Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-brawżer li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew itfi l-mod ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex tiżgura appoġġ kontinwu, aħna se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Il-kanal tal-proton vultaġġ Hv1 huwa kumpless dimeriku li jikkonsisti f'żewġ oqsma ta 'sensing ta' vultaġġ (VSDs), li kull wieħed minnhom fih passaġġ ta 'permeazzjoni tal-proton gated. Id-dimerizzazzjoni hija kkontrollata mid-dominju ċitoplasmiku tal-coiled-coil. It-tranżizzjoni mill-istat magħluq għal l-istat miftuħ fiż-żewġ VSDs huwa magħruf li jseħħ b'mod kooperattiv; madankollu, ftit hu magħruf dwar il-mekkaniżmi sottostanti. L-interfaces bejn is-subunità għandhom rwol ewlieni fil-proċessi allosteriċi; madankollu, tali interfaces ma ġewx identifikati f'kanali Hv1 miftuħa. Hawnhekk nuru li d-derivattivi 2-guanidinothiazole jimblukkaw żewġ VSDs Hv1 b'mod kooperattiv u jużaw wieħed minn dawn il-komposti bħala sonda għall-akkoppjar allosteriku bejn subunitajiet miftuħa. Sibna li l-extraċellulari tmiem l-ewwel framment transmembrana ta 'VSD jifforma interface intersubunit li jimmedja l-igganċjar bejn is-siti ta' rbit, filwaqt li d-dominju tal-coiled-coil mhuwiex direttament involut f'dan il-proċess. Sibna wkoll evidenza qawwija li l-filtru selettiv tal-protoni tal-kanal jikkontrolla l-kooperattività li torbot l-imblokkatur. .
Il-kanali tal-protoni li jaħdmu bil-vultaġġ għandhom rwoli importanti f'varjetà ta' organiżmi, mill-fitoplankton sal-bnedmin1.Fil-biċċa l-kbira taċ-ċelloli, dawn il-kanali jimmedjaw l-effluss tal-protoni mill-membrana tal-protoni u jirregolaw l-attività ta' NADPH oxidase. huwa Hv1, li huwa l-prodott tal-ġene HVCN12,3.Hv1 (magħruf ukoll bħala VSOP) intwera li għandu rwol fil-proliferazzjoni taċ-ċelluli B4, produzzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv mis-sistema immuni intrinsika5,6,7,8, ċellula tal-isperma motilità9 u r-regolazzjoni tal-pH tal-fluwidu tal-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs10. Dan il-kanal huwa involut f'diversi Overexpressed f'tipi ta 'kanċer bħal tumuri malinni taċ-ċelluli B4,11 u kanċer tas-sider u tal-kolorektum12,13.Instabet attività eċċessiva Hv1 li żżid il-potenzjal metastatiku taċ-ċelloli tal-kanċer 11, 12 .Fil-moħħ, Hv1 huwa espress mill-mikroglia, u l-attività tagħha ntweriet li taggrava l-ħsara fil-moħħ f'mudelli ta 'puplesija iskemika.
Il-proteina Hv1 fiha dominju ta 'sensizzjoni ta' vultaġġ (VSD), li jikkonsisti f'erba 'segmenti transmembrane imsejħa S1 sa S414. Il-VSD tixbaħ id-dominji korrispondenti ta' kanali Na+, K+ u Ca2+ li jaħdmu bil-vultaġġ u fosfatasi sensittivi għall-vultaġġ, bħal CiVSP minn Ciona gutis15.F'dawn il-proteini l-oħra, it-terminal C ta 'S4 huwa mwaħħal ma' modulu effettur, id-dominju tal-pori jew enzima.F'Hv1, S4 huwa marbut mad-dominju tal-coiled-coil (CCD) li jinsab fuq in-naħa ċitoplasmika tal-membrana .Il-kanal huwa kumpless dimeriku li jikkonsisti f'żewġ VSDs, li kull wieħed fih passaġġ ta' permeazzjoni tal-protoni gated16,17,18.Dawn iż-żewġ subunitajiet Hv1 instabu li jiftħu b'mod koperattiv19,20,21,22, li jissuġġerixxi li l-akkoppjar allosteriku u l-interazzjonijiet bejn is-subunità jilagħbu rwol importanti fil-proċess tal-gating.L-interface bejn is-subunitajiet fi ħdan id-dominju tal-coiled coiled huwa definit tajjeb minħabba li l-istrutturi tal-kristall taż-żewġ oqsma iżolati huma disponibbli22,23.Min-naħa l-oħra, l-interface bejn VSDs fi ħdan il-membrana mhix mifhum tajjeb.L-istruttura tal-kristall tal-proteina kimerika Hv1-CiVSP ma tipprovdix informazzjoni dwar din l-interface, peress li l-organizzazzjoni trimerika tal-kumpless tal-kanal kristallizzat tista 'tirriżulta mis-sostituzzjoni tal-CCD Hv1 indiġeni biż-żippijiet tal-lewċina tal-ħmira GCN424.
Studju reċenti tal-organizzazzjoni tas-subunità tal-kanal Hv1 ikkonkluda li żewġ helices S4 tranżizzjoni fis-CCD mingħajr tfixkil serju tal-istruttura sekondarja, li jirriżulta f'helizes twal li jibdew mill-membrana u jipproġettaw fiċ-ċitoplasma. Ibbażat fuq analiżi ta 'crosslinking taċ-ċisteina, dan l-istudju jipproponi li l-VSDs Hv1 jikkuntattjaw lil xulxin tul is-segment S4. Madankollu, studji oħra pproponew interfaces alternattivi bejn VSDs. Dawn l-interfaces jinkludu s-segmenti S1 17, 21, 26 u t-truf ta 'barra tas-segment S2 21. Raġuni possibbli għall-konfliġġenti riżultati ta 'dawn l-istudji huwa li l-akkoppjar allosteriku bejn VSDs ġie eżaminat fir-rigward tal-proċess ta' gating, li jiddependi fuq l-istati magħluqa u miftuħa, u l-interface bejn VSDs tista 'tvarja f'bidliet ta' stat differenti fil-konformazzjoni.
Hawnhekk, sibna li 2-guanidinothiazole jinibixxi l-kanali Hv1 billi jorbot b'mod sinerġiku ma 'żewġ VSDs miftuħa, u uża wieħed mill-komposti, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), biex jistonda l-interazzjoni bejn is-subunitajiet fl-istat miftuħ. interface.Sibna li l-kurva tal-irbit tal-GBTA tista’ tiġi deskritta tajjeb minn mudell kwantitattiv li fih ir-rabta ta’ inibitur ma’ subunità waħda tirriżulta f’żieda fl-affinità tal-irbit tas-subunità ta’ ħdejn. Sibna wkoll li residwi D112, filtri ta’ selettività għall- kanal 27, 28 u parti mis-sit tal-irbit tad-derivattivi tal-guanidine 29 jikkontrollaw il-kooperattività tal-irbit tal-GBTA. Aħna nuru li l-irbit kooperattiv jinżamm fid-dimer Hv1, fejn is-CCD jissepara mis-segment S4, li jissuġġerixxi li l-interface intersubunit fil-CCD ma jagħmilx direttament jimmedja l-akkoppjar allosteriku bejn is-siti li jorbtu GBTA.B'kuntrast, insibu li l-framment S1 huwa parti mill-interface bejn is-subunitajiet u nipproponu arranġament ta 'VSDs adjaċenti bit-tarf extraċellulari tal-helix S4 'l bogħod miċ-ċentru tad-dimer biex jippermetti il-framment S1 ikun fl-istat miftuħ.
Inibituri ta 'molekula żgħar ta' Hv1 huma utli bħala mediċini kontra l-kanċer u aġenti newroprotettivi. Madankollu, sal-lum, ftit komposti setgħu jinibixxu l-kanal30,31,32,33.Fosthom, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, kompost [1] fil-Fig. 1a) u d-derivattivi tagħha nstabu li jimblukkaw VSD29,32 permeazzjoni ta 'protoni permezz tal-kanal. It-twaħħil ta' dawn il-komposti huwa maħsub li jseħħ b'mod indipendenti fiż-żewġ subunitajiet miftuħa.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, kompost [2] fil-Figura 1a) kien. preċedentement muri li jinibixxi Hv1 kważi b'mod effettiv daqs 2GBI meta ttestjat f'konċentrazzjoni ta '200 μM (Figura 1b). Aħna eżaminajna derivattivi oħra tat-thiazole u sibna li xi wħud minnhom inibixxu l-kanal b'qawwa simili jew akbar minn GBTA (Fig. 1 u Supplimentari) test).Iddeterminajna l-kurvi tar-rispons tal-konċentrazzjoni ta 'erba' derivattivi thiazole (GBTA u komposti [3], [6] u [11], Fig. 1c) u sibna li kienu aktar wieqaf minn dawk ta '2GBI.Il-koeffiċjenti ta' Hill (h) tad-derivattivi thiazole varjaw minn 1.109 ± 0.040 sa 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c u Supplimentari Fig. 1). B'kuntrast, il-koeffiċjent Hill għal 2GBI kien 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a u Supplementari Fig. 1).Koeffiċjent Hill 'il fuq minn 1 jindika kooperazzjoni vinkolanti. Minħabba li kull subunità Hv1 għandha l-inibitur tagħha stess- sit tal-irbit,29,32 aħna rraġunajna li l-irbit ta’ derivattiv thiazole ma’ subunità waħda jista’ jsaħħaħ it-twaħħil ta’ molekula ta’ inibitur ieħor mas-subunità ta’ ħdejn.GBTA kien il-kompost tat-test bl-ogħla koeffiċjent ta’ Hill.Għalhekk, għażilna dan il-kompost biex jistudja aktar il-mekkaniżmu ta 'sinerġija vinkolanti u uża 2GBI bħala kontroll negattiv ta' referenza.
(a) Komposti tat-test: [1] Inibitur ta' referenza Hv1 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidina, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Inibizzjoni tal-attività umana Hv1 mill-guanidinothiazoles indikati u l-kompost ta' referenza 2GBI (bars blu-aħdar) .Il-kurrenti tal-protoni Hv1 ġew imkejla fi plakki minn ġewwa ta 'ooċiti Xenopus bi tweġiba għal depolarizzazzjoni minn potenzjal ta' żamma ta '-80 mV sa + 120 mV. Kull inibitur ġie miżjud mal-banju f'konċentrazzjoni ta' 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Data hija medja±SEM (n≥4).(c) Inibizzjoni dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta' Hv1 uman minn komposti [2], [3], [6] u [11].Kull punt jirrappreżenta l-inibizzjoni medja ± SD ta' 3 sa 15-il kejl. Il-linja hija tajbin għall-għoljiet użati biex jinkisbu l-valuri Kd apparenti rrappurtati fit-Tabella Supplimentari 1. Il-koeffiċjenti tal-għoljiet ġew determinati mill-adattamenti rrapportati fil-Figura 1 Supplimentari: h(1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033, h (3) = 1.25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (ara Metodi).
(a,b) Il-komposti 2GBI u GBTA inibixxu Hv1 dimeriku u monomeriku b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni.Kull punt jirrappreżenta l-inibizzjoni medja ± SD ta' 3 sa 8 kejl u l-kurva hija fit-Tool ta' Hill.Il-koeffiċjenti ta' Hill (h) murija f' l-istogrammi inset ġew determinati mill-fits irrappurtati fil-Figuri Supplimentari 3 u 4. Ir-rispons tal-konċentrazzjoni tal-GBTA muri f'(a) huwa l-istess bħal dak f'Fig. 1c.Ara Tabella Supplimentari 1 għal valuri Kd apparenti. (c) Immudellar ta ' l-irbit kooperattiv ta 'GBTA għal Hv1 dimeriku.Il-linja sewda solida tirrappreżenta l-adattament għad-dejta sperimentali bl-ekwazzjoni (6), li tiddeskrivi l-mudell ta' rbit muri f'(d).Il-linji b'sing ittikkettjati Sub 1 u Sub 2 jirrappreżentaw l-assoċjazzjoni bimolekulari -kurvi tal-ekwilibriju tad-dissoċjazzjoni tal-ewwel u t-tieni avvenimenti vinkolanti, rispettivament (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Dijagramma skematika tal-mekkaniżmu propost tal-blokk Hv1.Fil-każ ta’ GBTA, l-irbit ma’ subunità miftuħa waħda żżid l-affinità tas-subunità miftuħa ta’ ħdejn (Kd2 Il-kanali Hv1 jistgħu jiġu monomerizzati billi jissostitwixxu d-dominji ċitoplasmiċi N- u C-terminal tagħhom b'porzjonijiet korrispondenti tal-fosfatażi Ciona Intestinalis sensittiva għall-vultaġġ CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34.Kejjna d-dipendenza tal-konċentrazzjoni tal-inibizzjoni tal-Hv1 monomeriku minn GBTA u 2GBI qabbilhom ma 'dik ta' inibizzjoni tal-kanal dimeriku (tip selvaġġ) (Fig. 2a, b).Sibna li d-differenza fil-kooperattività li torbot bejn iż-żewġ komposti ġiet eliminata f'Hv1 monomeriku, li tappoġġja l-ispjegazzjoni li l-irbit GBTA ma 'subunità waħda żżid il- affinità tas-subunità l-oħra għall-inibitur. Aħna rraġunajna li l-irbit tal-GBTA ma’ subunità waħda Hv1 jista’ jwassal għal arranġament mill-ġdid tas-sit tal-irbit (li jinduċi fit35), li jikkawża r-riarranġament tas-sit tal-irbit vakanti tas-subunità ta’ maġenb, li jwassal għal żieda fit-twaħħil. affinità.
Biex niddeskrivu b'mod kwantitattiv ir-rabta kooperattiva ta 'GBTA mal-kanal, użajna mudell li fih kwalunkwe subunità tista' torbot l-ewwel molekula inibitur wara reazzjoni bimolekulari b'kostanti ta 'dissoċjazzjoni Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO + B ⇆ BO * ). L-irbit jikkawża li l-kanal jadotta stat li fih is-subunitajiet vojta li jifdal jingħaqdu mal-inibitur wara reazzjoni bimolekulari unika b'kostanti ta' dissoċjazzjoni Kd2, fejn Kd2 Il-linja sewda solida fil-Figura 2c hija t-twaħħil tal-ekwazzjoni tal-mudell mal-kurva sperimentali tal-konċentrazzjoni-rispons, li tagħti Kd1 ta '~290 μM u Kd2 ta' ~ 29 μM (sezzjoni Metodi, ekwazzjoni (6)). Il-mudell jiddeskrivi wkoll l-irbit ta' 2GBI, fejn Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d).F'Hv1 monomeriku, hemm sit ta' rbit wieħed biss u Kdm wieħed (O° + B ⇆ B°).Fil-każ ta' GBTA, Kdm huwa ta' madwar 54 μM, li huwa aktar simili għal Kd1 milli Kd2 (Fig. 2d).Fi kliem ieħor, is-sit ta 'l-irbit tal-monomeru huwa f'konfigurazzjoni (O °) aktar simili għall-istat ta' affinità għolja (BO *) mill-baxx- stat ta 'affinità (OO) tad-dimer, x'aktarx minħabba l-eliminazzjoni tal-interface bejn is-subunitajiet.
Kif muri qabel għal 2GBI32, sibna li GBTA soppressa l-kurrenti Hv1 billi jimblokka l-kanal meta kien miftuħ aktar milli billi jagħmilha aktar diffiċli biex jinfetaħ (Figura Supplimentari 2a, b, d). bi tweġiba għar-ripolarizzazzjoni tal-membrana, iżda dan il-fenomenu ma kienx osservat f'GBTA (Figura Supplimentari 2c). Fil-preżenza ta 'inattivazzjoni Hv1 fil-preżenza ta' 2GBI, il-gradi f'kull subunità ma jistgħux jagħlqu sakemm l-imblokkatur iħalli s-sit ta 'l-irbit (il-" foot gate” mekkaniżmu), u 2GBI unbinds aktar bil-mod milli jingħalqu l-gradi.Jekk subunità waħda Hv1 tiġi żblokkata u magħluqa, filwaqt li s-subunità ta’ ħdejha tibqa’ mblukkata, it-twaħħil tal-molekuli 2GBI li jifdal isir aktar bil-mod (qbid imblokkatur).Speċi ta’ kanal b’ħajja twila subunità waħda biss imblukkata twettaq protoni temporanjament qabel ma tagħlaq u tagħti kontribut sinifikanti għall-kurrent tad-denb li jitmermer bil-mod.
Is-sejba li t-tħassir tal-kurrenti tad-denb Hv1 ma naqasx b'mod sinifikanti fil-preżenza ta 'GBTA (Fig. 2c Supplimentari) hija konsistenti ma' mekkaniżmu ta 'irbit sinerġistiku għal dan l-imblokkatur (Fig. 2d). Ladarba molekula GBTA ma tkunx marbuta mis-subunità Hv1 , l-affinità ta 'l-imblokkatur għas-subunità ta' ħdejn tinżel madwar 10 darbiet, u tiffavorixxi l-proċess ta 'unbinding.Dan ifisser li t-tieni molekula ta' GBTA għandha ċans ħafna ogħla li tiżvela qabel ma tinqabad fil-kanal. Speċi ta 'kanal ta' ħajja twila li jipproduċu subunità waħda biss imblukkar huma mistennija li jkunu ħafna aktar abbundanti fil-preżenza ta 'GBTA milli fil-preżenza ta' 2GBI, li jirriżulta fi tħassir tal-kurrent tad-denb aktar mgħaġġel.
Sabiex il-GBTA jorbot b'mod koperattiv maż-żewġ subunitajiet Hv1, is-siti tal-irbit għandhom ikunu akkoppjati allosterikament.Kull sit ta' rbit għandu jkun kapaċi: 1) jikkawża katina ta' avvenimenti li jikkomunikaw ma' subunitajiet ta' ħdejn xulxin marbuta mal-inibitur, u 2) jimmedjaw il- transizzjoni minn rbit b'affinità baxxa għal affinità għolja. Aħna rraġunajna li jekk residwi speċifiċi fi ħdan is-sit ta 'l-irbit ikkontribwew għall-proċess kooperattiv, il-mutazzjoni tagħhom għandha tbiddel il-koeffiċjent Hill tal-kurva ta' konċentrazzjoni-rispons ta 'inibizzjoni GBTA ta' Hv1.Residues D112, F150 , S181 u R211 preċedentement intwerew li huma parti mill-ambjent li jorbot 2GBI29 u aħna ipoteżijna li huma bl-istess mod ikunu involuti fl-irbit tal-GBTA (Fig. 3A). Aħna kejlu kurvi inibitorji ta 'konċentrazzjoni-rispons ta' GBTA għal kanali mutanti D112E, F150A, S181A. , u R211S (Figura 3) u qabblu l-koeffiċjenti ta' Hill tagħhom ma' dawk ta' tip selvaġġ Hv1, billi użaw 2GBI bħala referenza. Ir-residwu V109 jinsab fuq l-istess wiċċ tas-segment S1 bħal D112 u għandu dawra waħda helical żejda ġewwa ċ-ċellula. V109 ma kienx involut fl-irbit ta '2GBI29, użajna l-mutant V109A bħala kontroll (Fig. 3b).
(a) Residwi Hv1 suġġeriti involuti fit-twaħħil tad-derivattivi tal-guanidine. Kurvi blu b'sikket jdawru ktajjen tal-ġenb proposti qabel li jinteraġixxu ma 'partijiet differenti tal-kompost 2GBI29. (bf) Inibizzjoni dipendenti fuq il-konċentrazzjoni tal-mutanti Hv1 indikati minn komposti 2GBI (cyan) u GBTA ( aħmar skur).Kull punt jirrappreżenta l-inibizzjoni medja ta '3 sa 12-il kejl ± SD V109 bħala kontroll negattiv. Il-kurvi huma Hill fits użati biex jinkisbu valuri Kd apparenti (ara Tabella Supplimentari 1). Il-koeffiċjenti Hill (h) murija f' l-istogrammi daħla ġew determinati mill-adattamenti rrappurtati fil-Fig Supplimentari 3 u 4.Il-valuri ta’ referenza h għal Hv1 WT huma murija bħala linji mdawra. L-asterisks jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn il-passaġġi mutanti u WT (p Sibna li l-mutazzjoni D112E naqqset b'mod sinifikanti l-koeffiċjent Hill (p Is-sejba li l-koeffiċjent Hill għall-irbit tal-GBTA huwa ogħla minn 1 fid-dimer Hv1 u jsir ~ 1 fil-kanal monomeriku (Fig. 2b) hija konsistenti mal-eżistenza ta 'interazzjonijiet allosteriċi bejn is-siti tal-irbit fiż-żewġ subunitajiet.Jekk dan huwa il-każ, il-koeffiċjent Hill ta 'GBTA li jorbot mad-dimer li miegħu l-imblokkatur ingħaqad ma' subunità waħda għandu jkun ~ 1.Ittestjajna din il-previżjoni fid-dimer marbut Hv1 F150A-WT (Fig. 4a), fejn l-affinità tal-F150A subunità għal GBTA kienet aktar minn 2 ordnijiet ta 'kobor ogħla minn dik tas-subunità WT (Figuri 1c u 3d). Imbagħad imkejla kurvi ta' konċentrazzjoni-rispons għall-inibizzjoni tas-subunità WT f'konċentrazzjoni bażali ta '2 μM GBTA.F'din il-konċentrazzjoni. , l-imblokkatur huwa mistenni li jorbot madwar 99% tas-subunità F150A u (a) Dijagramma skematika tad-dimer tal-junction F150A-WT użat biex jiġġenera l-emichannel li jimblokka ({F150A}b-WT/BAO*). Djamanti bojod juru l-post tal-mutazzjoni. Fl-istati BAO* u BA*B*, l-affinità tas-subunità F150A hija mistennija li tkun ogħla minn dik tas-subunità WT. (b) Kurrenti tal-protoni minn kanali F150A-WT imkejla b'reazzjoni għal bidliet fil-potenzjal tal-membrana minn -80 mV għal +120 mV.pHi = pHo = 6.0 .Traċċi griżi jirrappreżentaw kurrenti mkejla fin-nuqqas ta 'inibitur.It-traċċa sewda (kontroll) tirrappreżenta l-kurrent imkejjel wara ż-żieda ta' 2 μM GBTA.F'din il-konċentrazzjoni, is-subunità WT ma kinitx inibita b'mod sinifikanti, filwaqt li s-subunità F150A marbuta kważi kompletament ma 'GBTA ({F150A}b-WT). Żieda oħra fil-konċentrazzjoni tal-GBTA rriżultat fl-imblukkar tas-subunità WT (traċċi oranġjo u ħomor). Subunità F150A).Kull punt jirrappreżenta l-inibizzjoni medja ± SD ta' 3 sa 7 kejl. Il-kurvi kienu Hill fits użati biex jinkisbu l-valuri Kd apparenti rrappurtati fit-Tabella Supplimentari 1. Il-koeffiċjenti Hill murija fl-istogrammi daħla ġew determinati mill-fits irrappurtati fil-Fig Supplimentari 3 u 4. Il-valuri h ta 'Hv1 WT huma murija bħala linji mdawwar. L-asterisks jindikaw differenzi statistikament sinifikanti meta mqabbla ma 'WT dimer Hv1 (p Peress li l-inibizzjoni tal-GBTA ta 'Hv1 kienet imkejla fil-kanal miftuħ, aħna rraġunajna li l-kooperattività li torbot GBTA tista' tintuża biex tistudja l-mekkaniżmu ta 'akkoppjar intersubunit fl-istat miftuħ. 22 u l-akkoppjar intersubunit involut fil-gating ġie propost li jkun medjat mid-dominju ċitoplasmika coiled-coil (CCD) 22,25.Għalhekk, staqsejna jekk CCD huwiex involut ukoll fl-akkoppjar bejn siti li jorbtu GBTA fl-istat miftuħ.Triglycine mutazzjonijiet fl-interface bejn il-framment transmembrana S4 u d-dominju coiled-coil intwerew fi studji preċedenti biex jiddiżakkoppjaw dan id-dominju mill-bqija tal-kanal filwaqt li tinżamm l-integrità tad-dimerizzazzjoni. Għalhekk, ittestjajna l-effett tal-mutazzjonijiet V220G, K221G u T222G (Fig. . 5a, mutant GGG) fuq il-kooperattività vinkolanti tal-GBTA. Sibna tnaqqis statistikament insinifikanti (p> 0.05) fil-koeffiċjent Hill tal-irbit tal-GBTA mal-kanali GGG meta mqabbel mat-tip selvaġġ (Fig. 5c), li jissuġġerixxi li minkejja r-rwol tiegħu fiż-żamma tal- żewġ subunitajiet flimkien importanti, iżda CCD ma direttament medjatur intersubunit allosteric igganċjar bejn GBTA siti vinkolanti.
(a) Dijagramma skematika tad-dimer Hv1 b'mutazzjoni tat-trigliċina fit-tarf ta' ġewwa ta' S4 iddisinjat biex ifixkel l-akkoppjar intersubunit medjat mid-dominju ċitoplasmika coiled-coil (vleġeġ blu). mutazzjonijiet indikati, iddisinjati biex jittestjaw frammenti S1 involuti fl-akkoppjar bejn subunitajiet (vleġeġ blu).(c–h) 2GBI (cyan) u GBTA (aħmar skur) jinibixxu l-kostruzzjonijiet indikati b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Kull punt jirrappreżenta l-inibizzjoni medja ± SD ta' 3 sa 10 kejl. Il-kurva kienet Hill fit użata biex tikseb valuri Kd apparenti (ara Tabella Supplimentari 1). Il-koeffiċjenti tal-Hill fl-istogrammi interpolati ġew determinati kif deskritt fit-taqsima tal-Metodi (ara Figuri Supplimentari 3 u 4). Valuri h ta' referenza għal Hv1 WT huma murija bħala linji b'sing. L-asterisks jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn il-passaġġi mutanti u WT (p Peress li eskludejna CCD bħala medjatur dirett tal-irbit kooperattiv tal-GBTA, staqsejna jekk l-interazzjonijiet bejn il-VSDs humiex involuti fl-akkoppjar allosteriku bejn is-siti tal-irbit. Sibna li l-kooperattività tal-irbit tal-GBTA ġiet abolita minn mutazzjoni konservattiva tar-residwu D112 (Fig. 3c) li jinsab fis-segment transmembrana S1.S1 fih żewġ residwi oħra kkargati negattivament, E119 u D123, li jinsabu fuq l-istess naħa tal-helix bħal D112, iżda eqreb lejn it-tarf ta 'barra 24 tal-framment.Simulazzjonijiet bikrija ta' dinamika molekulari indikaw li dawn ir-residwi kienu marbuta. għal D112 permezz ta’ waterlines36,37.Għalhekk, ittestjajna jekk E119 u D123 humiex involuti f’akkoppjar allosteriku bejn siti li jorbtu GBTA (Fig. 5b).Bħala kontroll negattiv, ittestjajna l-pożizzjoni kkonservata kkargata b’mod pożittiv K125, li tinsab ħdejn D123. iżda fuq in-naħa l-oħra tal-helix S1 (Fig. 5b).
Aħna kejlu l-inibizzjoni dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta 'kanali E119A, D123A u K125A minn 2GBI u GBTA u sibna li mutazzjonijiet E119A u K125A ma biddlux b'mod sinifikanti l-koeffiċjent Hill ta' kwalunkwe inibitur meta mqabbel mat-tip selvaġġ (p> 0.05, Fig. 5d,i) ). Min-naħa l-oħra, il-mutazzjoni D123A naqqset b'mod sinifikanti l-koeffiċjent Hill ta 'GBTA (p 0.05/14).
Peress li n-newtralizzazzjoni tal-ħlas fil-pożizzjoni 123 fuq iż-żewġ subunitajiet irriżulta f'bidla qawwija fil-kooperattività vinkolanti tal-GBTA, filwaqt li t-treġġigħ lura tal-ħlas fuq iż-żewġ subunitajiet kellu biss effett żgħir, estendejna l-analiżi biex tinkludi subunità waħda biss mal-kanal tal-inverżjoni tal-ħlas. Aħna iġġenerat Hv1-linked dimeri b'sostituzzjoni D123R fis-subunità C-terminal (Fig. 5b) u mkejla l-inibizzjoni ta 'konċentrazzjoni-rispons minn GBTA u 2GBI.Sibna li l-koeffiċjent Hill ta' GBTA vinkolanti mal-kanali WT-D123R kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak ta 'tip selvaġġ Hv1 (p Aħna sibna wkoll li l-mutazzjoni D112E abolit iż-żieda fil-koeffiċjent Hill li torbot GBTA prodott mill-isfond WT-D123R (Fig. 5b, h u Fig. Supplimentari 4). L-effett fuq il-koeffiċjent Hill ta 'irbit ta' 2GBI ġie eliminat ukoll ( Fig. 5h u Fig. 3 Supplimentari). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-akkoppjar allosteriku mtejjeb bejn is-subunitajiet ikkawżat minn ħlasijiet opposti fil-pożizzjoni 123 ma jissarrafx f'kooperattività tal-irbit aktar b'saħħitha meta s-sit tal-irbit fil-pożizzjoni D112 jiġi mfixkel.
Aħna rraġunajna li jekk ir-residwi D123 fuq subunitajiet miftuħa ħdejn xulxin kienu qrib biżżejjed biex jinteraġixxu b'mod elettrostatiku ma 'xulxin, l-interazzjoni repulsiva bejn il-piżijiet negattivi tiġi kkonvertita f'kombinazzjoni ta' piżijiet negattivi u pożittivi b'sostituzzjoni ta 'aċidu aspartiku għal arginine. interazzjoni attraenti bejniethom.Subunità waħda (dimer WT-D123R).Interazzjonijiet attraenti jistgħu jsaħħu l-interface bejn it-truf ta 'barra tal-framment S1, li jwasslu għal akkoppjar allosteriku aktar b'saħħtu bejn is-subunitajiet u żieda fil-kooperattività li torbot GBTA.
Biex nappoġġjaw din l-ipoteżi, fittixna mod kif insaħħu l-interface bejn it-truf ta 'barra tas-segment S1, li hija distinta mill-bidla tal-ħlas fil-pożizzjoni 123.Lee et al. Preċedentement instabet mutazzjoni tar-residwu Hv1 I127 għal cysteine biex tirriżulta f'cross-linking intersubunit spontanju17.Barra minn hekk, l-istruttura tal-kristall tal-VSD kimeriku Hv1-CiVSP indikat li I127 huwa separat mit-tarf ta 'barra tal-helix S1 b'residwu wieħed biss24.Għalhekk staqsejna jekk il-formazzjoni ta' rabta kovalenti bejn cysteines fil-pożizzjoni 127, li hija mistennija li tirriżulta f'interazzjoni S1-S1 aktar b'saħħitha, għandha effett fuq il-kooperattività vinkolanti tal-GBTA simili għal dik osservata billi tinbidel il-ħlas fil-pożizzjoni 123.
Aħna kejlu l-inibizzjoni dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta 'Hv1 I127C minn GBTA u 2GBI fil-preżenza u l-assenza ta' 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fig. 6a).Fl-istess ħin li l-inibitur huwa miżjud mas-soluzzjoni intraċellulari, it-tnaqqis aġent huwa miżjud mas-soluzzjoni extraċellulari.Dimer marbut b'sostituzzjoni taċ-ċisteina f'subunità waħda biss (WT-I127C) intuża bħala kontroll negattiv (Fig. 6a). Ma stajna nkejlu l-ebda effett ta' cross-linking spontanju ta' intersubunit. bejn is-subunitajiet I127C fuq l-inibizzjoni ta '2GBI, minħabba li l-koeffiċjent Hill għall-I127C li jorbot ma' Hv1, bi jew mingħajr βME, kien differenti b'mod sinifikanti minn dak għall-irbit ma' dimeri sostitwiti bil-monocysteine. Il-koeffiċjent Hill ma setax jiddifferenzja WT-I127C (Fig. 6b u Supplimentari Fig. 3).B'kuntrast qawwi, aħna kejlu l-effett drammatiku ta 'intersubunit crosslinking spontanju fuq inibizzjoni GBTA.Il-koeffiċjent Hill għall-irbit ma' Hv1 I127C fin-nuqqas ta' βME (crosslink mixgħul) kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak imkejjel fil-preżenza ta 'βME (crosslink off) jew bl-użu ta' WT-127C biex jgħaqqad id-dimer (fin-nuqqas ta 'crosslink) (Fig. 6c u Supplimentari Fig. 4), li jindika li l-akkoppjar allosteriku bejn is-siti ta' rbit hija msaħħa ħafna bil-formazzjoni ta' rabtiet disulfide bejn it-truf ta' barra tal-frammenti S1. Dawn ir-riżultati jappoġġjaw l-interpretazzjoni tagħna li l-interazzjoni elettrostatika attraenti ta 'aspartate u arginine fil-pożizzjoni 123 fid-dimer WT-D123R tirriżulta f'akkoppjar allosteriku miżjud bejn is-subunitajiet.
L-akkoppjar ta 'stat miftuħ huwa medjat minn interazzjonijiet fiżiċi diretti bejn it-truf ta' barra tas-segment S1 fiż-żewġ subunitajiet.
(a) Rappreżentazzjoni skematika ta' dimeri Hv1 mutanti u dimeri li jgħaqqdu, iddisinjati biex jinvestigaw kif intersubunit cysteine crosslinks jaffettwaw il-kooperattività tal-irbit tal-GBTA. (bd) Inibizzjoni dipendenti fuq il-konċentrazzjoni tal-kostrutti indikati minn 2GBI (b,d) u GBTA (c, e) fil-preżenza jew in-nuqqas ta' 10 mM βME f'soluzzjoni extraċellulari.Kull punt jirrappreżenta l-inibizzjoni medja ± SD ta' 3 sa 10 kejl. Il-kurva kienet ta' Hill fit użata biex tikseb valuri Kd (ara Tabella Supplimentari 1). Il-koeffiċjenti ta' Hill fl-istogrammi ta' daħla ġew determinati mill-adattamenti rrappurtati f'Fig Supplimentari 3 u 4. Asterisks f'(c, e) jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn kundizzjonijiet differenti ta 'inibizzjoni GBTA (p 0.05).
Sibna wkoll li fin-nuqqas ta 'βME, il-koeffiċjent Hill ta' GBTA li jorbot mad-dimer D112E I127C Hv1 kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak imkejjel fil-preżenza ta 'aġenti li jnaqqsu (Fig. 6e u Fig. 4 Supplimentari), li jimplika li l-mutazzjoni D112E. ma neħħiex iż-żieda fil-kooperattività tal-irbit tal-GBTA li tirriżulta mill-cross-linking taċ-ċisteina 127.Il-koeffiċjent Hill ta '2GBI li jorbot ma' dimeri D112E, I127C Hv1 lanqas ma kienx affettwat b'mod sinifikanti mill-mutazzjoni D112E (Figura 1).6d u Supplimentari Fig. 3).
Meħuda flimkien, dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li t-twaħħil ta 'GBTA huwa msaħħaħ bl-interazzjoni bejn it-truf ta' barra ta 'frammenti S1 f'subunitajiet Hv1 ħdejn xulxin permezz ta' interazzjonijiet elettrostatiċi attraenti jew permezz tal-formazzjoni ta 'rabtiet kovalenti bejn ċisteini sostitwiti L-akkoppjar allosteriku bejn is-siti jiżdied u jirriżulta f'kooperattività vinkolanti. Filwaqt li l-effett ta 'interazzjonijiet elettrostatiċi attraenti fuq il-kooperattività jista' jiġi abolit permezz ta 'mutazzjoni D112E, l-effett ta' bonds kovalenti ma jistax.
Fl-esplorazzjoni tagħna tal-ispazju kimiku disponibbli għall-irbit tad-derivattivi tal-guanidine mal-kanali Hv1, sibna li 2-guanidinothiazoles bħal GBTA għandhom dipendenza fuq konċentrazzjoni aktar wieqaf minn 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). u kanali monomeriċi (Fig. 2a, b) u mal-kanal dimeriku li fih subunità waħda kienet marbuta minn qabel mal-inibitur (Fig. 4) wassluna biex nikkonkludu li l-inibizzjoni ta 'Hv1 minn GBTA L-azzjoni hija proċess sinerġistiku, u is-siti tal-irbit tal-komposti fiż-żewġ subunitajiet huma allosterically akkoppjati.L-iskoperta li GBTA jorbot mal-kanal miftuħ, kif muri qabel għall-kompost relatat 2GBI32, jissuġġerixxi li l-akkoppjar allosteriku jista 'jiġi vvalutat speċifikament fl-istat miftuħ. Il-mudell ta' rbit kooperattiv tagħna kien kapaċi kwantitattivament jiddeskrivi l-inibizzjoni ta 'Hv1 minn GBTA (Fig. 2c) u jispjega l-effetti differenti ta' 2GBI u GBTA fuq it-tħassir tal-kurrenti tad-denb tal-kanal wara r-polarizzazzjoni tal-membrana, li tappoġġja l-interpretazzjoni tagħna tal-proċess ta 'rbit.
Il-koeffiċjent massimu Hill li jista 'jinkiseb f'proteina allosterika b'żewġ siti ta' rbit (bħal Hv1) huwa 2.Kejjna GBTA biex torbot Hv1 wild-type b'koeffiċjent ta '1.31, li żdied għal 1.88 f'Hv1 I127C. enerġija ħielsa sinerġistika, id-differenza bejn l-enerġiji ħielsa li jorbtu tas-siti ta 'affinità l-aktar baxxi u ogħla (ara Metodi), kienet 1.3 kcal/mole fil-każ ta' Hv1 wild-type u 2.7 kcal/mole fil-każ ta 'Hv1 I127C.The vinkolanti ta 'ossiġnu għall-emoglobina huwa l-aktar eżempju famuż u studjat sew tal-proċess kollaborattiv38. Għall-emoglobina umana (tetramer b'erba' siti ta' rbit allosterikament akkoppjati), il-koeffiċjent Hill ivarja minn 2.5-3.0, b'valuri li jvarjaw minn 1.26 sa 3.64 kcal/mol, skont kundizzjonijiet sperimentali38.Għalhekk, f’termini ta’ enerġetika globali, il-kooperattività ta’ GBTA li torbot ma’ Hv1 mhijiex sostanzjalment differenti minn dik ta’ O2 li torbot mal-emoglobina meta jitqiesu n-numri differenti ta’ subunitajiet tal-proteini fiż-żewġ sistemi.
Fil-mudell ta 'sinerġija tagħna, it-twaħħil ta' molekuli GBTA ma 'subunità waħda tirriżulta f'żieda fl-affinità ta' rbit tas-subunità ta' ħdejha. Aħna nipprevedi proċess li fih arranġament mill-ġdid tal-ambjent li jorbot li jirriżulta mill-ewwel avveniment vinkolanti (tajbin indott) iwassal għal bidliet fl-interazzjonijiet bejn is-subunitajiet.B'reazzjoni għal dawn il-bidliet, is-subunitajiet li jmissu magħhom jibdlu s-siti ta' rbit tagħhom, li jirriżulta f'irbit GBTA aktar strett. Matul dan il-proċess, is-S1 aspartate D112 huwa responsabbli għar-riarranġament tas-sit ta' rbit assoċjat ma' żieda fl-affinità ta' rbit.D112 Preċedentement intwera li huwa parti mill-mogħdija tal-permeazzjoni tal-protoni Hv1 u li jaġixxi bħala filtru tas-selettività27,28. Ir-riżultati tagħna juru li l-filtri tas-selettività fiż-żewġ subunitajiet Hv1 huma akkoppjati allosterikament fl-istat miftuħ. Il-Figura 7a turi l-post approssimattiv tas-sit tal-irbit tal-GBTA u l-post tar-residwi D112, D123, K125 u I127 fuq skematika tal-VSD Hv1 ibbażata. fuq l-istruttura tal-kristall tal-kimera Hv1-CiVSP.Direzzjonijiet suġġeriti għall-akkoppjar allosteriku li jinvolvi t-tarf extraċellulari ta 'S1 huma murija bi vleġeġ suwed.
(a) Skematiku tal-Hv1 VSD.Ibbażat fuq l-istruttura tal-kristall tal-kimera Hv1-CiVSP, is-segmenti helical huma murija li huma ċilindriċi.F'din il-konfigurazzjoni, it-tarf ta 'ġewwa tas-segment S4 jingħaqad mal-CCD (mhux murija). Il-postijiet mbassra tal-GBTA marbuta huma murija bħala ovali griżi. Il-vleġeġ suwed jindikaw mogħdijiet involuti fl-akkoppjar allosteriku bejn is-siti tal-irbit f'żewġ subunitajiet maġenb. Il-pożizzjonijiet tar-residwi S1 investigati huma mmarkati bi sferi kkuluriti. (b) Illustrazzjoni skematika tas-subunitajiet Hv1 irranġati f'żewġ konfigurazzjonijiet dimer differenti kif jidher min-naħa extraċellulari tal-pjan tal-membrana.Fuq il-pannell tax-xellug, l-interface tad-dimer hija ffurmata mill-helix S4.Rotazzjoni taż-żewġ VSDs 20 grad lejn l-arloġġ madwar assi perpendikolari mal-pjan tal-membrana, akkumpanjata minn is-separazzjoni tat-truf ta' barra taż-żewġ helices S4 (vleġeġ b'sing), tipproduċi l-arranġament muri fuq il-lemin.F'din il-konfigurazzjoni, ir-residwi D123 u I127 minn subunitajiet maġenb jitħallew jersqu qrib xulxin.(c) Rappreżentazzjoni skematika tal-VSD CiVSP fil-konfigurazzjoni dimer misjuba fl-istruttura tal-kristall 4G80.Pożizzjoni P140 f'CiVSP tikkorrispondi mal-pożizzjoni D123 f'Hv1.
Ir-riżultati tagħna juru li l-interazzjoni elettrostatika repulsiva bejn ir-residwu 123 (123D/123D jew 123R/123R) hija assoċjata ma 'livell "normali" ta' koperattività li torbot GBTA fl-istat miftuħ u tbiddel l-interazzjoni minn repulsjoni għal Attracted (123D/123R) , żieda fil-kooperazzjoni (Fig. 5g).Huwa mistenni li t-tneħħija tal-interazzjoni repulsiva mas-sostituzzjoni tal-alanine twassal ukoll għal żieda fil-kooperattività.Madankollu, ġie osservat tnaqqis fil-kooperattività tad-dimer 123A/123A (Fig. 5e). spjegazzjoni hija li l-effett destabbilizzanti tat-tqegħid ta 'residwi idrofobiċi f'ambjent idrofiliku jista' jegħleb l-effett stabilizzanti minħabba l-eliminazzjoni ta 'interazzjonijiet repulsivi bejn residwi D123, li jirriżulta fi tnaqqis ġenerali fil-kooperattività vinkolanti.Mony et al.39 reċentement irrapportaw li l-aċċessibbiltà tas-solvent fi il-pożizzjoni D171 ta 'Ciona gutis Ci-Hv1 (li tikkorrispondi għal D123 f'Hv1 uman) tiżdied mal-attivazzjoni, u tappoġġja l-idea li D123 jinsab f'ambjent idrofiliku fl-istat miftuħ.
Il-gating tal-kanali Hv1 huwa magħruf li jseħħ permezz ta' transizzjonijiet multipli19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 sabu li fuq id-depolarizzazzjoni tal-membrana, is-sensor tal-vultaġġ ta 'Ci-Hv1 jgħaddi minn bidla konformazzjonali li tħalli l-kanal attivat iżda xorta magħluqa. , segwita minn tranżizzjoni distinta li tikkawża li protoni jiftħu l-konduzzjoni fiż-żewġ subunitajiet mogħdija. Il-bidla konformazzjonali tas-sensor tal-vultaġġ ġiet immonitorjata minn fluworexxenza ta 'vultaġġ-morsa, u nstab li t-tieni transizzjoni kienet imfixkla b'mod selettiv mill-mutazzjoni fil-pożizzjoni D171. Il-perturbazzjoni tas-sinjal fluworexxenti hija konsistenti mal-preżenza ta 'interazzjonijiet elettrostatiċi bejn ir-residwi D171 ta' subunitajiet maġenb f'xi punt tul il-koordinati tar-reazzjoni tal-bidla konformazzjonali. Din l-interpretazzjoni hija konsistenti mas-sejba tagħna li r-residwu D123 jinteraġixxi elettrostatikament fl-istat miftuħ. u jimmedja l-akkoppjar allosteriku bejn is-siti tal-irbit tal-GBTA.
Fujiwara et al25 ipproponew li l-interface tad-dimer tad-dominju ċitoplasmika tal-coiled-coil testendi fil-membrana biex ikun fiha żewġ helices S4 (Fig. 7b, panel tax-xellug). il-VSD kollu u l-analiżi funzjonali tar-reġjun li jgħaqqad il-helix S4 u s-CCD.Fl-assenza ta 'gradjent tal-pH transmembrane, il-kanali Hv1 jeħtieġu depolarizzazzjoni konsiderevoli tal-membrana biex jinfetħu, u cysteine crosslinking iseħħ taħt kundizzjonijiet fejn il-kanal huwa prinċipalment magħluq. Għalhekk, l-interfaċċja S4-S4 skoperta x'aktarx tirrifletti l-konfigurazzjoni tas-subunità barra mill-istat. Studji oħra sabu evidenza għall-involviment ta 'S1 u S2 f'interazzjonijiet intersubunit waqt gating17,21,26 li jissuġġerixxu li l-kanali jistgħu jadottaw konfigurazzjonijiet ta' subunità differenti fil-miftuħ u stati magħluqa, idea konsistenti mas-sejbiet ta 'Mony et al. S1 jiċċaqlaq 39 waqt gating.
Hawnhekk, nuru li, fl-istat miftuħ, it-truf extraċellulari tal-helix S1 huma qrib biżżejjed biex jappoġġjaw interazzjonijiet elettrostatiċi diretti li jimmedjaw l-akkoppjar allosteriku bejn is-subunitajiet. Fil-konfigurazzjoni dimer b'interazzjonijiet S4-S4 estiżi, il-helix S1 huma 'l bogħod wisq. apparti minn xulxin biex jinteraġixxu direttament.Madankollu, rotazzjoni lejn l-arloġġ ta’ 20° taż-żewġ subunitajiet VSD madwar assi perpendikolari mal-pjan tal-membrana, flimkien mas-separazzjoni tat-truf ta’ barra taż-żewġ helizes S4, tat konfigurazzjoni konsistenti S1-S1 bis-sejbiet tagħna (Fig. 7b, panel tal-lemin).Nirrakkomandaw din il-konfigurazzjoni għall-kanal fl-istat miftuħ.
Għalkemm l-enzima CiVSP hija maħsuba li taħdem bħala monomeru, l-istruttura tal-kristall tal-VSD iżolat tagħha tinqabad fi stat dimer. It-truf ta 'barra tal-helizes S1 f'dan id-dimer huma spazjalment qrib xulxin, u l-konfigurazzjoni ġenerali hija simili għal dik proposta għal Hv1 (Fig. 7c).Fid-dimer CiVSP, l-eqreb residwu mis-subunità maġenb kien proline fil-pożizzjoni 140 (Fig. 7c). Interessanti, P140 f'CiVSP jikkorrispondi għall-pożizzjoni D123 f'Hv1.Ix-xebh fil-konfigurazzjoni tas-subunità bejn Hv1 u dimeri CiVSP jissuġġerixxu li l-VSDs ta 'dawn il-proteini għandhom tendenza intrinsika li jiffurmaw interface fejn it-truf extraċellulari ta' S1 jinteraġixxu.
Ir-rwol essenzjali ta 'Hv1 fl-attivazzjoni taċ-ċelluli tal-isperma jagħmel dan il-kanal mira tad-droga attraenti għall-kontroll tal-fertilità maskili. Barra minn hekk, l-attivazzjoni ta' Hv1 fil-mikroglia ntwera li teggrava l-irkupru minn puplesija iskemika. sopravivenza f'pazjenti b'kanċer tas-sider 12 jew tal-kolorektum 13 u huwa maħsub li jikkontribwixxi għal tumuri malinni taċ-ċelluli B 11 .Għalhekk, mediċini ta 'molekula żgħira li jimmiraw Hv1 jistgħu jintużaw bħala aġenti newroprotettivi jew terapewtiċi kontra l-kanċer. sottounità Hv1 miftuħa, li twassal għal żieda fl-affinità tal-irbit, tista 'twassal għall-iżvilupp ta' mediċini aktar qawwija li jimmiraw kanali Hv1.
Mutaġenesi diretta tas-sit tal-Hv1 uman saret bl-użu ta 'tekniki PCR standard. Fil-kostruzzjoni Hv1NCCiVSP, ir-residwi 1-96 u 228-273 ta' Hv1 ġew sostitwiti b'residwi 1-113 u 240-576 ta 'CiVSP18.Fid-dimer marbut ma' Hv1, it-terminal C ta 'subunità waħda hija marbuta mat-tmiem N tat-tieni subunità permezz tal-linker GGSGGSGGSGSGGGSGG. T7 mMessage mMachine kit traskrizzjoni (Ambion).1-3 ijiem qabel il-kejl elettrofiżjoloġiku, cRNA ġie injettat f'ooċiti Xenopus (50 nl kull ċellula, 0.3-1.5 μg / μl). Inkisbu ooċiti tal-Istadju V u VI minn Xenopus laevis (NASCO). minn Ecocyte Bioscience.Wara l-injezzjoni ta 'RNA, iċ-ċelluli nżammu f'medja ND96 li fiha 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml, 100 μg/ml gentamicin ° 7Cl. .
2-guanidino-benzimidazole[1], 2-guanidino-benzothiazole[2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl)guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazole- 5-carboxylate [9] u (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate [10] kienu minn Sigma-Aldrich.Famotidine [7] kien minn MP Biomedicals.1-[4 -(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine[11] u 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-yl]guanidine [12] kien minn Matrix Scientific.Dawn il-komposti huma ta’ l-ogħla purità disponibbli kummerċjalment.Dawn f’DMSO niexef biex jiġġeneraw soluzzjoni stokk ta’ 100 mM, li mbagħad ġiet dilwita fis-soluzzjoni ta’ reġistrazzjoni fil-konċentrazzjoni finali mixtieqa.Il-komposti 3 u 4 ġew sintetizzati hawn taħt b’ mill-inqas 99% purità.
Ma’ sospensjoni ta’ 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) f’25 mL ta’ aċidu idrokloriku milwiema (2.5 N) ġie miżjud solidu dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), u t-taħlita eteroġenja li tirriżulta ġie refluxed b'taħwid vigoruż għal 4 sigħat. It-taħlita ta 'reazzjoni ġiet imkessħa għat-temperatura tal-kamra u newtralizzata biż-żieda gradwali ta' idrossidu tal-potassju 10N. Il-preċipitat abjad iffurmat ġie ffiltrat, maħsul b'ilma kiesaħ (3 × 50 ml), imnixxef f'forn ( 65 °C) għal diversi sigħat, u mbagħad rikristallizzat minn aċetat etiliku/etere tal-petroleum biex jagħti solidu abjad (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (dawl 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (s wiesgħa ħafna, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d) , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J). = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): valur ikkalkulat m/z.Għal C9H8F3N4S (M + H)+: 26, misjuba. : 261.0419.
Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), sintetizzat kif deskritt qabel, ġie msaħħan għal 200 °C f'banju taż-żejt f'tubu żgħir tat-test.300 mg (eċċess kbir) cyanamide u 1.0 ml conc.Mal-kompost sħun ġie miżjud aċidu idrokloriku malajr u t-taħlita nżammet fil-banju taż-żejt għal madwar 2 minuti, li matulhom ħafna mill-ilma evaporat.It-taħlita ta 'reazzjoni mbagħad tkessaħ għat-temperatura tal-kamra u l-materjal solidifikat li jirriżulta inqasam f'biċċiet żgħar u maħsul bl-ilma biex jipprovdi solidu amorfu isfar ċar.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 Hz) , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d , 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z ikkalkulat valur.Għall-HN+412H 1 +16N42H 132.1. , misjuba: 243.0704.
Il-kurrenti tal-protoni ġew imkejla f'irqajja' interni u esterni ta' ooċiti li jesprimu kostruzzjonijiet differenti bl-użu ta' amplifikatur Axopatch 200B ikkontrollat minn Axon Digidata 1440A (Apparat Molekulari) b'softwer pClamp10. Soluzzjonijiet intraċellulari u extraċellulari għandhom l-istess kompożizzjoni: 100 mM 2-(N-morfolino) )ethanesulfonic acid (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM TEA chloride, 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), aġġustat għal pH 6.0 b'TEA hydroxide.Il-kejl kollu sar f'22 ± 2 °C.Il-pipetta għandha reżistenza għall-aċċess ta' 1.5–4 MΩ.Traċċi kurrenti ġew iffiltrati f'1 kHz, kampjunati f'5 kHz u analizzati bi Clampfit10.2 (Apparat Molekulari ) u Origin8.1 (OriginLab).
Soluzzjonijiet li kien fihom diversi konċentrazzjonijiet ta 'inibitur Hv1 u f'xi każijiet 10 mM βME ġew introdotti fil-banju permezz ta' gravità permezz ta 'manifold konness ma' sistema ta 'valv ta' perfużjoni VC-6 (Warner Instr.), li kien mgħoddi permezz tas-software pClamp TTL (Transistor- Transistor Logic) sinjali.Twettqu esperimenti ta’ perfużjoni rapida bl-użu ta’ lapes ta’ perfużjoni b’ħafna tubi (AutoMate Sci.) b’ponta tal-kunsinna ta’ dijametru ta’ 360 μm immuntata quddiem pipetta tal-garża. Polz depolarizzanti +120 mV.Il-kejl tal-GV sar kif deskritt qabel18,20.Il-kurrenti tad-denb ġew irreġistrati f'-40 mV wara passi ta' depolarizzazzjoni f'vultaġġi differenti minn -20 mV sa +120 mV sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor.Il-polz ta' referenza qabel il-polz tat-test huwa użat biex jikkoreġi għat-tħassir kurrenti 18 .Il-graff tal-GV taqbel mal-ekwazzjoni ta' Boltzmann:
Il-kostanti ta 'dissoċjazzjoni apparenti (Kd) għal kombinazzjonijiet differenti ta' kanali u inibituri (Tabella Supplimentari 1) ġew determinati billi twaħħlet id-dipendenza fuq il-konċentrazzjoni tal-inibizzjoni (valuri medji ta '% inhib) mal-ekwazzjoni ta' Hill:
fejn [I] hija l-konċentrazzjoni tal-inibitur I u h hija l-koeffiċjent Hill. Biex jiġi kkalkulat il-koeffiċjent Hill, l-ekwazzjoni (2) hija rranġata mill-ġdid bħala:
Ħin tal-post: Ġunju-07-2022
