Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat do CSS. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó mód comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun a chinntiú tacaíocht leanúnach, cuirfimid ar taispeáint ar an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Is coimpléasc dimeric é an cainéal prótón voltas-gated Hv1 comhdhéanta de dhá réimse braite voltais (VSDs), gach ceann acu ina bhfuil cosán tréscaoilte prótón gated.Tá an dimerization á rialú ag an bhfearann coiled-corna cíteaplasmach. An t-aistriú ón stát dúnta go dtí an stát dúnta. is eol go dtarlaíonn an stát oscailte sa dá VSD go comhoibríoch; áfach, is beag atá ar eolas faoi na meicníochtaí bunúsacha.Tá ról lárnach ag comhéadain idirfho-aonad i bpróisis allosteric; áfach, níor aithníodh comhéadain den sórt sin i gcainéal oscailte Hv1. Anseo léirímid go gcuireann díorthaigh 2-guanidinothiazole bac ar dhá VSD Hv1 ar bhealach comhoibríoch agus go n-úsáideann siad ceann de na comhdhúile seo mar thaiscéalaí le haghaidh cúplála allosteric idir fo-aonaid oscailte. cruthaíonn deireadh an chéad bhlúire transmembrane de VSD comhéadan idirfho-bhunanna a dhéanann idirghabháil ar chúpláil idir láithreáin cheangailteach, ach níl baint dhíreach ag an bhfearann coiled-corna leis an bpróiseas seo. .
Imríonn cainéil prótóin le geataí voltais róil thábhachtacha in orgánaigh éagsúla, ó fhíteaplanctón go daoine 1.I bhformhór na gcealla, déanann na cainéil seo idirghabháil ar eisreabhadh prótón ón scannán prótóin agus rialaíonn siad gníomhaíocht NADPH oxidase.An t-aon cainéal prótóin atá gataithe le voltas i ndaoine. Tá Hv1, a bhfuil an táirge ar an géine HVCN12,3.Hv1 (aka VSOP) léirithe go bhfuil ról i iomadú cille B4, táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch ag an chóras imdhíonachta dúchasach5,6,7,8, cealla sperm motility9 agus rialáil pH sreabhán dromchla aerbhealaigh10. Tá baint ag an gcainéal seo le roinnt Overexpressed i gcineálacha ailse cosúil le hurchóideacht B-chill4,11 agus ailse chíche agus cholaireicteach12,13.Fuarthas go n-ardóidh gníomhaíocht iomarcach Hv1 cumas méadastatach na gcealla ailse 11, 12. San inchinn, cuirtear Hv1 in iúl ag microglia, agus tá sé léirithe go ndéanann a ghníomhaíocht damáiste inchinne i múnlaí stróc ischemic níos measa.
Tá fearann braite voltais (VSD) sa phróitéin Hv1, atá comhdhéanta de cheithre mhír trasmembrane ar a dtugtar S1 go S414. Tá an VSD cosúil leis na fearainn chomhfhreagracha de chainéil Na+, K+ agus Ca2+ le voltas-gheataithe agus fosfáití íogaire voltais, mar CiVSP ó Ciona gutis15. Sna próitéiní eile seo, tá an C-críochfort de S4 ceangailte le modúl éifeachtóra, an fearann pore nó einsím.In Hv1, tá S4 nasctha leis an bhfearann coiled-coil (CCD) atá suite ar thaobh cíteaplasma an scannáin. .Is coimpléasc dimeric é an cainéal comhdhéanta de dhá VSD, gach ceann ina bhfuil cosán tréscaoilte prótón gated16,17,18.Fuarthas go n-osclódh an dá fho-aonad Hv1 seo go comhoibríoch19,20,21,22, rud a thugann le tuiscint go n-imríonn cúpláil allosteric agus idirghníomhaíochtaí idirfho-aonad. ról tábhachtach sa phróiseas gating.Tá an comhéadan idir na fo-aonaid laistigh den fhearann corna coiled dea-shainithe toisc go bhfuil struchtúir chriostail an dá fhearann scoite ar fáil22,23.Ar an láimh eile, níl an comhéadan idir VSDanna laistigh den membrane Ní sholáthraíonn struchtúr criostail an phróitéin chimeric Hv1-CiVSP faisnéis faoin gcomhéadan seo, toisc go bhféadfadh eagraíocht trimeric an choimpléasc cainéal criostalaithe a bheith mar thoradh ar athsholáthar an Hv1 CCD dúchais ag an zipper leucine giosta GCN424.
Tháinig staidéar le déanaí ar eagraíocht fo-aonad an chainéil Hv1 i gcrích go n-aistríonn dhá héileacaptar S4 isteach sa CCD gan cur isteach mór ar an struchtúr tánaisteach, agus mar thoradh ar helices fada a thosaíonn ón scannán agus a théann isteach sa cíteaplasma. molann an staidéar seo go ndéanfadh Hv1 VSDs teagmháil lena chéile feadh deighleog S4. Mar sin féin, tá comhéadain mhalartacha molta ag staidéir eile idir VSDs. Áiríonn na comhéadain seo deighleoga S1 17, 21, 26 agus foircinn sheachtracha mhír S2 21. Cúis fhéideartha atá leis an gcoimhlint. Is é torthaí na staidéar seo ná gur scrúdaíodh cúpláil allosteric idir VSDanna maidir leis an bpróiseas geataithe, atá ag brath ar na stáit dúnta agus oscailte, agus d'fhéadfadh an comhéadan idir VSDanna a bheith éagsúil in athruithe stáit éagsúla i gcomhfhoirmiú.
Anseo, fuaireamar amach go gcuireann 2-guanidinothiazole bac ar chainéil Hv1 trí cheangal go sineirgistíoch le dhá VSD oscailte, agus d’úsáid sé ceann de na comhdhúile, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), chun an idirghníomhaíocht idir fo-aonaid sa stát oscailte a fhiosrú. Fuaireamar amach gur féidir cur síos maith a dhéanamh ar chuar ceangailteach GBTA trí shamhail chainníochtúil ina dtagann méadú ar chleamhnas ceangailteach an fho-aonaid in aice le hiarmhair D112, scagairí roghnaíochta don fho-aonad. cainéal 27, 28 agus cuid den suíomh díorthach guanidine ceangailteach 29 rialú GBTA ceangailteach cooperativity.We thaispeáint go bhfuil ceangailteach comharchumann a chothabháil sa dimer Hv1, i gcás ina scarann an CCD ón deighleog S4, le tuiscint nach bhfuil an comhéadan intersubunit sa CCD go díreach. idirghabháil a dhéanamh ar chúpláil allosteric idir láithreáin ceangailteach GBTA.I gcodarsnacht leis sin, feicimid go bhfuil an blúire S1 mar chuid den chomhéadan idir na fo-aonaid agus molaimid socrú de VSDanna in aice le deireadh eischeallach an héilics S4 ar shiúl ó lár an dimer a cheadú. an blúire S1 a bheith sa staid oscailte.
Tá coscairí móilíní beaga Hv1 úsáideach mar dhrugaí anticancer agus gníomhairí neuroprotective. Mar sin féin, go dtí seo, is beag comhdhúile a bhí in ann an cainéal a chosc. .1a) agus fuarthas amach go raibh a díorthaigh bac VSD29,32 tréscaoilteacht prótóin tríd an cainéal.Ceangail na comhdhúile den sórt sin a chreidtear a tharlaíonn go neamhspleách sa dá subunits oscailte.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, cumaisc [2] i bhFíor 1a). léiríodh roimhe seo go gcuireann sé bac ar Hv1 beagnach chomh héifeachtach le 2GBI nuair a thástáiltear é ag tiúchan 200 μM (Fíor 1b). Scrúdaigh muid díorthaigh thiazole eile agus fuaireamar amach gur chuir cuid acu bac ar an gcainéal le cumas comhchosúil nó níos mó ná GBTA (Fíor 1 agus Forlíontach). téacs). Chinneamar na cuair freagartha comhchruinnithe de cheithre dhíorthaigh thiazole (GBTA agus comhdhúile [3], [6] agus [11], Fíor 1c) agus fuaireamar amach go raibh siad níos géire ná iad siúd de chomhéifeachtaí 2GBI.The Hill (h) de dhíorthaigh thiazole sa raon ó 1.109 ± 0.040 go 1.306 ± 0.033 (Fíor. 1c agus Fíor Fhorlíontach 1). I gcodarsnacht leis sin, ba é comhéifeacht Hill do 2GBI ná 0.975 ± 0.024 29, Fíor 2a agus Fíor Fhorlíontach 1). Léiríonn comhéifeacht Cnoc os cionn 1 comhoibríocht cheangailteach. Toisc go bhfuil a choscóir féin ag gach fo-aonad Hv1. suíomh ceangailteach,29,32 rinneamar réasúnú go bhféadfadh ceangal díorthach thiazole le fo-aonad amháin cur le ceangal an dara móilín coscaire leis an subunit cóngarach. Ba é GBTA an comhdhúil tástála leis an gcomhéifeacht Hill is airde. Dá bhrí sin, roghnaigh muid an cumaisc seo chun staidéar breise a dhéanamh ar mheicníocht na sineirgíochta ceangailteach agus úsáid 2GBI mar rialú diúltach tagartha.
(a) Comhdhúile tástála: [1] Tagairt Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanídín-beansóithín (GBTA), [3] (5-trífhluaramheitiol-1,3-beansaitéasól-2-il)guanaidín, [4] nafta[1,2-d][1,3] Thiazol-2-il -guanídín, [5](4-meitil-1,3-thiazol-2-il)guanidine, [6](5-bróma-4-meitil-1,3-thiazol- 2-il)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-meitil-1,3-thiazole-4-carboxylic acid eitile eistear, [9] 2-guanidino-4-meitil Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10] ](2-guanidino-4-meitil-1,3-thiazol-5-il)aicéatáit eitile, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-il]guanídín, [11] 12]1-[4-(3,4-démheatocsafheinil)-1,3-thiazol-2-il]guanidine.(b) Cosc ar ghníomhaíocht Hv1 daonna ag na guanidinothiazoles léirithe agus an chomhdhúil tagartha 2GBI (barraí gorm-uaine) Tomhaiseadh sruthanna prótóin .Hv1 i plaiceanna laistigh amuigh d'úicítí Xenopus mar fhreagra ar dhípholarú ó chumas coinneála -80 mV go +120 mV. Cuireadh gach coscaire leis an dabhach ag tiúchan 200 μM.pHi = pHo = 6.0 Is meán ±SEM (n≥4) iad na sonraí).(c) Cosc ar thiúchan-spleách ar Hv1 daonna trí chomhdhúile [2], [3], [6] agus [11]. Seasann gach pointe don mheán-chosc ± SD de 3 go 15 tomhas. Feisteas Hill is ea an líne a úsáidtear chun na luachanna dealraitheacha Kd a thuairiscítear i dTábla Forlíontach 1 a fháil. Socraíodh comhéifeachtaí cnoc ó na n-oireann a tuairiscíodh i bhFíor Forlíontach 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (féach Modhanna).
(a,b) Comhdhúile 2GBI agus GBTA bac ar Hv1 dimeric agus monaiméireach ar bhealach tiúchan-spleách. Léiríonn gach pointe an meán-cosc ± SD de 3 go 8 tomhais agus is é an cuar oiriúnach Hill.The Hill comhéifeachtaí (h) léirithe i Socraíodh na histeagraim ionchuir ó na n-oireann a tuairiscíodh i bhFíoracha Forlíontacha 3 agus 4. Tá freagairt tiúchana GBTA a thaispeántar in (a) mar an gcéanna leis an bhfreagra i bhFíor 1c.Féach Tábla Forlíontach 1 le haghaidh luachanna dealraitheacha Kd.(c) Samhaltú de ceangal comhoibríoch GBTA le Hv1 dimeric. Léiríonn an líne dhubh soladach an oiriúnacht do na sonraí turgnamhacha trí chothromóid (6), a chuireann síos ar an tsamhail cheangailteach a thaispeántar in (d). Seasann na línte briste lipéadaithe Fo 1 agus Fo 2 don chomhlachas démhóilíneach -cuair chothromaíochta an díthiomsaithe den chéad agus an dara teagmhas ceangailteach, faoi seach (Fo 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Fo 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 2.3 ± 2.5 μM ).(d) Léaráid scéimreach de mheicníocht bheartaithe an bhloc Hv1.I gcás GBTA, méadaítear cleamhnas an fho-aonaid oscailte in aice láimhe (Kd2 Is féidir monaiméiriú a dhéanamh ar chainéil Hv1 trí chodanna comhfhreagracha den fhosphatase CiVSP atá íogair ó thaobh voltais (Hv1NCCiVSP) 18,34 a chur in ionad a bhfearainn cíteaplasmacha N- agus C-críochfort. Rinne GBTA agus 2GBI an spleáchas tiúchana ar chosc ar Hv1 monaiméireach a thomhas agus iad a chur i gcomparáid le cosc ar chainéil dimeric (cineál fiáin) (Fíor 2a,b).Fuair muid gur cuireadh deireadh leis an difríocht i gcomhoibríocht cheangailteach idir an dá chomhdhúil i monaiméireach Hv1, ag tacú leis an míniú go bhfuil GBTA ceangailteach le fo-aonad amháin méaduithe ar an cleamhnas an fho-aonaid eile don choscóir.Réasúníomar go bhféadfadh atheagrú an láithreáin ceangailteach (astú fit35) a bheith mar thoradh ar cheangal GBTA le fo-aonad Hv1 amháin, rud a chuirfeadh tús le hathshocrú ar shuíomh folamh ceangailteach an fho-aonaid in aice láimhe, rud a d'fhágfadh go mbeadh ceangal méadaithe ann. cleamhnas.
Chun cur síos cainníochtúil a dhéanamh ar cheangal comhoibríoch GBTA leis an gcainéal, d’úsáideamar múnla inar féidir le ceachtar fo-aonad an chéad mhóilín coscaire a cheangal tar éis imoibriú démhóilíneach le tairiseach díthiomsaithe Kd1 (Fíor 2c, Fo 1, OO+ B ⇆ BO* ). Ceanglaíonn an ceangal leis an gcainéal staid a ghlacadh ina gceanglaíonn na fo-aonaid fholmha atá fágtha leis an gcosc tar éis imoibriú démhóilíneach uathúil le tairiseach díthiomsaithe Kd2, áit a bhfuil Kd2 Is í an líne dhubh soladach i bhFíor 2c oiriúnacht chothromóid an mhúnla don chuar freagartha tiúchana turgnamhacha, rud a thugann Kd1 de ~290 μM agus Kd2 de ~29 μM (Rannóg modhanna, cothromóid (6)). Déanann an tsamhail cur síos freisin ceangal 2GBI, áit a bhfuil Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fíor 2d).I Hv1 monaiméireach, níl ach suíomh ceangailteach amháin agus Kdm amháin (O° + B ⇆ B°).I gcás GBTA, tá Kdm timpeall 54 μM, atá níos cosúla le Kd1 ná Kd2 (Fíor 2d).I bhfocail eile, tá suíomh ceangailteach an mhonaiméir i gcumraíocht (O°) níos cosúla leis an staid ard-chleamhnas (BO*) ná leis an íseal- staid cleamhnais (OO) an dimer, is dócha mar gheall ar deireadh a chur leis an comhéadan idir fo-aonaid.
Mar a léiríodh cheana do 2GBI32, fuaireamar amach gur shocht GBTA sruthanna Hv1 tríd an gcainéal a bhlocáil nuair a bhí sé oscailte seachas é a dhéanamh níos deacra é a oscailt (Fíor Forlíontach 2a,b,d). mar fhreagra ar athpholarú membrane, ach níor breathnaíodh an feiniméan seo i GBTA (Fíor Fhorlíontach 2c). I láthair díghníomhaithe Hv1 i láthair 2GBI, ní féidir na geataí i ngach fo-aonad a dhúnadh go dtí go bhfágann an bacadóir an suíomh ceangailteach (an “ meicníocht geata coise”), agus dícheanglaíonn 2GBI níos moille ná na geataí dúnta. Má dhéantar fo-aonad Hv1 amháin a dhíbhlocáil agus a dhúnadh, agus an fo-aonad in aice láimhe fós bactha, éiríonn dícheangal na móilíní 2GBI atá fágtha níos moille (gabháil bactha). ní sheolann ach fo-aonad bactha amháin prótóin go neamhbhuan sula ndúnann siad agus cuireann siad go mór leis an sruth eireaball atá ag lobhadh go mall.
Tá an toradh nár mhoilligh meath na sruthanna eireaball Hv1 go suntasach i láthair GBTA (Fíor Fhorlíontach Fíor 2c) ag teacht le meicníocht cheangailteach sineirgisteacha don bhlocálaí seo (Fíor 2d). Chomh luath agus a dhícheanglaítear móilín GBTA ón bhfo-aonad Hv1 , Titeann an cleamhnas an seachfhreastalaithe leis an bhfo-aonad in aice le thart ar 10-huaire, i bhfabhar an phróisis neamhcheangailteach.Ciallaíonn sé seo go bhfuil an dara móilín GBTA seans i bhfad níos airde de unraveling sula bhfaigheann sé gafa sa chainéil. a tháirgeadh ach fo-aonad blocála amháin meastar a bheith i bhfad níos flúirseach i láthair GBTA ná i láthair 2GBI, as a dtagann meath níos tapúla eireaball sruth.
Ionas go mbeidh GBTA ina gceangal go comhoibríoch leis an dá fho-aonaid Hv1, ní mór na suíomhanna ceangailteacha a bheith cúpláilte go allosterically.Ní mór do gach láithreán ceangailteach a bheith in ann: 1) slabhra imeachtaí a spreagadh a dhéanann cumarsáid le fo-aonaid in aice láimhe atá ceangailte leis an inhibitor, agus 2) an t-idirghabháil a dhéanamh. trasdul ó cheangail íseal-chleamhnas go dtí ceangailteach ard-chleamhnas.Réasúníomar dá gcuirfeadh iarmhair ar leith laistigh den láithreán ceangailteach leis an bpróiseas comhoibríoch, gur cheart go n-athródh a gcuid sóchán comhéifeacht Hill de chuar comhchruinnithe freagartha cosc GBTA ar Hv1.Iarmhair D112, F150 , Taispeánadh roimhe seo go raibh S181 agus R211 mar chuid de thimpeallacht cheangailteach 2GBI29 agus rinneamar hipitéis go mbeadh baint acu mar an gcéanna le ceangailteach GBTA (Fíor 3A). Thomhaiseamar cuair comhchruinnithe coisctheacha GBTA do chainéil mutant D112E, F150A, S181A , agus R211S (Fíor 3) agus chuir siad a gcuid comhéifeachtaí Hill i gcomparáid leo siúd de chineál fiáin Hv1, ag baint úsáide as 2GBI mar thagairt.Tá iarmhair V109 ar an aghaidh céanna den deighleog S1 mar D112 agus tá cas helical breise taobh istigh den chill.Since Ní raibh baint ag V109 le ceangailteach 2GBI29, d’úsáideamar an mutant V109A mar rialú (Fíor. 3b).
(a) Iarmhair Hv1 a mholtar a bhfuil baint acu le ceangailteach díorthach guainidín. Timpeallaíonn cuair ghorma daise ar shlabhraí molta roimhe seo a idirghníomhaíonn le codanna éagsúla de chomhdhúil 2GBI29.(bf) Cosc ar thiúchan-spleách ar na mutants Hv1 léirithe ag comhdhúile 2GBI (cian) agus GBTA ( dearg dorcha).Léiríonn gach pointe an meán chosc ar 3 go 12 tomhais ± SD V109 mar control.Curves diúltach Hill oireann a úsáidtear a fháil luachanna Kd dealraitheach (féach Tábla Forlíontach 1).The Hill comhéifeachtaí (h) a thaispeántar i Socraíodh na histeagraim inset ó na n-oireann a thuairiscítear i bhFíoracha Forlíontacha 3 agus 4.Tagairtí h luachanna do Hv1 WT léirithe mar línte briste. Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha staitistiúla idir pasáistí mutant agus WT (p Fuaireamar amach gur laghdaigh an sóchán D112E go suntasach an chomhéifeacht Hill (p Tá an toradh go bhfuil comhéifeacht Hill le haghaidh ceangailteach GBTA níos airde ná 1 sa dimer Hv1 agus go dtiocfaidh sé ~1 sa chainéal monaiméireach (Fíor 2b) i gcomhréir le hidirghníomhaíochtaí allosteric a bheith ann idir na suíomhanna ceangailteacha sa dá fho-aonaid. an cás, ba cheart go mbeadh comhéifeacht Hill de GBTA ceangailteach leis an dimer a bhfuil an bacadóir ceangailte le fo-aonad amháin ~1.Tástáladh againn an tuar seo sa dimer nasctha Hv1 F150A-WT (Fíor 4a), áit a bhfuil an cleamhnas an F150A Bhí fo-aonad do GBTA níos mó ná 2 ordú méide níos airde ná ceann an fho-aonaid WT (Fíoracha 1c agus 3d). Ansin thomhaiseamar cuair comhchruinnithe freagartha chun an fo-aonad WT a chosc ag tiúchan basal de 2 μM GBTA.Ag an tiúchan seo , táthar ag súil go gceanglóidh an bacadóir thart ar 99% den fho-aonad F150A agus (a) Léaráid scéimreach den diméir acomhal F150A-WT a úsáidtear chun an leathchainéal blocála ({F150A}b-WT/BAO*) a ghiniúint. Taispeánann diamaint bhána suíomh an tsócháin. Sna stáit BAO* agus BA*B*, meastar go mbeidh cleamhnas an fho-aonaid F150A níos airde ná mar atá san fho-aonad WT.(b) Sruthanna prótóin ó chainéil F150A-WT tomhaiste mar fhreagra ar athruithe i bpoitéinseal scannán ó −80 mV go +120 mV.pHi = pHo = 6.0 Léiríonn rianta liath na sruthanna a thomhaistear in éagmais coscaire. Léiríonn an rian dubh (rialú) an sruth a thomhaistear tar éis 2 μM GBTA a chur leis. ({F150A}b-WT). Mar thoradh ar mhéadú breise ar thiúchan GBTA bhí bac ar an bhfo-aonad WT (rianta oráiste agus dearg). Fo-aonad F150A). Seasann gach pointe don mheán-chosc ± SD de 3 go 7 dtomhas. Ba iad na cuair oireann Hill a úsáideadh chun na luachanna dealraitheacha Kd a thuairiscítear i dTábla Forlíontach 1 a fháil. Cinntíodh na comhéifeachtaí Hill a thaispeántar sna histeagraim inset ó na n-oireann a tuairiscíodh i bhFíoracha Forlíontacha 3 agus 4.The h values of Hv1 WT are léirithe mar línte briste. Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha staitistiúla i gcomparáid le WT dimer Hv1 (p Ós rud é gur tomhaiseadh cosc GBTA ar Hv1 sa chainéal oscailte, rinneamar réasúnaíocht go bhféadfaí comhoibríocht ceangailteach GBTA a úsáid chun staidéar a dhéanamh ar mheicníocht na cúplála idirfho-aonad sa stát oscailte. 22 agus beartaíodh go ndéanfaí an cúpláil idirfho-aonad a bhaineann le geataí a idirghabháil ag an bhfearann corna corna cíteaplasmach (CCD) 22,25. Dá bhrí sin, d'fhiafraigh muid an bhfuil baint ag CCD freisin leis an gcúpláil idir suíomhanna ceangailteacha GBTA sa stát oscailte.Triglycine Léiríodh sócháin ag an gcomhéadan idir blúire transmembrane S4 agus an fearann coiled-coil i staidéir níos luaithe chun an fearann seo a dhíchúpláil ón gcuid eile den chainéal agus sláine dimerization á choinneáil. Dá bhrí sin, rinneamar tástáil ar éifeacht sócháin V220G, K221G agus T222G (Fíor .5a, GGG mutant) ar GBTA ceangailteach coopeativity. Fuaireamar laghdú neamhshuntasach go staitistiúil (p> 0.05) sa chomhéifeacht Hill de GBTA ceangailteach le cainéil GGG i gcomparáid le cineál fiáin (Fig. 5c), le tuiscint go ainneoin a ról i choinneáil ar an dhá fho-aonad tábhachtach le chéile, ach ní dhéanann CCD idirghabháil dhíreach ar chúpláil allosteric idirfho-aonad idir suíomhanna ceangailteacha GBTA.
(a) Léaráid scéimreach den diméir Hv1 le sóchán tríghlicín ag an taobh istigh de S4 atá deartha chun cur isteach ar an gcúpláil idirfho-aonad arna idirghabháil ag an bhfearann corna corna cíteaplasmach (saigheada gorma).(b) Léiriú scéimreach de diméir Hv1 agus dimers ligation le sócháin léirithe, deartha chun tástáil a dhéanamh ar blúirí S1 a bhfuil baint acu le cúpláil idir fo-aonaid (saigheada gorma).(c–h) 2GBI (cian) agus GBTA (dorcha dearg) bac ar na tógálacha a luaitear ar bhealach tiúchan-spleách. Léiríonn gach pointe an meánchoisc ± SD de 3 go 10 dtomhas. Ba oiriúnach Hill é an cuar a úsáideadh chun luachanna dealraitheacha Kd a fháil (féach Tábla Forlíontach 1). Socraíodh comhéifeachtaí cnoc sna histeagraim idirshuite mar a thuairiscítear sa chuid Modhanna (féach Fíoracha Forlíontacha 3 agus 4).Tagairt h luachanna do Taispeántar Hv1 WT mar línte briste. Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha staitistiúla idir pasáistí mutant agus WT (p Ós rud é gur dhiúltaigh muid CCD mar idirghabhálaí díreach de cheangail comharchumann GBTA, d'iarramar an bhfuil baint ag idirghníomhaíochtaí idir VSDanna le cúpláil allosteric idir láithreáin ceangailteach. Fuaireamar amach gur cuireadh deireadh le comhoibríocht ceangailteach GBTA trí shóchán coimeádach iarmhar D112 (Fíor 3c) atá suite. sa deighleog transmembrane S1.S1 tá dhá iarmhar luchtaithe diúltach, E119 agus D123, atá suite ar an taobh céanna den helix mar D112, ach níos gaire don foirceann seachtrach 24 den fragment.Insamhaltaí dinimic mhóilíneach Luath le fios go raibh na hiarmhair nasctha go D112 trí línte uisce36,37. Dá bhrí sin, rinneamar tástáil ar cibé an bhfuil baint ag E119 agus D123 le cúpláil allosteric idir láithreáin ceangailteach GBTA (Fíor 5b). ach ar an taobh eile den helix S1 (Fig. 5b).
Thomhaiseamar an cosc tiúchan-spleách ar chainéil E119A, D123A agus K125A ag 2GBI agus GBTA agus fuarthas amach nár athraigh sócháin E119A agus K125A go mór comhéifeacht Hill de cheachtar coscaire i gcomparáid le cineál fiáin (p> 0.05, Fíor 5d,i ) ). Ar an láimh eile, laghdaigh sóchán D123A go suntasach an chomhéifeacht Hill de GBTA (p 0.05/14).
Ós rud é gur tháinig athrú láidir ar chomhoibriú ceangailteach GBTA de bharr neodrú an luchta ag seasamh 123 ar an dá fho-aonaid, cé nach raibh ach éifeacht bheag ag aisiompú an mhuirir ar an dá fho-aonaid, leathnaíomar an anailís chun fo-aonad amháin a áireamh leis an gcainéal inbhéartaithe muirear.We ghin dimers nasctha Hv1 le hionadú D123R i bhfo-aonad C-críochfort (Fíor 5b) agus thomhais an cosc comhchruinnithe freagartha ag GBTA agus 2GBI.D'aimsigh muid go raibh comhéifeacht Hill de cheangal GBTA le cainéil WT-D123R i bhfad níos airde ná sin de chineál fiáin Hv1 (p Fuaireamar amach freisin gur chuir an sóchán D112E deireadh leis an méadú ar chomhéifeacht Hill ceangailteach GBTA arna dtáirgeadh ag an gcúlra WT-D123R (Fíor 5b,h agus Forlíontach Fíor. 4). Cuireadh deireadh leis an éifeacht ar chomhéifeacht Hill de cheangail 2GBI freisin ( Fíor 5h agus Fíor 3. Forlíontach). Tugann na torthaí seo le fios nach ionann an cúpláil allosteric feabhsaithe idir fo-aonaid de bharr muirir chontrártha ag suíomh 123 agus comhoibríocht cheangailteach níos láidre nuair a chuirtear isteach ar an suíomh ceangailteach ag suíomh D112.
Rinneamar réasúnaíocht dá mbeadh iarmhair D123 ar fho-aonaid oscailte in aice láimhe gar go leor chun idirghníomhú go leictreastatach lena chéile, go ndéanfaí an t-idirghníomhú éarthach idir na muirir dhiúltacha a thiontú go teaglaim de luchtanna diúltacha agus deimhneacha trí aigéad aspartach a chur in ionad arginine. idirghníomhú tarraingteach eatarthu. Fo-aonaid amháin (dimer WT-D123R).Is féidir le hidirghníomhaíochtaí tarraingteacha an comhéadan idir foircinn sheachtracha na blúire S1 a neartú, rud a fhágann go mbeidh cúpláil allosteric níos láidre idir na fo-aonaid agus méadú ar chomhoibriú ceangailteach GBTA.
Chun tacú leis an hipitéis seo, d'fhéachamar le bealach chun an comhéadan idir foircinn sheachtracha an deighleog S1 a neartú, atá difriúil ón athrú muirear ag seasamh 123.Lee et al.Mutation d'iarmhar Hv1 I127 go cistéin fuarthas roimhe seo. chun tras-nascadh spontáineach a bheith mar thoradh air17. Ina theannta sin, léirigh struchtúr criostail an VSD chimeric Hv1-CiVSP go bhfuil I127 scartha ó fhoirceann seachtrach an helics S1 ag aon iarmhar amháin24.D'iarramar mar sin an bhfuil nasc comhfhiúsach á fhoirmiú idir cistéin ag suíomh 127, a bhfuiltear ag súil go mbeidh idirghníomhaíocht S1-S1 níos láidre mar thoradh air, tá éifeacht aige ar chomhoibríocht cheangailteach GBTA cosúil leis an méid a breathnaíodh tríd an lucht a athrú ag suíomh 123 .
Thomhaiseamar an cosc tiúchan-spleách ar Hv1 I127C ag GBTA agus 2GBI i láthair agus easpa 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fíor 6a). Ag an am céanna leis an inhibitor leis an réiteach intracellular, an laghdú. gníomhaire a chuirtear leis an réiteach extracellular.A dimer nasctha le hionadú cistéin i ach amháin fo-aonad (WT-I127C) mar rialú diúltach (Fíor 6a).Ní raibh muid in ann a thomhas ar aon éifeacht tras-nascadh intersubunit spontáineach idir na fo-aonaid I127C ar chosc 2GBI, toisc go raibh an chomhéifeacht Hill le haghaidh ceangailteach I127C go Hv1, le nó gan βME, difriúil go suntasach leis an gcomhéifeacht le haghaidh ceangailteach le dimers ionadach monocysteine. Ní fhéadfadh an chomhéifeacht Hill idirdhealú a dhéanamh idir WT-I127C (Fíor 6b agus Forlíontach Fíor. 3). I gcodarsnacht lom, thomhais muid an éifeacht drámatúil trasnascadh idirfho-aonad spontáineach ar GBTA inhibition.The Hill comhéifeacht chun ceangailteach le Hv1 I127C in éagmais βME (crosslink ar) i bhfad níos airde ná mar a thomhas i láthair βME (crosslink off) nó ag baint úsáide as WT-127C a nascadh an dimer (in éagmais crosslink) (Fíor 6c agus Forlíontach Fíor. 4), rud a léiríonn go bhfuil an cúplála allosteric Cuireann na torthaí seo go mór lenár léirmhíniú go bhfuil an t-idirghníomhú tarraingteach leictreastatach aspartate agus arginine ag seasamh 123 sa dimer WT-D123R mar thoradh ar chúpláil allosteric méadaithe idir láithreáin cheangailteach. na fo-aonaid.
Déantar cúpláil stáit oscailte a idirghabháil trí idirghníomhaíochtaí fisiceacha díreacha idir foircinn sheachtracha na míre S1 sa dá fho-aonad.
(a) Léiriú scéimreach de dimers Hv1 mutant agus dimers nascóirí, atá deartha chun imscrúdú a dhéanamh ar conas a théann trasnaisc idirfho-aonad cistéin i bhfeidhm ar chomhoibríocht cheangailteach GBTA.(bd) Cosc ar thiúchan-spleách ar na tógálacha sonraithe ag 2GBI (b,d) agus GBTA (c, e) i láthair nó in éagmais 10 mM βME i dtuaslagán eischeallach. Léiríonn gach pointe an meánchoisc ± SD de 3 go 10 dtomhas. Feisteas Hill a bhí sa chuar a úsáideadh chun luachanna Kd a fháil (féach Tábla Forlíontach 1). Cinntíodh comhéifeachtaí cnoc sna histeagraim inset ó na n-oireann a tuairiscíodh i bhFíoracha Forlíontacha 3 agus 4. Léiríonn réiltíní i (c,e) difríochtaí suntasacha staitistiúla idir coinníollacha coiscthe GBTA éagsúla (p 0.05).
Fuaireamar amach freisin, in éagmais βME, go raibh comhéifeacht Hill de GBTA ceangailteach leis an dimer D112E I127C Hv1 i bhfad níos airde ná mar a tomhaiseadh i láthair gníomhairí laghdaithe (Fíor 6e agus Forlíontach Fíor. 4), rud a thugann le tuiscint go bhfuil an sóchán D112E níor chuir deireadh leis an méadú ar chomhoibriú ceangailteach GBTA mar thoradh ar thrasnascadh cistéin 127.The Hill comhéifeacht ceangailteach 2GBI go D112E, ní raibh tionchar suntasach ag an sóchán D112E (Fíor 1).6d agus Forlíontach dimers I127C Hv1 freisin Fíor 3).
Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na torthaí seo le fios go gcuirtear feabhas ar cheangal GBTA tríd an idirghníomhú idir foircinn sheachtracha na blúirí S1 i bhfo-aonaid Hv1 in aice láimhe trí idirghníomhaíochtaí tarraingteach leictreastatacha nó trí bhannaí comhfhiúsacha a fhoirmiú idir cistéiní ionadacha Méadaíonn cúpláil allosteric idir láithreáin agus mar thoradh ar chomhoibríocht cheangailteach. Cé gur féidir deireadh a chur le héifeacht idirghníomhaíochtaí tarraingteach leictreastatacha ar chomhoibríocht trí shóchán D112E, ní féidir le héifeacht bannaí comhfhiúsacha.
Inár n-iniúchadh ar an spás ceimiceach atá ar fáil le haghaidh díorthaigh guanidine ceangailteach le cainéil Hv1, fuair muid amach go bhfuil spleáchas tiúchan níos géire ag 2-guanidinothiazoles cosúil le GBTA ná 2-guanidinobenzimidazoles (Fíor 1c).The Hill anailís comhéifeacht GBTA ceangailteach don dá dimeric agus bealaí monaiméireacha (Fíor 2a,b) agus chuig an gcainéal dimeric ina raibh fo-aonad amháin réamhcheangailte leis an inhibitor (Fíor 4) thug dúinn a thabhairt ar an tátal go bhfuil an cosc ar Hv1 ag GBTA Is próiseas sineirgisteacha an gníomh, agus tá suíomhanna ceangailteacha na gcomhdhúile sa dá fho-aonaid cúpláilte go allosterically. Tugann an fhionnachtain go gceanglaíonn GBTA leis an gcainéal oscailte, mar a léiríodh roimhe seo don chomhdhúil ghaolmhar 2GBI32, gur féidir cúpláil allosteric a mheas go sonrach sa stát oscailte. bhí sé in ann cur síos cainníochtúil a dhéanamh ar chosc Hv1 ag GBTA (Fíor 2c) agus míniú a thabhairt ar na héifeachtaí éagsúla atá ag 2GBI agus GBTA ar lobhadh sruthanna eireaball cainéil tar éis athpholarú membrane, rud a thacaíonn lenár léirmhíniú ar an bpróiseas ceangailteach.
Is é an comhéifeacht Cnoc uasta is féidir a bhaint amach i próitéin allosteric le dhá shuíomh ceangailteach (cosúil le Hv1) 2.We thomhas GBTA chun ceangal Hv1 cineál fiáin le comhéifeacht 1.31, a mhéadaigh go 1.88 i Hv1 I127C.The fuinneamh saor sineirgisteacha, ba é an difríocht idir fuinneamh saor in aisce ceangailteach na suíomhanna cleamhnais is ísle agus is airde (féach Modhanna), ná 1.3 kcal/caochÚn i gcás cineál fiáin Hv1 agus 2.7 kcal/caochÚn i gcás Hv1 I127C.An ceangailteach ocsaigine go haemaglóibin an sampla is cáiliúla agus dea-staidéar ar an bpróiseas comhoibrithe38.For haemaglóibin daonna (tetramer le ceithre shuíomh ceangailteach allosterically ceangailte), raonta comhéifeacht Hill ó 2.5-3.0, le luachanna idir 1.26 agus 3.64 kcal/mol, ag brath ar choinníollacha turgnamhacha38. Mar sin, i dtéarmaí na fuinnimh dhomhanda, níl difríocht shuntasach idir comhoibríocht an cheangail GBTA do Hv1 agus an chomhoibríocht de cheangal O2 le haemaglóibin nuair a chuirtear san áireamh na huimhreacha difriúla fo-aonaid próitéine sa dá chóras.
Inár múnla sineirgíochta, is é an toradh a bhíonn ar cheangal móilíní GBTA le fo-aonad amháin ná méadú ar chleamhnas ceangailteach an fho-aonaid in aice láimhe. athruithe sna hidirghníomhaíochtaí idir fo-aonaid.Mar fhreagra ar na hathruithe seo, athraíonn fo-aonaid in aice láimhe a suíomhanna ceangailteacha, rud a fhágann go bhfuil ceangailteach GBTA níos déine ann. Le linn an phróisis seo, tá an aspartate S1 D112 freagrach as an suíomh ceangailteach a bhaineann le cleamhnas méadaithe a athshocrú.D112 Taispeánadh roimhe seo gur cuid de chonair tréscaoilte prótóin Hv1 é agus go bhfeidhmíonn sé mar scagaire roghnaíochta27,28. Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil na scagairí roghnaíochta sa dá fho-aonad Hv1 cúpláilte go allosterically sa stát oscailte. Taispeánann Fíor 7a neas-shuíomh ceangailteach GBTA agus suíomh na n-iarmhar D112, D123, K125 agus I127 ar scéimreach den Hv1 VSD bunaithe ar struchtúr criostail an chimera Hv1-CiVSP.Taispeántar na treoracha a mholtar do chúpláil allosteric a bhaineann le deireadh eischeallach S1 le saigheada dubha.
(a) Scéimreach an Hv1 VSD.Bunaithe ar struchtúr criostail an chimera Hv1-CiVSP, taispeántar na codanna helical a bheith sorcóireach.Sa chumraíocht seo, cumascann foirceann istigh na míre S4 leis an CCD (ní thaispeántar). Taispeántar láithreacha tuartha GBTA faoi cheangal mar ubhchruthacha glasa. Léiríonn saigheada dubha cosáin a bhaineann le cúpláil allosteric idir láithreáin cheangailteach i dhá fho-aonaid in aice láimhe.Tá suíomhanna na n-iarmhar S1 imscrúdaithe marcáilte le sféir daite.(b) Léaráid scéimreach d'fho-aonaid Hv1 socraithe in dhá chumraíocht dimer éagsúla mar atá le feiceáil ó thaobh extracellular an plána membrane.Ar an bpainéal ar chlé, tá an comhéadan dimer déanta ag an helix S4.Rotation an dá VSDs 20 céim deiseal timpeall ais ingearach leis an eitleán membrane, ag gabháil leis deighilt foircinn sheachtracha an dá héileacaptar S4 (saigheada daite), cruthaítear an socrú a thaispeántar ar dheis.Sa chumraíocht seo, ceadaítear d'iarmhair D123 agus I127 ó fho-aonaid in aice láimhe teacht gar dá chéile.(c) Léiriú scéimreach den CiVSP VSD sa chumraíocht dimer le fáil sa struchtúr criostail 4G80. Freagraíonn Seasamh P140 i CiVSP le seasamh D123 i Hv1.
Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil baint ag an idirghníomhú leictreastatach repulsive idir iarmhar 123 (123D/123D nó 123R/123R) le “gnáthleibhéal” comhoibríochta ceangailteach GBTA sa stát oscailte agus aistríonn sé an t-idirghníomhú ó éaradh go Attracted (123D/123R) , comhar méadaithe (Fíor 5g).Táthar ag súil go dtiocfadh méadú ar chomhoibritheacht freisin as an idirghníomhú éarthach le hionadú alanine a bhaint. Is é an míniú a thugtar air ná go bhféadfadh an éifeacht díchobhsaithe a bhaineann le hiarmhair hidreafóbach a chur i dtimpeallacht hidreafhileach níos mó ná an éifeacht chobhsaithe de bharr deireadh a chur le hidirghníomhaíochtaí éaracha idir iarmhair D123, rud a d’fhág go raibh laghdú foriomlán ar chomhoibriú ceangailteach. Thuairiscigh Mony et al.39 le déanaí go raibh inrochtaineacht tuaslagóirí ag Méadaítear seasamh D171 de Ciona gutis Ci-Hv1 (a fhreagraíonn do D123 i Hv1 daonna) nuair a ghníomhachtaítear é, ag tacú leis an nóisean go bhfuil D123 suite i dtimpeallacht hydrophilic sa stát oscailte.
Is eol go dtarlaíonn geataí cainéil Hv1 trí trasaistrithe iolracha19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 fuarthas amach, tar éis dípolarú membrane, go dtéann braiteoir voltais Ci-Hv1 faoi athrú comhfhoirmiúil a fhágann an cainéal gníomhachtaithe ach fós dúnta. , agus ina dhiaidh sin trasdul ar leith a chuireann faoi deara prótóin seoltacht oscailte sa dá fo-aonad cosán. Rinneadh monatóireacht ar athrú comhfhoirmiúil an braiteoir voltais ag voltas-clamp fluaraiseacht, agus fuarthas amach go raibh an dara trasdul isteach go roghnach ag an mutation ag seasamh D171. Tá suaitheadh an chomhartha fluaraiseacha comhsheasmhach le láithreacht idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir iarmhair D171 na bhfo-aonaid in aice láimhe ag pointe éigin feadh chomhordanáidí imoibriúcháin an athraithe comhfhoirmiúil. Tá an léirmhíniú seo comhsheasmhach lenár gcinneadh go n-idirghníomhaíonn an t-iarmhar D123 go leictreastatach sa stát oscailte agus eadránaíonn sé cúpláil allosteric idir suíomhanna ceangailteach GBTA.
Mhol Fujiwara et al25 go leathnódh comhéadan dimer an fhearainn corna corna cíteaplasma isteach sa scannán chun dhá héilí S4 a chuimsiú (Fíor 7b, painéal ar chlé). an VSD iomlán agus anailís fheidhmiúil ar an réigiún ag nascadh an helix S4 agus an CCD.In éagmais grádán pH transmembrane, cainéil Hv1 gá depolarization membrane suntasach a oscailt, agus traslinking cistéin tharlaíonn faoi choinníollacha ina bhfuil an cainéal dúnta den chuid is mó. Mar sin, is dócha go léiríonn an comhéadan braite S4-S4 an chumraíocht fo-aonad lasmuigh den stát. Tá fianaise faighte ag staidéir eile maidir le rannpháirtíocht S1 agus S2 in idirghníomhaíochtaí idirfho-aonad le linn gating17,21,26 a thugann le tuiscint gur féidir le cainéil cumraíochtaí fo-aonaid éagsúla a ghlacadh san oscailt agus stáit dúnta, smaoineamh atá ag teacht le torthaí Mony et al. Bogann S1 39 le linn geataí.
Anseo, léirímid, sa stát oscailte, go bhfuil foircinn extracellular an helix S1 gar go leor chun tacú le hidirghníomhaíochtaí leictreastatacha díreacha a dhéanann idirghabháil ar chúpláil allosteric idir fo-aonaid. Sa chumraíocht dimer le hidirghníomhaíochtaí leathnaithe S4-S4, tá na helices S1 ró-fhada. seachas a chéile chun idirghníomhú go díreach. Mar sin féin, thug rothlú deiseal 20° ar an dá fho-aonaid VSD timpeall ais ingearach leis an eitleán membrane, in éineacht le scaradh foircinn sheachtracha an dá héileacaptair S4, cumraíocht S1-S1 comhsheasmhach. lenár dtorthaí (Fíor 7b, painéal ar dheis). Molaimid an chumraíocht seo don chainéal sa stát oscailte.
Cé go meastar go bhfeidhmíonn an einsím CiVSP mar mhonaiméir, déantar struchtúr criostail a VSD scoite a ghabháil i stát dimer. le haghaidh Hv1 (Fíor 7c). Sa dimer CiVSP, ba é an t-iarmhar is gaire ón bhfo-aonad cóngarach ná proline ag suíomh 140 (Fíor 7c). Rud suimiúil, comhfhreagraíonn P140 i CiVSP do shuíomh D123 i Hv1.Tá an chosúlacht i gcumraíocht fo-aonad idir Hv1 agus tugann CiVSP dimers le fios go bhfuil claonadh intreach ag VSDanna na bpróitéiní seo comhéadan a chruthú ina n-idirghníomhaíonn foircinn eischeallacha S1.
Mar gheall ar an ról riachtanach atá ag Hv1 i ngníomhacht ceall speirme, is sprioc tarraingteach drugaí é an cainéal seo chun torthúlacht fireann a rialú. Ina theannta sin, tá sé léirithe go ndéanann gníomhachtú Hv1 i microglia téarnamh níos measa ó stróc ischemic. Fuarthas amach go raibh baint ag gníomhaíocht Hv1 le níos ísle. marthanacht in othair a bhfuil ailse chíche 12 nó ailse cholaireicteach 13 orthu agus meastar go gcuireann sé le hurchóideacht B-chealla 11 .Dá bhrí sin, is féidir drugaí móilín beaga a dhíríonn ar Hv1 a úsáid mar ghníomhairí neuroprotective nó mar theiripí frith-ailse. D’fhéadfadh fo-aonad Hv1 oscailte, as a dtiocfaidh méadú ar an gcleamhnas ceangailteach, forbairt ar dhrugaí níos láidre a dhíríonn ar chainéil Hv1.
Rinneadh mutagenesis de Hv1 daonna faoi stiúir an tsuímh ag baint úsáide as teicnící caighdeánacha PCR. Sa tógáil Hv1NCCiVSP, cuireadh iarmhair 1-113 agus 240-576 de CiVSP18 in ionad iarmhair 1-96 agus 228-273 de Hv1. tá críochfort C fo-aonad amháin nasctha le N-críochfort an dara fo-aonad tríd an nascóir GGSGGSGGSGSGGSGG. Rinneadh na plasmid pGEMHE ina raibh na tógálacha éagsúla a líneáil le heinsímí srianta Nhe1 nó Sph1 (New England Biolabs) agus rinneadh sintéis RNA leis an T7 mMessage trealamh trascríobh Meaisín (Ambion).1-3 lá roimh thomhais leictreifiseolaíocha, cuireadh cRNA isteach i úicítí Xenopus (50 nl in aghaidh na cille, 0.3-1.5 μg/μl). Fuarthas úicítí Céim V agus VI ó Xenopus laevis (NASCO) ó Ecocyte Bioscience. Tar éis instealladh RNA, coinníodh cealla i meán ND96 ina raibh 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, gentamicin 100 μg/ml, pH ° 7.2 18 .
2-guanidino-beinsimidasól[1], 2-guanidino-beinsitiasól[2], (4-meitil-1,3-thiazol-2-il)guanídín [5], (5-bróma-4 -meitil-1,3 -thiazol-2-il)guanidine) [6], eitile 2-guanidino-5-meitil-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], eitile 2-guanidino-4- meitil-1,3-thiazole- Bhí 5-carboxylate [9] agus (2-guanidino-4-meitil-1,3-thiazol-5-il)aicéatáit eitile [10] ó Sigma-Aldrich.Famotidine [7] ó MP Biomedicals.1-[4] Bhí -(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-il]guanidine[11] agus 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3- Thiazol-2-il]guanidine [12] ó Matrix Scientific.Tá na comhdhúile seo den íonacht is airde atá ar fáil go tráchtála.Tuaslagadh iad i DMSO tirim chun tuaslagán stoic 100 mM a ghiniúint, a caolaíodh ansin sa tuaslagán taifeadta ag an tiúchan deiridh a bhí ag teastáil. Rinneadh comhdhúile 3 agus 4 a shintéisiú thíos le ar a laghad 99% íonachta.
Le fionraí de hidreaclóiríd 2-aimín-4-(trifluoromethyl) benzenethiol (1.02 g, 4.5 mmol) i 25 ml d'aigéad hidreaclórach uiscí (2.5 N) dicyandiamide soladach (380 mg, 4.5 mmol), agus an meascán ilchineálach mar thoradh air. Fuaraíodh an meascán imoibriúcháin go teocht an tseomra agus neodaíodh é trí hiodrocsaíd photaisiam 10N a chur leis de réir a chéile. Scagadh an deascán bán a foirmíodh, nite le huisce fuar (3 × 50 ml), triomaíodh é in oigheann ( 65 °C) ar feadh roinnt uaireanta, agus ansin athchriostalú ó aicéatáit eitile/éitear peitriliam chun solad bán (500 mg, 48 %) a thabhairt; mp 221–222 °C (solas 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (s an-leathan, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 H), 7.92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z luach ríofa.Chun C9H8F3N4S (M + H) +: 26,1. : 261.0419.
Téiteadh nafta[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), arna shintéisiú mar a thuairiscítear roimhe seo, go 200 °C i ndabhach ola i bpromhadán beag tástála. 300 mg (farasbarr mór) cianamíd agus 1.0 ml conc.Chun an comhdhúil te, cuireadh aigéad hidreaclórach leis go tapa agus coinníodh an meascán sa dabhach ola ar feadh thart ar 2 nóiméad, agus le linn an ama sin galaithe an chuid is mó den uisce.Fuaraíodh an meascán imoibriúcháin ansin go teocht an tseomra agus an t-ábhar soladaithe mar thoradh air. briste i bpíosaí beaga é agus nite le huisce chun solad éagruthach buí éadrom a sholáthar.(38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 H, J = 8.3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z luach ríofa. , fuarthas: 243.0704.
Tomhaiseadh sruthanna prótóin i bpaiste inmheánacha agus seachtracha úicítí ag léiriú struchtúir éagsúla ag baint úsáide as aimplitheoir Axopatch 200B arna rialú ag Axon Digidata 1440A (Feistí Móilíneacha) le bogearraí pClamp10.Tá an comhdhéanamh céanna ag réitigh intracellular agus eischeallacha: 100 mM 2-(N-morpholino )aigéad eatánsulfónach (MES), mesilate teitritilamóiniam 30 mM (TEA), clóiríd TEA 5 mM, gliocól-bis(2-aminoethil eitiléine)-N,N,N',N'-aigéad teitraaicéiteach (EGTA), coigeartaithe go pH 6.0 le hiodrocsaíd TEA.Rinneadh gach tomhas ag 22 ± 2 °C.Tá friotaíocht rochtana 1.5–4 MΩ ag an bpípéad. Scagadh rianta reatha ag 1 kHz, sampláladh iad ag 5 kHz agus rinneadh anailís orthu le Clampfit10.2 (Feistí Móilíneacha ) agus Origin8.1 (OriginLab).
Tugadh réitigh ina raibh tiúchain éagsúla inhibitor Hv1 agus i gcásanna áirithe 10 mM βME isteach sa dabhach trí dhomhantarraingt trí iomadúil a bhí ceangailte le córas comhla perfusion VC-6 (Warner Instr.), a cuireadh tríd na bogearraí pClamp TTL (Transistor-). Logic trasraitheora) signals.Rinneadh turgnaimh perfusion Mear ag baint úsáide as peann luaidhe perfusion il-feadán (AutoMate Sci.) Le tip seachadta trastomhas 360 μm suite os comhair paiste pípéad. Chinneadh cosc channel ag tomhais amperometric isochronal ag deireadh an +120 mV depolarizing bíge.GV tomhais mar a thuairiscítear roimhe seo18,20.Taifeadadh sruthanna eireabaill ag -40 mV tar éis céimeanna dípolarúcháin ag voltais éagsúla ó -20 mV go +120 mV mura sonraítear a mhalairt. a úsáidtear chun meath an tsrutha a cheartú 18 .Oireann an graf GV don chothromóid Boltzmann:
Socraíodh na tairisigh díthiomsaithe dealraitheacha (Kd) do chomhcheangail éagsúla de chainéil agus de choscóirí (Tábla Forlíontach 1) trí spleáchas comhchruinnithe an choisc (meánluachanna % inhib) a fheistiú leis an gcothromóid Hill:
áit arb é [I] tiúchan an choisceora I agus is é h an chomhéifeacht Hill. Chun an chomhéifeacht Hill a ríomh, déantar cothromóid (2) a atheagrú mar:
Am postála: Jun-07-2022
