছিল৷ .ডেটা হল গড় ±SEM (n≥4)।(c) যৌগগুলি দ্বারা মানুষের Hv1-এর ঘনত্ব-নির্ভর বাধা। 15 পরিমাপ. লাইনটি হল একটি হিল ফিট যা সম্পূরক সারণী 1-এ রিপোর্ট করা আপাত Kd মানগুলি পেতে ব্যবহৃত হয়। হিল সহগ পরিপূরক চিত্র 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± তে রিপোর্ট করা ফিটগুলি থেকে নির্ধারিত হয়েছিল 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (পদ্ধতি দেখুন)।
(a,b) যৌগগুলি 2GBI এবং GBTA ঘনত্ব-নির্ভর পদ্ধতিতে dimeric এবং monomeric Hv1কে বাধা দেয়৷ প্রতিটি বিন্দু 3 থেকে 8 পরিমাপের গড় বাধা ± SD প্রতিনিধিত্ব করে এবং বক্ররেখা হল একটি হিল ফিট৷ হিল সহগ (h) এ দেখানো হয়েছে ইনসেট হিস্টোগ্রামগুলি পরিপূরক ডুমুর 3 এবং 4 তে রিপোর্ট করা ফিটগুলি থেকে নির্ধারণ করা হয়েছিল৷ (a) তে দেখানো GBTA এর ঘনত্বের প্রতিক্রিয়া চিত্র 1c এর মতোই৷ আপাত Kd মানগুলির জন্য পরিপূরক সারণী 1 দেখুন৷ (c) এর মডেলিং ডাইমেরিক Hv1 এর সাথে GBTA এর সমবায় বাঁধন। কঠিন কালো রেখাটি সমীকরণ (6) দ্বারা পরীক্ষামূলক ডেটার সাথে মানানসই প্রতিনিধিত্ব করে, যা (d) তে দেখানো বাঁধাই মডেলকে বর্ণনা করে। সাব 1 এবং সাব 2 লেবেলযুক্ত ড্যাশযুক্ত লাইনগুলি বাইমোলিকুলার অ্যাসোসিয়েশনের প্রতিনিধিত্ব করে -প্রথম এবং দ্বিতীয় বাইন্ডিং ইভেন্টের ডিসসোসিয়েশন ভারসাম্য বক্ররেখা, যথাক্রমে (উপ 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; সাব 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM । উচ্চ সম্বন্ধীয় অবস্থায় নীল। মনোমেরিক Hv1-এর সাথে GBTA আবদ্ধ হওয়ার জন্য, বিক্রিয়ার জন্য বিচ্ছিন্নতা ধ্রুবক: O° + B ⇄ B° Kd1 এবং Kd2-এর মধ্যে, কিন্তু পরেরটির কাছাকাছি (ধূসর-নীল স্ট্রাইপগুলি মাঝারি সখ্যতা নির্দেশ করে)।
Hv1 চ্যানেলগুলি তাদের N- এবং C-টার্মিনাল সাইটোপ্লাজমিক ডোমেনগুলিকে Ciona Intestinalis ভোল্টেজ-সংবেদনশীল ফসফেটেস CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 এর অনুরূপ অংশগুলির সাথে প্রতিস্থাপন করে মনোমারাইজ করা যেতে পারে৷ ডাইমেরিক চ্যানেল (ওয়াইল্ড-টাইপ) ইনহিবিশন (চিত্র 2a,b) এর সাথে তাদের তুলনা করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে দুটি যৌগের মধ্যে বাঁধাই সহযোগিতার পার্থক্যটি মনোমেরিক এইচভি1-তে বাদ দেওয়া হয়েছে, এই ব্যাখ্যাটিকে সমর্থন করে যে GBTA একটি সাবইউনিটের সাথে আবদ্ধ হওয়া বৃদ্ধি করে। ইনহিবিটরের জন্য অন্য সাবইউনিটের সখ্যতা। আমরা যুক্তি দিয়েছিলাম যে একটি Hv1 সাবইউনিটের সাথে GBTA আবদ্ধ হওয়ার ফলে বাইন্ডিং সাইটের পুনর্বিন্যাস হতে পারে (ফিট35 প্ররোচিত করে), যা পার্শ্ববর্তী সাবইউনিটের খালি বাঁধাই সাইটের পুনর্বিন্যাসকে ট্রিগার করবে, যার ফলে বাঁধাই বৃদ্ধি পাবে সম্বন্ধ
পরিমাণগতভাবে চ্যানেলে GBTA-এর সমবায় বাইন্ডিং বর্ণনা করার জন্য, আমরা একটি মডেল ব্যবহার করেছি যেখানে হয় সাবইউনিট প্রথম ইনহিবিটর অণুকে একটি বিয়োজন ধ্রুবক Kd1 (চিত্র 2c, সাব 1, OO+ B ⇆ BO* ) সহ একটি দ্বি-আণবিক বিক্রিয়া অনুসরণ করে আবদ্ধ করতে পারে। বাইন্ডিং চ্যানেলটিকে এমন একটি অবস্থা গ্রহণ করে যেখানে অবশিষ্ট খালি সাবইউনিটগুলি একটি বিচ্ছিন্ন ধ্রুবক Kd2 সহ একটি অনন্য দ্বিমোলিকুলার প্রতিক্রিয়া অনুসরণ করে ইনহিবিটরের সাথে আবদ্ধ হয়, যেখানে Kd2 চিত্র 2c-এর কঠিন কালো রেখাটি পরীক্ষামূলক ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া বক্ররেখার মডেল সমীকরণের সাথে মানানসই, যা ~290 μM এর Kd1 এবং ~29 μM এর একটি Kd2 (পদ্ধতি বিভাগ, সমীকরণ (6)) দেয়। মডেলটিও বর্ণনা করে। 2GBI এর বাইন্ডিং, যেখানে Kd2 ≈ Kd1 = Kd (চিত্র 2d)। মনোমেরিক Hv1-এ, শুধুমাত্র একটি বাইন্ডিং সাইট এবং একটি Kdm (O° + B ⇆ B°) রয়েছে। GBTA এর ক্ষেত্রে, Kdm প্রায় 54। μM, যা Kd2 (চিত্র 2d) এর চেয়ে Kd1 এর সাথে বেশি মিল রয়েছে। অন্য কথায়, মনোমারের বাঁধাই সাইটটি একটি কনফিগারেশনে (O°) নিম্ন-এর চেয়ে উচ্চ-অ্যাফিনিটি অবস্থার (BO*) সাথে বেশি মিল রয়েছে। ডাইমারের অ্যাফিনিটি স্টেট (OO), সম্ভবত সাবুনিটের মধ্যে ইন্টারফেস বাদ দেওয়ার কারণে।
যেমনটি পূর্বে 2GBI32-এর জন্য দেখানো হয়েছে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে GBTA চ্যানেলটি খোলা অবস্থায় ব্লক করার মাধ্যমে Hv1 স্রোতকে দমন করে, এটি খোলার জন্য কঠিন করার পরিবর্তে (পরিপূরক চিত্র 2a,b,d)। মেমব্রেন রিপোলারাইজেশনের প্রতিক্রিয়ায়, কিন্তু এই ঘটনাটি GBTA (পরিপূরক চিত্র 2c) তে পরিলক্ষিত হয়নি। 2GBI-এর উপস্থিতিতে Hv1 নিষ্ক্রিয়তার উপস্থিতিতে, ব্লকার বাইন্ডিং সাইট ছেড়ে না যাওয়া পর্যন্ত প্রতিটি সাবইউনিটের গেটগুলি বন্ধ করতে পারে না (" ফুট গেট" মেকানিজম), এবং 2GBI গেট বন্ধ করার চেয়ে ধীরে ধীরে আনবাইন্ড করে। যদি একটি Hv1 সাবইউনিট আনব্লক করা হয় এবং বন্ধ করা হয়, যখন পার্শ্ববর্তী সাবইউনিট অবরুদ্ধ থাকে, বাকি 2GBI অণুগুলির আনবাইন্ডিং ধীর হয়ে যায় (ব্লকার ক্যাপচার)। দীর্ঘজীবী চ্যানেল প্রজাতির সাথে শুধুমাত্র একটি অবরুদ্ধ সাবইউনিট বন্ধ হওয়ার আগে ক্ষণস্থায়ীভাবে প্রোটন পরিচালনা করে এবং ধীরে ধীরে ক্ষয়প্রাপ্ত লেজ প্রবাহে গুরুত্বপূর্ণ অবদান রাখে।
GBTA (পরিপূরক চিত্র 2c) উপস্থিতিতে Hv1 টেইল স্রোতের ক্ষয় উল্লেখযোগ্যভাবে ধীর হয়নি তা এই ব্লকারের (চিত্র 2d) জন্য একটি সিনেরজিস্টিক বাইন্ডিং মেকানিজমের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। একবার একটি GBTA অণু Hv1 সাবইউনিট থেকে আনবাউন্ড হয়ে গেলে , সংলগ্ন সাবইউনিটের সাথে ব্লকারের সখ্যতা প্রায় 10-গুণ কমে যায়, যা আনবাইন্ডিং প্রক্রিয়ার পক্ষে থাকে। এর মানে হল যে GBTA-এর দ্বিতীয় অণুটি চ্যানেলে আটকা পড়ার আগে উন্মোচিত হওয়ার অনেক বেশি সম্ভাবনা রয়েছে। দীর্ঘজীবী চ্যানেল প্রজাতি যা শুধুমাত্র একটি ব্লকিং সাবইউনিট উৎপন্ন করে 2GBI-এর উপস্থিতির তুলনায় GBTA-এর উপস্থিতিতে অনেক বেশি প্রাচুর্য হবে বলে আশা করা হচ্ছে, যার ফলে দ্রুত লেজ কারেন্ট ক্ষয় হয়।
GBTA যাতে উভয় Hv1 সাবইউনিটের সাথে সহযোগিতামূলকভাবে আবদ্ধ হয়, বাইন্ডিং সাইটগুলিকে অবশ্যই অ্যালোস্টেরিকভাবে সংযুক্ত করতে হবে৷ প্রতিটি বাইন্ডিং সাইট অবশ্যই সক্ষম হতে হবে: 1) ইভেন্টের একটি চেইন ট্রিগার করে যা ইনহিবিটরের সাথে আবদ্ধ সংলগ্ন সাবুনিটের সাথে যোগাযোগ করে এবং 2) মধ্যস্থতা করে লো-অ্যাফিনিটি থেকে হাই-অ্যাফিনিটি বাইন্ডিং-এ রূপান্তর। আমরা যুক্তি দিয়েছিলাম যে যদি বাঁধাই সাইটের মধ্যে নির্দিষ্ট অবশিষ্টাংশ সমবায় প্রক্রিয়ায় অবদান রাখে, তাহলে তাদের মিউটেশন Hv1.Residues D112, F150 এর GBTA নিরোধের ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া বক্ররেখার হিল সহগকে পরিবর্তন করবে। , S181 এবং R211 কে পূর্বে 2GBI29 বাইন্ডিং এনভায়রনমেন্টের অংশ হিসাবে দেখানো হয়েছিল এবং আমরা অনুমান করেছিলাম যে তারা একইভাবে GBTA বাইন্ডিং (চিত্র 3A) এর সাথে জড়িত থাকবে। আমরা মিউট্যান্ট চ্যানেল D112E, F150A, S1811 এর জন্য GBTA এর নিরোধক ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া বক্ররেখা পরিমাপ করেছি। , এবং R211S (চিত্র 3) এবং তাদের হিল কোফিসিয়েন্টগুলিকে Hv1 ওয়াইল্ড-টাইপের সাথে তুলনা করেছে, একটি রেফারেন্স হিসাবে 2GBI ব্যবহার করে। অবশিষ্ট V109 S1 সেগমেন্টের D112 এর মতো একই মুখে রয়েছে এবং কোষের ভিতরে একটি অতিরিক্ত হেলিকাল বাঁক রয়েছে। V109 2GBI29 এর বাঁধনের সাথে জড়িত ছিল না, আমরা V109A মিউট্যান্টকে একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করেছি (চিত্র। 3 খ)।
(a) প্রস্তাবিত Hv1 অবশিষ্টাংশ গুয়ানিডিন ডেরিভেটিভ বাইন্ডিং এর সাথে জড়িত। ড্যাশ করা নীল বক্ররেখা পূর্বে প্রস্তাবিত সাইড চেইনকে ঘিরে থাকে যা যৌগ 2GBI29 এর বিভিন্ন অংশের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে। গাঢ় লাল। প্রতিটি বিন্দু 3 থেকে 12 পরিমাপের গড় বাধাকে ± SD V109 একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে উপস্থাপন করে। বক্ররেখা হল হিল ফিট যা আপাত Kd মান পেতে ব্যবহৃত হয় (পরিপূরক সারণী 1 দেখুন)। হিল সহগ (h) এ দেখানো হয়েছে ইনসেট হিস্টোগ্রামগুলি পরিপূরক ডুমুর 3 এবং 4-এ রিপোর্ট করা ফিটগুলি থেকে নির্ধারণ করা হয়েছিল৷ Hv1 WT-এর জন্য রেফারেন্স h মানগুলি ড্যাশড লাইন হিসাবে দেখানো হয়েছে৷ তারকাচিহ্নগুলি মিউট্যান্ট এবং WT প্যাসেজের মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p আমরা দেখতে পেয়েছি যে D112E মিউটেশন হিল সহগকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে (p জিবিটিএ বাইন্ডিংয়ের হিল সহগ Hv1 ডাইমারে 1 এর চেয়ে বেশি এবং মনোমেরিক চ্যানেলে ~1 হয়ে যায় (চিত্র 2b) দুটি সাবইউনিটে বাঁধাই সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক মিথস্ক্রিয়াগুলির অস্তিত্বের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। যদি এটি হয় ক্ষেত্রে, ব্লকার যে ডাইমারের সাথে একটি সাবইউনিটে আবদ্ধ হয়েছে তার হিল সহগ ~1 হওয়া উচিত। আমরা এই ভবিষ্যদ্বাণীটি Hv1 F150A-WT লিঙ্কযুক্ত ডাইমারে (চিত্র 4a) পরীক্ষা করেছি, যেখানে F150A এর সম্বন্ধ GBTA-এর জন্য সাবইউনিট WT সাবইউনিটের (Figs. 1c এবং 3d) তুলনায় 2 অর্ডারের বেশি মাত্রার ছিল। তারপরে আমরা 2 μM GBTA এর বেসাল ঘনত্বে WT সাবইউনিটের বাধার জন্য ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া বক্ররেখা পরিমাপ করেছি। এই ঘনত্বে , ব্লকারটি F150A সাবইউনিটের প্রায় 99% এবং WT সাবইউনিটের (a) ব্লকিং হেমিচ্যানেল ({F150A}b-WT/BAO*) তৈরি করতে ব্যবহৃত F150A-WT জংশন ডাইমারের স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম। সাদা হীরা মিউটেশনের অবস্থান দেখায়। BAO* এবং BA*B* অবস্থায়, F150A সাবইউনিটের সম্বন্ধ WT সাবইউনিটের চেয়ে বেশি হবে বলে আশা করা হচ্ছে। (b) −80 mV থেকে +120 mV.pHi = pHo = 6.0 পর্যন্ত ঝিল্লি সম্ভাবনার পরিবর্তনের প্রতিক্রিয়া হিসাবে F150A-WT চ্যানেল থেকে প্রোটন স্রোত পরিমাপ করা হয়েছে। .ধূসর চিহ্নগুলি ইনহিবিটারের অনুপস্থিতিতে পরিমাপ করা স্রোতকে প্রতিনিধিত্ব করে৷ কালো ট্রেস (নিয়ন্ত্রণ) 2 μM GBTA যোগ করার পরে পরিমাপ করা বর্তমানকে প্রতিনিধিত্ব করে৷ এই ঘনত্বে, WT সাবইউনিট উল্লেখযোগ্যভাবে বাধাপ্রাপ্ত হয়নি, যেখানে F150A সাবইউনিট প্রায় সম্পূর্ণরূপে GBTA-তে আবদ্ধ ছিল৷ ({F150A}b-WT)। GBTA ঘনত্বের আরও বৃদ্ধির ফলে WT সাবইউনিট (কমলা এবং লাল চিহ্ন) অবরুদ্ধ হয়। (c) {F150A}b-WT ডাইমারের ঘনত্ব-নির্ভর বাধা (ইনহিবিটর প্রি-বাউন্ড) F150A সাবইউনিট)। প্রতিটি বিন্দু 3 থেকে 7 পরিমাপের গড় বাধা ± SD প্রতিনিধিত্ব করে। বক্ররেখাগুলি ছিল পরিপূরক সারণি 1-এ রিপোর্ট করা আপাত Kd মানগুলি পেতে ব্যবহৃত হিল ফিট। ইনসেট হিস্টোগ্রামে দেখানো হিল সহগগুলি পরিপূরক ডুমুর 3 এবং 4-এ রিপোর্ট করা ফিটগুলি থেকে নির্ধারিত হয়েছিল। Hv1 WT-এর h মানগুলি হল ড্যাশড লাইন হিসাবে দেখানো হয়েছে৷ তারকাচিহ্নগুলি WT dimer Hv1 এর তুলনায় পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p যেহেতু Hv1-এর GBTA নিষেধাজ্ঞা খোলা চ্যানেলে পরিমাপ করা হয়েছিল, তাই আমরা যুক্তি দিয়েছিলাম যে GBTA বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটি খোলা অবস্থায় ইন্টারসাবনিট কাপলিং এর প্রক্রিয়া অধ্যয়ন করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। 22 এবং গেটিং এর সাথে জড়িত ইন্টারসুবুনিট কাপলিংকে সাইটোপ্লাজমিক কয়েলড-কয়েল ডোমেন (CCD) 22,25 দ্বারা মধ্যস্থতা করার প্রস্তাব করা হয়েছিল। অতএব, আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে CCD খোলা অবস্থায় জিবিটিএ-বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে সংযোগের সাথে জড়িত কিনা। ট্রাইগ্লাইসিন S4 ট্রান্সমেমব্রেন ফ্র্যাগমেন্ট এবং কয়েলড-কয়েল ডোমেনের মধ্যে ইন্টারফেসে মিউটেশনগুলি পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখানো হয়েছিল যাতে ডাইমারাইজেশন অখণ্ডতা বজায় রেখে চ্যানেলের বাকি অংশ থেকে এই ডোমেনটি ডিকপল করা যায়। অতএব, আমরা মিউটেশন V220G, K221G এবং T222G (চিত্র) এর প্রভাব পরীক্ষা করেছি। । দুটি সাবইউনিট একসাথে গুরুত্বপূর্ণ, কিন্তু সিসিডি সরাসরি জিবিটিএ বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে ইন্টারসাবুনিট অ্যালোস্টেরিক কাপলিংকে মধ্যস্থতা করে না।
(a) সাইটোপ্লাজমিক কয়েলড-কয়েল ডোমেন (নীল তীর) দ্বারা মধ্যস্থতা করা ইন্টারসাবুনিট কাপলিংকে ব্যাহত করার জন্য ডিজাইন করা S4 এর ভিতরের প্রান্তে ট্রাইগ্লাইসিন মিউটেশন সহ Hv1 ডাইমারের পরিকল্পিত চিত্র। নির্দেশিত মিউটেশন, সাবুনিট (নীল তীর) এর মধ্যে সংযোগে জড়িত S1 খণ্ডগুলি পরীক্ষা করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। 3 থেকে 10 পরিমাপের ± SD। বক্ররেখাটি একটি হিল ফিট ছিল যা আপাত Kd মানগুলি প্রাপ্ত করার জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল (পরিপূরক সারণী 1 দেখুন)। ইন্টারপোলেটেড হিস্টোগ্রামের হিল সহগগুলি পদ্ধতি বিভাগে বর্ণিত হিসাবে নির্ধারণ করা হয়েছিল (পরিপূরক ডুমুর 3 এবং 4 দেখুন)। এর জন্য রেফারেন্স h মানগুলি Hv1 WT ড্যাশড লাইন হিসাবে দেখানো হয়েছে৷ তারকাচিহ্নগুলি মিউট্যান্ট এবং WT প্যাসেজের মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p যেহেতু আমরা GBTA কোঅপারেটিভ বাইন্ডিংয়ের সরাসরি মধ্যস্থতাকারী হিসাবে সিসিডিকে বাতিল করে দিয়েছি, তাই আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে ভিএসডিগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়াগুলি বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংয়ে জড়িত কিনা৷ আমরা দেখতে পেয়েছি যে GBTA- বাঁধাই সমবায় বিলুপ্ত হয়েছে অবশিষ্টাংশ D112 (চিত্র 3c) এর রক্ষণশীল মিউটেশন দ্বারা বিলুপ্ত হয়েছে৷ S1 ট্রান্সমেমব্রেন সেগমেন্টে। S1-এ দুটি নেতিবাচক চার্জযুক্ত অবশিষ্টাংশ রয়েছে, E119 এবং D123, D112 এর মতো হেলিক্সের একই পাশে অবস্থিত, কিন্তু খণ্ডটির বাইরের প্রান্ত 24 এর কাছাকাছি। প্রারম্ভিক আণবিক গতিবিদ্যা সিমুলেশনগুলি নির্দেশ করে যে এই অবশিষ্টাংশগুলি সংযুক্ত ছিল ওয়াটারলাইনস 36,37 এর মাধ্যমে D112 পর্যন্ত। অতএব, আমরা পরীক্ষা করেছি যে E119 এবং D123 GBTA-বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংয়ে জড়িত কিনা (চিত্র 5b)। নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, আমরা সংরক্ষিত ইতিবাচক চার্জযুক্ত অবস্থান K125 পরীক্ষা করেছি, যা D123 এর কাছে অবস্থিত। কিন্তু S1 হেলিক্সের অন্য দিকে (চিত্র 5b)।
আমরা 2GBI এবং GBTA দ্বারা E119A, D123A এবং K125A চ্যানেলগুলির ঘনত্ব-নির্ভর বাধা পরিমাপ করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে E119A এবং K125A মিউটেশনগুলি বন্য ধরণের (p > 0.05, Fig 5d) তুলনায় উভয় ইনহিবিটরের হিল সহগকে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করেনি। ) অন্যদিকে, মিউটেশন D123A GBTA (p 0.05/14)।
যেহেতু উভয় সাবইউনিটের অবস্থান 123-এ চার্জকে নিরপেক্ষ করার ফলে GBTA বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটিতে একটি শক্তিশালী পরিবর্তন হয়েছে, যখন উভয় সাবইউনিটে চার্জকে বিপরীত করার সময় শুধুমাত্র একটি ছোট প্রভাব ছিল, আমরা চার্জের বিপরীত চ্যানেলের সাথে শুধুমাত্র একটি সাবইউনিট অন্তর্ভুক্ত করার জন্য বিশ্লেষণকে প্রসারিত করেছি। C-টার্মিনাল সাবইউনিটে D123R প্রতিস্থাপনের সাথে Hv1-সংযুক্ত ডাইমার তৈরি করেছে (চিত্র 5b) এবং GBTA এবং 2GBI দ্বারা ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া নিষেধ পরিমাপ করেছে। আমরা দেখতে পেয়েছি যে WT-D123R চ্যানেলের তুলনায় GBTA-এর হিল সহগ উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি। বন্য ধরনের Hv1 (p আমরা আরও দেখতে পেলাম যে D112E মিউটেশন WT-D123R ব্যাকগ্রাউন্ড (চিত্র 5b,h এবং পরিপূরক চিত্র 4) দ্বারা উত্পাদিত GBTA-বাইন্ডিং হিল কোফিসিয়েন্টের বৃদ্ধিকে রহিত করেছে। 2GBI বাইন্ডিংয়ের হিল সহগের উপর প্রভাবও বাদ দেওয়া হয়েছিল ( চিত্র। 5h এবং পরিপূরক চিত্র। 3)। এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে অবস্থান 123-এ বিপরীত চার্জের কারণে সাবইউনিটের মধ্যে উন্নত অ্যালোস্টেরিক কাপলিং যখন D112 অবস্থানে বাইন্ডিং সাইটটি বিরক্ত হয় তখন শক্তিশালী বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটিতে অনুবাদ করে না।
আমরা যুক্তি দিয়েছিলাম যে যদি সংলগ্ন খোলা সাবুনিটের D123 অবশিষ্টাংশগুলি একে অপরের সাথে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিকভাবে ইন্টারঅ্যাক্ট করার জন্য যথেষ্ট কাছাকাছি থাকে, তাহলে নেতিবাচক চার্জগুলির মধ্যে বিকর্ষণমূলক মিথস্ক্রিয়াটি অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের আরজিনিনে প্রতিস্থাপনের মাধ্যমে নেতিবাচক এবং ধনাত্মক চার্জের সংমিশ্রণে রূপান্তরিত হবে। তাদের মধ্যে আকর্ষণীয় মিথস্ক্রিয়া।একটি সাবইউনিট (WT-D123R dimer)।আকর্ষণীয় মিথস্ক্রিয়া S1 খণ্ডের বাইরের প্রান্তের মধ্যে ইন্টারফেসকে শক্তিশালী করতে পারে, যার ফলে সাবইউনিটের মধ্যে শক্তিশালী অ্যালোস্টেরিক কাপলিং হয় এবং GBTA- বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটি বৃদ্ধি পায়।
এই অনুমানটিকে সমর্থন করার জন্য, আমরা S1 সেগমেন্টের বাইরের প্রান্তগুলির মধ্যে ইন্টারফেসকে শক্তিশালী করার একটি উপায় খুঁজছিলাম, যা 123 অবস্থানে চার্জ স্যুইচিং থেকে আলাদা। লি এট আল। Hv1 অবশিষ্টাংশ I127 থেকে সিস্টাইনের মিউটেশন আগে পাওয়া গিয়েছিল। স্বতঃস্ফূর্ত ইন্টারসুবুনিট ক্রস-লিংকিং17 এর ফলে। উপরন্তু, Hv1-CiVSP chimeric VSD-এর স্ফটিক কাঠামো নির্দেশ করে যে I127 শুধুমাত্র একটি অবশিষ্টাংশ দ্বারা S1 হেলিক্সের বাইরের প্রান্ত থেকে পৃথক করা হয়েছে24। তাই আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে এর মধ্যে একটি সমযোজী বন্ধন গঠন করা হয়েছে কিনা। 127 অবস্থানে থাকা সিস্টাইনগুলি, যার ফলে একটি শক্তিশালী S1-S1 মিথস্ক্রিয়া হবে বলে আশা করা হচ্ছে, 123 অবস্থানে চার্জ পরিবর্তন করে পর্যবেক্ষণ করা GBTA বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটির উপর প্রভাব ফেলে।
আমরা 10 মিমি β-mercaptoethanol (βME) (চিত্র 6a) এর উপস্থিতি এবং অনুপস্থিতিতে GBTA এবং 2GBI দ্বারা Hv1 I127C এর ঘনত্ব-নির্ভর বাধা পরিমাপ করেছি। একই সময়ে ইনহিবিটরকে অন্তঃকোষীয় দ্রবণে যুক্ত করা হয়, হ্রাস করে। এক্সট্রা সেলুলার দ্রবণে এজেন্ট যোগ করা হয়। শুধুমাত্র একটি সাবইউনিটে (WT-I127C) সিস্টাইন প্রতিস্থাপনের সাথে একটি লিঙ্কযুক্ত ডাইমার একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 6a)। আমরা স্বতঃস্ফূর্ত ইন্টারসাবুনিট ক্রস-লিঙ্কিংয়ের কোনো প্রভাব পরিমাপ করতে পারিনি। 2GBI নিষেধাজ্ঞার I127C সাবইউনিটের মধ্যে, কারণ βME সহ বা ছাড়া Hv1-এর সাথে I127C আবদ্ধ হওয়ার হিল সহগ, মনোসিস্টাইন প্রতিস্থাপিত ডাইমারের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য তার থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল। পার্বত্য সহগ WT-I127C (চিত্র 6b এবং পরিপূরক চিত্র 3) পার্থক্য করতে পারেনি। সম্পূর্ণ বিপরীতে, আমরা GBTA নিষেধাজ্ঞার উপর স্বতঃস্ফূর্ত ইন্টারসুবুনিট ক্রসলিংকের নাটকীয় প্রভাব পরিমাপ করেছি। abs-এর Hv1 I127C-এর সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য হিল সহগ। (ক্রসলিংক চালু) βME (ক্রসলিংক বন্ধ) উপস্থিতিতে পরিমাপ করা বা ডাইমার লিঙ্ক করতে WT-127C ব্যবহার করে (ক্রসলিংকের অনুপস্থিতিতে) (চিত্র 6c এবং পরিপূরক চিত্র 4) এর চেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল, যা নির্দেশ করে যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিং S1 খণ্ডের বাইরের প্রান্তের মধ্যে ডাইসলফাইড বন্ড গঠনের মাধ্যমে বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে ব্যাপকভাবে বৃদ্ধি পায়। এই ফলাফলগুলি আমাদের ব্যাখ্যাকে সমর্থন করে যে WT-D123R ডাইমারে 123 অবস্থানে অ্যাসপার্টেট এবং আরজিনিনের আকর্ষণীয় ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া ফলে অ্যালোস্টেরিক কাপলিং বৃদ্ধি পায়। সাবইউনিট
ওপেন-স্টেট কাপলিং দুটি সাবইউনিটে S1 সেগমেন্টের বাইরের প্রান্তের মধ্যে সরাসরি শারীরিক মিথস্ক্রিয়া দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়।
(a) মিউট্যান্ট Hv1 ডাইমার এবং লিঙ্কার ডাইমারগুলির পরিকল্পিত উপস্থাপনা, কীভাবে ইন্টারসাবুনিট সিস্টাইন ক্রসলিংকগুলি জিবিটিএ বাইন্ডিং সহযোগিতাকে প্রভাবিত করে তা তদন্ত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। (বিডি) 2GBI (b,d) এবং GBTA (c, e) বহিরাগত দ্রবণে 10 mM βME এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে। প্রতিটি বিন্দু 3 থেকে 10 পরিমাপের গড় বাধা ± SD প্রতিনিধিত্ব করে। বক্ররেখাটি ছিল একটি হিল ফিট যা Kd মান প্রাপ্তির জন্য ব্যবহৃত হয় (পরিপূরক সারণী 1 দেখুন)। ইনসেট হিস্টোগ্রামে হিল কোফিসিয়েন্টগুলি পরিপূরক ডুমুর 3 এবং 4-এ রিপোর্ট করা ফিটগুলি থেকে নির্ধারণ করা হয়েছিল। (c,e) এস্টারিক্স পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে। বিভিন্ন GBTA নিষেধাজ্ঞার অবস্থার মধ্যে (p 0.05)।
আমরা আরও দেখতে পেলাম যে βME এর অনুপস্থিতিতে, D112E I127C Hv1 ডাইমারের সাথে GBTA আবদ্ধ হওয়ার হিল সহগ হ্রাসকারী এজেন্ট (চিত্র 6e এবং পরিপূরক চিত্র 4) এর উপস্থিতিতে পরিমাপ করা তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল, যা বোঝায় যে D112E মিউটেশন সিস্টাইন 127 এর ক্রস-লিঙ্কিংয়ের ফলে জিবিটিএ বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটি বৃদ্ধিকে বাতিল করেনি। D112E, I127C Hv1 ডাইমারের সাথে 2GBI বাঁধার হিল কোফিসিয়েন্টও D112E মিউটেশন (চিত্র 1) দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত হয়নি (চিত্র 1)6d এবং পরিপূরক। চিত্র 3)।
একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে GBTA বাইন্ডিং আকর্ষণীয় ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া বা প্রতিস্থাপিত সিস্টাইনগুলির মধ্যে সমযোজী বন্ধন গঠনের মাধ্যমে সংলগ্ন Hv1 সাবইউনিটগুলির বাইরের প্রান্তগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া দ্বারা বাড়ানো হয় এবং সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিং বৃদ্ধি পায় এবং বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটি বাড়ে। যদিও সমবায়ের উপর আকর্ষণীয় ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রভাব মিউটেশন D112E দ্বারা বিলুপ্ত করা যেতে পারে, সমযোজী বন্ধনের প্রভাব তা পারে না।
এইচভি1 চ্যানেলে গুয়ানিডিন ডেরিভেটিভস বাঁধার জন্য উপলব্ধ রাসায়নিক স্থানের অনুসন্ধানে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে জিবিটিএ-র মতো 2-গুয়ানিডিনোথিয়াজোলগুলির 2-গুয়ানিডিনোবেনজিমিডাজোল (চিত্র 1c) এর চেয়ে বেশি ঘনত্ব নির্ভরতা রয়েছে। জিবিটিএ উভয়ের মধ্যে পার্বত্য সহগ বিশ্লেষণ। এবং মনোমেরিক চ্যানেল (চিত্র 2a,b) এবং ডাইমেরিক চ্যানেলে যেখানে একটি সাবইউনিট ইনহিবিটরের সাথে প্রাক-আবদ্ধ ছিল (চিত্র 4) আমাদের এই উপসংহারে পৌঁছেছে যে GBTA দ্বারা Hv1-এর বাধা ক্রিয়াটি একটি সমন্বয়মূলক প্রক্রিয়া, এবং দুটি সাবইউনিটের যৌগগুলির বাঁধাই সাইটগুলি অ্যালোস্টেরিকভাবে মিলিত হয়৷ যে আবিষ্কারটি GBTA খোলা চ্যানেলের সাথে আবদ্ধ হয়, যেমনটি পূর্বে সম্পর্কিত যৌগ 2GBI32 এর জন্য দেখানো হয়েছে, পরামর্শ দেয় যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংকে বিশেষভাবে খোলা অবস্থায় মূল্যায়ন করা যেতে পারে৷ আমাদের সমবায় বাঁধাই মডেল GBTA (চিত্র 2c) দ্বারা Hv1-এর বাধাকে পরিমাণগতভাবে বর্ণনা করতে সক্ষম হয়েছিল এবং ঝিল্লি পুনরুদ্ধারকরণের পরে চ্যানেল টেইল স্রোতের ক্ষয়ে 2GBI এবং GBTA-এর বিভিন্ন প্রভাব ব্যাখ্যা করতে পেরেছিল, যা বাঁধাই প্রক্রিয়ার আমাদের ব্যাখ্যাকে সমর্থন করে।
দুটি বাইন্ডিং সাইট (যেমন Hv1) সহ একটি অ্যালোস্টেরিক প্রোটিনে সর্বাধিক পার্বত্য সহগ অর্জন করা যায় 2. আমরা 1.31 সহগ সহ Hv1 ওয়াইল্ড-টাইপ আবদ্ধ করতে GBTA পরিমাপ করেছি, যা Hv1 I127C-তে বেড়ে 1.88 হয়েছে। সিনারজিস্টিক মুক্ত শক্তি, সর্বনিম্ন এবং সর্বোচ্চ অ্যাফিনিটি সাইটগুলির বাইন্ডিং মুক্ত শক্তির মধ্যে পার্থক্য (পদ্ধতিগুলি দেখুন), Hv1 ওয়াইল্ড-টাইপের ক্ষেত্রে 1.3 kcal/mole এবং Hv1 I127C-এর ক্ষেত্রে 2.7 kcal/মোল। বাঁধাই অক্সিজেন থেকে হিমোগ্লোবিন হল সহযোগিতামূলক প্রক্রিয়ার সবচেয়ে বিখ্যাত এবং ভালভাবে অধ্যয়ন করা উদাহরণ38. মানুষের হিমোগ্লোবিনের জন্য (একটি টেট্রামার যার চারটি অ্যালোস্টেরিকালি সংযুক্ত বাইন্ডিং সাইট রয়েছে), পার্বত্য সহগ 2.5-3.0 এর মধ্যে, যার মান 1.26 থেকে 3.64 পর্যন্ত kcal/mol, পরীক্ষামূলক অবস্থার উপর নির্ভর করে38. সুতরাং, গ্লোবাল এনার্জেটিক্সের পরিপ্রেক্ষিতে, Hv1 এর সাথে GBTA বাইন্ডিং এর সহযোগীতা যখন দুটি সিস্টেমে প্রোটিন সাবুনিটের বিভিন্ন সংখ্যা বিবেচনা করা হয় তখন হিমোগ্লোবিনের সাথে O2 আবদ্ধ হওয়ার থেকে যথেষ্ট আলাদা নয়।
আমাদের সিনার্জি মডেলে, একটি সাবইউনিটে জিবিটিএ অণুর আবদ্ধ হওয়ার ফলে সংলগ্ন সাবইউনিটের বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি বৃদ্ধি পায়। আমরা এমন একটি প্রক্রিয়া কল্পনা করি যেখানে প্রথম বাঁধাই ইভেন্টের ফলে বাঁধাই পরিবেশের পুনর্বিন্যাস (ইনডিউসড ফিট) হয়। সাবইউনিটগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়ায় পরিবর্তনগুলি৷ এই পরিবর্তনগুলির প্রতিক্রিয়া হিসাবে, সংলগ্ন সাবইউনিটগুলি তাদের বাইন্ডিং সাইটগুলিকে পরিবর্তন করে, যার ফলে GBTA বাইন্ডিং আরও শক্ত হয়৷ এই প্রক্রিয়া চলাকালীন, S1 aspartate D112 বর্ধিত বাইন্ডিং অ্যাফিনিটির সাথে যুক্ত বাঁধাই সাইটের পুনর্বিন্যাসের জন্য দায়ী৷ D112 পূর্বে Hv1 প্রোটন পারমিয়েশন পাথওয়ের অংশ এবং নির্বাচনী ফিল্টার 27,28 হিসাবে কাজ করার জন্য দেখানো হয়েছিল। আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে দুটি Hv1 সাবইউনিটের সিলেক্টিভিটি ফিল্টারগুলি খোলা অবস্থায় অ্যালোস্টেরিকভাবে সংযুক্ত করা হয়েছে৷ চিত্র 7a GBTA বাঁধাই সাইটের আনুমানিক অবস্থান এবং Hv1 VSD ভিত্তিক একটি পরিকল্পনায় D112, D123, K125 এবং I127 অবশিষ্টাংশের অবস্থান দেখায়৷ Hv1-CiVSP chimera-এর স্ফটিক কাঠামোতে। S1-এর বহির্কোষী প্রান্ত জড়িত অ্যালোস্টেরিক কাপলিংয়ের জন্য প্রস্তাবিত দিকনির্দেশগুলি কালো তীর দিয়ে দেখানো হয়েছে।
(a) Hv1 VSD-এর পরিকল্পিত। Hv1-CiVSP কাইমেরার স্ফটিক কাঠামোর উপর ভিত্তি করে, হেলিকাল সেগমেন্টগুলিকে নলাকার হিসাবে দেখানো হয়েছে। এই কনফিগারেশনে, S4 সেগমেন্টের ভিতরের প্রান্তটি CCD-এর সাথে মিশে যায় (দেখানো হয়নি)। আবদ্ধ GBTA এর পূর্বাভাসিত অবস্থানগুলিকে ধূসর ডিম্বাকৃতি হিসাবে দেখানো হয়েছে৷ কালো তীরগুলি দুটি সন্নিহিত সাবইউনিটে বাঁধাই সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংয়ে জড়িত পথগুলি নির্দেশ করে৷ তদন্তকৃত S1 অবশিষ্টাংশগুলির অবস্থানগুলি রঙিন গোলক দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে৷ (b) Hv1 সাবইউনিটগুলির পরিকল্পিত চিত্র দুটি ভিন্ন ডাইমার কনফিগারেশনে যেমন মেমব্রেন প্লেনের বহির্কোষী দিক থেকে দেখা যায়। বাম প্যানেলে, ডাইমার ইন্টারফেসটি S4 হেলিক্স দ্বারা গঠিত হয়। ঝিল্লি সমতলে লম্ব একটি অক্ষের চারপাশে ঘড়ির কাঁটার দিকে দুটি VSD 20 ডিগ্রি ঘূর্ণন, এর সাথে দুটি S4 হেলিস (ড্যাশড তীর) এর বাইরের প্রান্তের বিভাজন ডানদিকে দেখানো বিন্যাস তৈরি করে৷ এই কনফিগারেশনে, সন্নিহিত সাবুনিটগুলির অবশিষ্টাংশ D123 এবং I127 একসাথে কাছাকাছি আসতে দেওয়া হয়৷ (c) CiVSP VSD এর পরিকল্পিত উপস্থাপনা 4G80 ক্রিস্টাল স্ট্রাকচারে পাওয়া ডাইমার কনফিগারেশনে। সিভিএসপি-তে অবস্থান P140 Hv1-এ অবস্থান D123-এর সাথে মিলে যায়।
আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে অবশিষ্টাংশ 123 (123D/123D বা 123R/123R) এর মধ্যে বিকর্ষণমূলক ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া খোলা অবস্থায় জিবিটিএ-বাইন্ডিং কোঅপারেটিভিটির একটি "স্বাভাবিক" স্তরের সাথে যুক্ত এবং মিথস্ক্রিয়াকে বিকর্ষণ থেকে আকর্ষণে স্থানান্তরিত করে (123D/123R) , বর্ধিত সহযোগিতা (চিত্র 5g)। এটা প্রত্যাশিত যে অ্যালানাইন প্রতিস্থাপনের সাথে বিকর্ষণমূলক মিথস্ক্রিয়া অপসারণও সহযোগিতা বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করবে। যাইহোক, 123A/123A ডাইমারের সহযোগিতায় হ্রাস লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র 5e)।একটি সম্ভব। ব্যাখ্যা হল যে হাইড্রোফিলিক পরিবেশে হাইড্রোফোবিক অবশিষ্টাংশ রাখার অস্থিতিশীল প্রভাব D123 অবশিষ্টাংশগুলির মধ্যে বিকর্ষণমূলক মিথস্ক্রিয়া দূর করার কারণে স্থিতিশীল প্রভাবকে ছাড়িয়ে যেতে পারে, যার ফলে বাধ্যতামূলক সহযোগিতার সামগ্রিক হ্রাস ঘটে। মনি এট আল.39 সম্প্রতি রিপোর্ট করেছে যে দ্রাবক অ্যাক্সেসযোগ্যতা Ciona gutis Ci-Hv1-এর D171 অবস্থান (মানুষের Hv1-এ D123-এর অনুরূপ) সক্রিয়করণের পরে বৃদ্ধি করা হয়, এই ধারণাটিকে সমর্থন করে যে D123 উন্মুক্ত অবস্থায় একটি হাইড্রোফিলিক পরিবেশে অবস্থিত।
Hv1 চ্যানেলের গেটিং একাধিক ট্রানজিশনের মাধ্যমে ঘটে বলে জানা যায় 19,20,26,39,40,41. Qiu et al26 পাওয়া গেছে যে মেমব্রেন ডিপোলারাইজেশনের সময়, Ci-Hv1-এর ভোল্টেজ সেন্সর একটি গঠনমূলক পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে যায় যা চ্যানেলটিকে সক্রিয় করে তবে বন্ধ করে দেয়। , একটি স্বতন্ত্র রূপান্তর দ্বারা অনুসরণ করা হয় যা উভয় সাবইউনিট পাথে প্রোটনকে পরিবাহিত করে। ভোল্টেজ সেন্সরের গঠনগত পরিবর্তন ভোল্টেজ-ক্ল্যাম্প ফ্লুরোসেন্স দ্বারা নিরীক্ষণ করা হয়েছিল এবং এটি পাওয়া গেছে যে দ্বিতীয় রূপান্তরটি D171 অবস্থানে মিউটেশনের দ্বারা নির্বাচিতভাবে বিরক্ত হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যালের বিক্ষিপ্ততা কনফরমেশনাল পরিবর্তনের প্রতিক্রিয়া স্থানাঙ্ক বরাবর সংলগ্ন সাবুনিটের D171 অবশিষ্টাংশের মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়াগুলির উপস্থিতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এই ব্যাখ্যাটি আমাদের অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে D123 অবশিষ্টাংশগুলি উন্মুক্ত অবস্থায় ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিকভাবে মিথস্ক্রিয়া করে। এবং জিবিটিএ বাইন্ডিং সাইটগুলির মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংকে মধ্যস্থতা করে।
ফুজিওয়ারা এট আল25 প্রস্তাব করেছেন যে সাইটোপ্লাজমিক কয়েলড-কয়েল ডোমেনের ডাইমার ইন্টারফেস দুটি S4 হেলিস (চিত্র 7b, বাম প্যানেল) ধারণ করার জন্য ঝিল্লির মধ্যে প্রসারিত হয়। S4 হেলিক্স এবং CCD-এর সাথে সংযোগকারী অঞ্চলের সম্পূর্ণ VSD এবং কার্যকরী বিশ্লেষণ। ট্রান্সমেমব্রেন পিএইচ গ্রেডিয়েন্টের অনুপস্থিতিতে, Hv1 চ্যানেলগুলি খোলার জন্য যথেষ্ট মেমব্রেন ডিপোলারাইজেশন প্রয়োজন, এবং চ্যানেলটি প্রধানত বন্ধ থাকে এমন পরিস্থিতিতে সিস্টাইন ক্রসলিংকিং ঘটে। অতএব, সনাক্ত করা S4-S4 ইন্টারফেস সম্ভবত অফ-স্টেট সাবইউনিট কনফিগারেশনকে প্রতিফলিত করে। অন্যান্য গবেষণায় গেটিং 17,21,26 এর সময় ইন্টারসাবনিট মিথস্ক্রিয়ায় S1 এবং S2 এর জড়িত থাকার প্রমাণ পাওয়া গেছে যা প্রস্তাব করে যে চ্যানেলগুলি খোলা অবস্থায় বিভিন্ন সাবুনিট কনফিগারেশন গ্রহণ করতে পারে। বদ্ধ রাজ্য, মনি এট আল-এর অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ একটি ধারণা। S1 গেটিং করার সময় 39 নড়ে।
এখানে, আমরা দেখাই যে, উন্মুক্ত অবস্থায়, S1 হেলিক্সের বহির্মুখী প্রান্তগুলি সরাসরি ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়াকে সমর্থন করার জন্য যথেষ্ট কাছাকাছি যা সাবইউনিটের মধ্যে অ্যালোস্টেরিক কাপলিংকে মধ্যস্থতা করে। বর্ধিত S4-S4 মিথস্ক্রিয়া সহ ডাইমার কনফিগারেশনে, S1 হেলিক্সগুলি অনেক দূরে। সরাসরি ইন্টারঅ্যাক্ট করার জন্য একে অপরের থেকে আলাদা। তবে, ঝিল্লি সমতলে লম্ব একটি অক্ষের চারপাশে দুটি ভিএসডি সাবইউনিটের ঘড়ির কাঁটার দিকে 20° ঘূর্ণন, দুটি S4 হেলিসের বাইরের প্রান্তের বিভাজনের সাথে মিলিত, একটি S1-S1 কনফিগারেশন সামঞ্জস্যপূর্ণ। আমাদের অনুসন্ধানের সাথে (চিত্র 7বি, ডান প্যানেল)। আমরা খোলা অবস্থায় চ্যানেলের জন্য এই কনফিগারেশনের সুপারিশ করি।
যদিও সিভিএসপি এনজাইমটি মনোমার হিসাবে কাজ করে বলে মনে করা হয়, তবে এর বিচ্ছিন্ন ভিএসডির স্ফটিক কাঠামোটি একটি ডাইমার অবস্থায় ধারণ করা হয়। এই ডাইমারের S1 হেলিসের বাইরের প্রান্তগুলি স্থানিকভাবে একত্রে কাছাকাছি থাকে এবং সামগ্রিক কনফিগারেশন প্রস্তাবিতটির মতোই। Hv1 (চিত্র 7c) এর জন্য। সিভিএসপি ডাইমারে, পার্শ্ববর্তী সাবইউনিটের নিকটতম অবশিষ্টাংশটি 140 অবস্থানে প্রোলাইন ছিল (চিত্র 7c)। মজার বিষয় হল, সিভিএসপি-তে P140 Hv1-এ D123 অবস্থানের সাথে মিলে যায়। Hv1-এর মধ্যে সাবইউনিট কনফিগারেশনের মিল। এবং সিভিএসপি ডাইমারগুলি পরামর্শ দেয় যে এই প্রোটিনের ভিএসডিগুলির একটি ইন্টারফেস তৈরি করার একটি অন্তর্নিহিত প্রবণতা রয়েছে যেখানে S1 এর বহির্মুখী প্রান্তগুলি মিথস্ক্রিয়া করে।
শুক্রাণু কোষ সক্রিয়করণে Hv1-এর অপরিহার্য ভূমিকা পুরুষের উর্বরতা নিয়ন্ত্রণের জন্য এই চ্যানেলটিকে একটি আকর্ষণীয় ওষুধের লক্ষ্যে পরিণত করে। উপরন্তু, মাইক্রোগ্লিয়াতে Hv1 সক্রিয়করণ ইস্কেমিক স্ট্রোক থেকে পুনরুদ্ধারকে আরও খারাপ করে দেখানো হয়েছে। উন্নত Hv1 কার্যকলাপ নিম্নের সাথে যুক্ত পাওয়া গেছে। স্তন 12 বা কোলোরেক্টাল ক্যান্সার 13 রোগীদের বেঁচে থাকা এবং বি-সেল ম্যালিগন্যান্সি 11-এ অবদান রাখে বলে মনে করা হয়। অতএব, Hv1 লক্ষ্য করে ছোট অণু ওষুধগুলি নিউরোপ্রোটেক্টিভ এজেন্ট বা অ্যান্টিক্যান্সার থেরাপিউটিকস হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। আবিষ্কার যে গুয়ানিডিনোথিয়াজোল ডেরিভেটিভগুলি পুনর্নির্মাণ করতে পারে। Hv1 সাবইউনিট খুলুন, যা বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে, Hv1 চ্যানেলগুলিকে লক্ষ্য করে আরও শক্তিশালী ওষুধের বিকাশ ঘটাতে পারে।
মানব Hv1-এর সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিস স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর কৌশলগুলি ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল৷ Hv1NCCiVSP নির্মাণে, Hv1-এর অবশিষ্টাংশ 1-96 এবং 228-273 CiVSP18-এর অবশিষ্টাংশ 1-113 এবং 240-576 দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল৷ Hv1- লিঙ্কযুক্ত একটি সাবইউনিটের সি-টার্মিনাস GGSGGSGGSGSGSGGSGG লিঙ্কারের মাধ্যমে দ্বিতীয় সাবইউনিটের এন-টার্মিনাসের সাথে যুক্ত। বিভিন্ন গঠন ধারণকারী pGEMHE প্লাজমিডগুলি Nhe1 বা Sph1 সীমাবদ্ধতা এনজাইম (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) দিয়ে রৈখিক করা হয়েছিল এবং আরএনএ সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। T7 mMessage mMachine ট্রান্সক্রিপশন কিট (Ambion)। ইলেক্ট্রোফিজিওলজিকাল পরিমাপের 1-3 দিন আগে, সিআরএনএ জেনোপাস oocytes (প্রতি কোষে 50 nl, 0.3-1.5 μg/μl) ইনজেক্ট করা হয়েছিল। Xenopus laevis (NASCO) থেকে স্টেজ V এবং VI oocytes পাওয়া গিয়েছিল। ইকোসাইট বায়োসায়েন্স থেকে। RNA ইনজেকশনের পর, কোষগুলি ND96 মাধ্যমে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল যার মধ্যে 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM পাইরুভেট, 100 μH amig2, 100 μH amig/8cml. .
2-গুয়ানিডিনো-বেনজিমিডাজল [1], 2-গুয়ানিডিনো-বেনজোথিয়াজোল [2], (4-মিথাইল-1,3-থিয়াজল-2-ইএল) গুয়ানিডিন [5], (5-ব্রোমো-4 -মিথাইল-1,3 -থিয়াজল-2-ইএল)গুয়ানিডিন) [6], ইথাইল 2-গুয়ানিডিনো-5-মিথাইল-1,3-থিয়াজোল-4-কারবক্সিলেট [8], ইথাইল 2-গুয়ানিডিনো-4- মিথাইল-1,3-থিয়াজোল- 5-কারবক্সিলেট [9] এবং (2-গুয়ানিডিনো-4-মিথাইল-1,3-থিয়াজল-5-ইএল) ইথাইল অ্যাসিটেট [10] সিগমা-অলড্রিচ থেকে ছিল। ফ্যামোটিডিন [7] এমপি বায়োমেডিকেলস থেকে ছিল।1-[4 -(4-ক্লোরোফেনাইল)-1,3-থিয়াজল-2-ইএল]গুয়ানিডিন[11] এবং 1-[4-(3,4-ডাইমেথোক্সিফেনাইল)-1,3- থিয়াজল-2-ইএল]গুয়ানিডিন [12] ছিল ম্যাট্রিক্স সায়েন্টিফিক থেকে। এই যৌগগুলি বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ সর্বোচ্চ বিশুদ্ধতার। এগুলিকে 100 মিমি স্টক দ্রবণ তৈরি করতে শুকনো DMSO-তে দ্রবীভূত করা হয়েছিল, যা তারপরে পছন্দসই চূড়ান্ত ঘনত্বে রেকর্ডিং দ্রবণে মিশ্রিত করা হয়েছিল। যৌগগুলি 3 এবং 4 নীচে সংশ্লেষিত হয়েছিল কমপক্ষে 99% বিশুদ্ধতা।
25 মিলি জলীয় হাইড্রোক্লোরিক অ্যাসিড (2.5 এন) এর মধ্যে 2-অ্যামিনো-4- (ট্রাইফ্লুরোমিথাইল) বেনজেনেথিওল হাইড্রোক্লোরাইড (1.02 গ্রাম, 4.5 মিমিওল) এর সাসপেনশনে কঠিন ডাইসিয়ানডিয়ামাইড (380 মিলিগ্রাম, 4.5 মিমিওল) যোগ করা হয়েছিল, এবং এর ফলে মিশ্রিত হেটারোক্লোরিক অ্যাসিড। 4 ঘন্টার জন্য জোরে জোরে নাড়া দিয়ে রিফ্লাক্স করা হয়েছিল। প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি ঘরের তাপমাত্রায় ঠাণ্ডা করা হয়েছিল এবং 10N পটাসিয়াম হাইড্রোক্সাইড ধীরে ধীরে যোগ করে নিরপেক্ষ করা হয়েছিল। গঠিত সাদা অবক্ষেপকে ফিল্টার করা হয়েছিল, ঠান্ডা জল (3 × 50 মিলি) দিয়ে ধুয়ে একটি চুলায় শুকানো হয়েছিল ( 65 °C) কয়েক ঘন্টার জন্য, এবং তারপর ইথাইল অ্যাসিটেট/পেট্রোলিয়াম ইথার থেকে একটি সাদা কঠিন (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (আলো 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (খুব বিস্তৃত s, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d) , 1 H, J = 8.1 Hz। 13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J) = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z গণনা করা মান। C9H8F3N4S (M +6 Hz) এর জন্য (M +6 1, 40 পাওয়া গেছে)। : 261.0419।
Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সংশ্লেষিত, একটি ছোট টেস্ট টিউবে তেল স্নানের মধ্যে 200 °C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করা হয়েছিল। 300 mg (বড় অতিরিক্ত) সায়ানামাইড এবং 1.0 মিলি কনক। গরম যৌগটিতে দ্রুত হাইড্রোক্লোরিক অ্যাসিড যোগ করা হয়েছিল এবং মিশ্রণটি প্রায় 2 মিনিটের জন্য তেলের স্নানে রাখা হয়েছিল, এই সময়ের মধ্যে বেশিরভাগ জল বাষ্পীভূত হয়ে যায়। প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি তারপর ঘরের তাপমাত্রায় ঠান্ডা হয় এবং এর ফলে উপাদান শক্ত হয়। ছোট ছোট টুকরো টুকরো টুকরো করে পানি দিয়ে ধুয়ে একটি ফ্যাকাশে হলুদ নিরাকার কঠিন।(38 মিলিগ্রাম, 10%) mp 246-250 °C 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz) , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz)।13C NMR (150) MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI) 0699 , পাওয়া গেছে: 243.0704।
প্রোটন স্রোতগুলি পিক্ল্যাম্প10 সফ্টওয়্যার সহ অ্যাক্সন ডিজিডাটা 1440A (আণবিক ডিভাইস) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত অ্যাক্সোপ্যাচ 200B অ্যামপ্লিফায়ার ব্যবহার করে বিভিন্ন গঠন প্রকাশ করে ওসাইটের অভ্যন্তরীণ এবং বাহ্যিক প্যাচগুলিতে পরিমাপ করা হয়েছিল৷ অন্তঃকোষীয় এবং বহির্কোষীয় সমাধানগুলির একই রচনা রয়েছে: )ইথেনেসালফোনিক অ্যাসিড (এমইএস), 30 মিমি টেট্রাইথাইলামোনিয়াম (টিইএ) মেসিলেট, 5 মিমি টিইএ ক্লোরাইড, 5 মিমি ইথিলিন গ্লাইকোল-বিস(2-অ্যামিনোইথাইল)-N,N,N',N'-টেট্রাসেটিক অ্যাসিড (EGTA), সামঞ্জস্য করা হয়েছে টিইএ হাইড্রক্সাইডের সাথে pH 6.0। সমস্ত পরিমাপ 22 ± 2 °C এ সঞ্চালিত হয়েছিল। পাইপেটের 1.5-4 MΩ এর অ্যাক্সেস প্রতিরোধ ক্ষমতা রয়েছে। বর্তমান ট্রেসগুলি 1 kHz এ ফিল্টার করা হয়েছিল, 5 kHz এ নমুনা করা হয়েছিল এবং ক্ল্যাম্পফিট 10.2 ডিভাইসের সাহায্যে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ) এবং Origin8.1 (OriginLab)।
Hv1 ইনহিবিটরের বিভিন্ন ঘনত্ব এবং কিছু ক্ষেত্রে 10 mM βME সমন্বিত সলিউশনগুলি একটি VC-6 পারফিউশন ভালভ সিস্টেম (ওয়ার্নার ইনস্ট্র.) এর সাথে সংযুক্ত একটি বহুগুণ মাধ্যমে মাধ্যাকর্ষণ দ্বারা স্নানের মধ্যে প্রবর্তন করা হয়েছিল, যা pClamp সফ্টওয়্যার TTL (Tranzistor-) এর মাধ্যমে পাস করা হয়েছিল। ট্রানজিস্টর লজিক) সংকেত। দ্রুত পারফিউশন পরীক্ষাগুলি একটি মাল্টি-টিউব পারফিউশন পেন্সিল (অটোমেট বিজ্ঞান) ব্যবহার করে একটি প্যাচ পাইপেটের সামনে মাউন্ট করা একটি 360 μm ব্যাসের ডেলিভারি টিপ ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। চ্যানেল ইনহিবিশনটি আইসোক্রোনাল অ্যাম্পেরোমেট্রিক পরিমাপের শেষে নির্ধারিত হয়েছিল। +120 mV ডিপোলারাইজিং পালস। GV পরিমাপ পূর্বে বর্ণিত 18,20 অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল। -20 mV থেকে +120 mV পর্যন্ত বিভিন্ন ভোল্টেজে ডিপোলারাইজেশন ধাপের পর টেল স্রোত -40 mV এ রেকর্ড করা হয়েছিল যদি না অন্যথায় বলা হয়। পরীক্ষার পালসের আগের রেফারেন্স পালস বর্তমান ক্ষয় 18 সংশোধন করতে ব্যবহৃত হয়। GV গ্রাফ বোল্টজম্যান সমীকরণের সাথে খাপ খায়:
চ্যানেল এবং ইনহিবিটর (পরিপূরক সারণী 1) এর বিভিন্ন সংমিশ্রণের জন্য আপাত বিচ্ছিন্নতা ধ্রুবক (Kd) হিল সমীকরণের সাথে বাধার ঘনত্ব নির্ভরতা (মানে % নিষেধ মান) ফিট করে নির্ধারিত হয়েছিল:
যেখানে [I] ইনহিবিটর I এর ঘনত্ব এবং h হল পার্বত্য সহগ৷ হিল সহগ গণনা করতে, সমীকরণ (2) এইভাবে পুনর্বিন্যাস করা হয়েছে:
পোস্টের সময়: জুন-০৭-২০২২
