بررسی رابط بین زیر واحدی کانال پروتون Hv1 باز با یک کاوشگر جفت شده آلوستریک

از اینکه از Nature.com بازدید کردید متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر خاموش کنید). در این بین، برای اطمینان از در ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
کانال پروتون دردار ولتاژ Hv1 یک مجموعه دیمری متشکل از دو حوزه حسگر ولتاژ (VSDs) است که هر یک شامل یک مسیر نفوذ پروتون دردار است. دایمر شدن توسط دامنه سیم پیچ سیتوپلاسمی کنترل می شود. انتقال از حالت بسته به حالت باز در هر دو VSD شناخته شده است که به صورت مشترک رخ می دهد. با این حال، اطلاعات کمی در مورد مکانیسم‌های زیربنایی وجود دارد. با این حال، چنین رابط‌هایی در کانال‌های Hv1 باز شناسایی نشده‌اند. در اینجا ما نشان می‌دهیم که مشتقات 2-guanidinothiazole دو VSD Hv1 را به روشی مشترک مسدود می‌کنند و از یکی از این ترکیبات به عنوان یک کاوشگر برای جفت شدن آلوستریک بین زیر واحدهای باز استفاده می‌کنند. ما دریافتیم که خارج سلولی انتهای اولین قطعه گذرنده VSD یک رابط بین زیر واحدی را تشکیل می دهد که جفت شدن بین محل های اتصال را واسطه می کند، در حالی که حوزه سیم پیچ به طور مستقیم در این فرآیند دخیل نیست. ما همچنین شواهد قوی پیدا کردیم مبنی بر اینکه فیلتر انتخابی پروتون کانال، همکاری اتصال مسدود کننده را کنترل می کند. .
کانال‌های پروتونی دارای ولتاژ در ارگانیسم‌های مختلف، از فیتوپلانکتون گرفته تا انسان، نقش مهمی دارند. در بیشتر سلول‌ها، این کانال‌ها واسطه جریان پروتون از غشای پروتون هستند و فعالیت NADPH اکسیداز را تنظیم می‌کنند. تنها کانال پروتون دردار ولتاژی شناخته شده در انسان. Hv1 است، که محصول ژن HVCN12،3 است. Hv1 (معروف به VSOP) نقشی در تکثیر سلول های B4، تولید گونه های اکسیژن فعال توسط سیستم ایمنی ذاتی، سلول های اسپرم 5،6،7،8 ایفا می کند. تحرک 9 و تنظیم pH مایع سطح راه هوایی 10. این کانال در چندین نوع سرطان با بیان بیش‌ازحد از جمله بدخیمی‌های سلول B4،11 و سرطان‌های سینه و کولورکتال 12،13 نقش دارد. مشخص شد که فعالیت بیش از حد Hv1 باعث افزایش پتانسیل متاستاتیک سلول‌های سرطانی می‌شود. توسط میکروگلیا، و نشان داده شده است که فعالیت آن باعث تشدید آسیب مغزی در مدل های سکته مغزی ایسکمیک می شود.
پروتئین Hv1 حاوی یک دامنه حساس به ولتاژ (VSD) است که از چهار بخش گذرنده به نام S1 تا S414 تشکیل شده است. Ciona gutis15. در این پروتئین های دیگر، C-پایانه S4 به یک ماژول موثر، حوزه منافذ یا آنزیم متصل است. در Hv1، S4 به دامنه سیم پیچی (CCD) واقع در سمت سیتوپلاسمی غشاء متصل می شود. کانال یک کمپلکس دیمری متشکل از دو VSD است که هر کدام حاوی یک مسیر نفوذ پروتون دردار 16،17،18 است. این دو زیرواحد Hv1 به طور مشترک باز می‌شوند. نقش مهمی در فرآیند دروازه ای دارد. رابط بین زیر واحدها در حوزه سیم پیچ سیم پیچ به خوبی تعریف شده است زیرا ساختارهای کریستالی دو حوزه جدا شده در دسترس هستند. ساختار کریستالی پروتئین کایمریک Hv1-CiVSP اطلاعاتی در مورد این رابط ارائه نمی دهد، زیرا سازماندهی سه گانه مجموعه کانال متبلور ممکن است از جایگزینی CCD Hv1 بومی با زیپ لوسین مخمر GCN424 ناشی شود.
یک مطالعه اخیر در مورد سازماندهی زیر واحد کانال Hv1 به این نتیجه رسید که دو مارپیچ S4 بدون اختلال شدید در ساختار ثانویه به CCD منتقل می‌شوند و منجر به مارپیچ‌های طولانی می‌شوند که از غشاء شروع شده و به داخل سیتوپلاسم می‌روند. این مطالعه پیشنهاد می کند که VSD های Hv1 با یکدیگر در امتداد بخش S4 تماس بگیرند. با این حال، مطالعات دیگر رابط های جایگزینی را بین VSD ها پیشنهاد کرده اند. این رابط ها شامل بخش های S1 17، 21، 26 و انتهای بیرونی بخش S2 21 هستند. دلیلی ممکن برای تضاد نتایج این مطالعات این است که جفت آلوستریک بین VSDها در رابطه با فرآیند دروازه‌ای که به حالت‌های بسته و باز بستگی دارد مورد بررسی قرار گرفت و رابط بین VSDها ممکن است در تغییرات حالت‌های مختلف در ترکیب متفاوت باشد.
در اینجا، ما دریافتیم که 2-guanidinothiazole با اتصال هم افزایی به دو VSD باز، کانال های Hv1 را مهار می کند و از یکی از ترکیبات، 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) برای بررسی تعامل بین زیر واحدها در حالت باز استفاده می کند. رابط. ما دریافتیم که منحنی اتصال GBTA را می توان با یک مدل کمی به خوبی توصیف کرد که در آن اتصال یک بازدارنده به یک زیر واحد منجر به افزایش میل اتصال زیر واحد مجاور می شود. همچنین دریافتیم که باقیمانده های D112، فیلترهای انتخابی برای کانال 27، 28 و بخشی از محل اتصال مشتق گوانیدین 29، همکاری اتصال GBTA را کنترل می‌کنند. ما نشان می‌دهیم که اتصال مشارکتی در دایمر Hv1، جایی که CCD از بخش S4 جدا می‌شود، حفظ می‌شود، که نشان می‌دهد رابط بین زیر واحدی در CCD مستقیماً انجام نمی‌شود. واسطه جفت آلوستریک بین محل های اتصال GBTA. در مقابل، ما متوجه شدیم که قطعه S1 بخشی از رابط بین زیر واحدها است و آرایشی از VSD های مجاور را با انتهای خارج سلولی مارپیچ S4 دور از مرکز دایمر پیشنهاد می کند تا اجازه دهد. قطعه S1 در حالت باز باشد.
مهار کننده های مولکولی کوچک Hv1 به عنوان داروهای ضد سرطان و عوامل محافظت کننده عصبی مفید هستند. با این حال، تا به امروز، ترکیبات کمی قادر به مهار کانال 30،31،32،33 بوده اند. در میان آنها، 2-guanidinobenzimidazole (2GBI، ترکیب [1] در شکل). 1a) و مشتقات آن نفوذ پروتون ها را از طریق کانال VSD29،32 مسدود می کنند. تصور می شود که اتصال چنین ترکیباتی به طور مستقل در دو زیر واحد باز رخ می دهد. 2-guanidinobenzothiazole (GBTA، ترکیب [2] در شکل 1a) قبلا نشان داده شده بود که Hv1 را تقریباً به اندازه 2GBI در غلظت 200 میکرومولار مهار می کند (شکل 1b). ما سایر مشتقات تیازول را بررسی کردیم و دریافتیم که برخی از آنها کانال را با قدرتی مشابه یا بیشتر از GBTA مهار می کنند (شکل 1 و مکمل). متن). ما منحنی پاسخ غلظت چهار مشتق تیازول (GBTA و ترکیبات [3]، [6] و [11]، شکل 1c) را تعیین کردیم و متوجه شدیم که آنها از 2GBI تندتر بودند. ضرایب هیل (h) از مشتقات تیازول از 0.040 ± 1.109 تا 0.033 ± 1.306 متغیر بود (شکل 1). 1c و شکل تکمیلی 1). در مقابل، ضریب Hill برای 2GBI 0.975 ± 0.024 29، شکل 2a و شکل تکمیلی 1 بود. ضریب Hill بالاتر از 1 نشان دهنده همکاری اتصال است. زیرا هر زیر واحد Hv1 بازدارنده خاص خود را دارد. محل اتصال، 29،32، ما استدلال کردیم که اتصال یک مشتق تیازول به یک زیر واحد می تواند اتصال یک مولکول بازدارنده دوم را به زیر واحد مجاور افزایش دهد. GBTA ترکیب آزمایشی با بالاترین ضریب هیل بود. بنابراین، این ترکیب را انتخاب کردیم. مکانیسم هم افزایی اتصال را بیشتر مطالعه کرد و از 2GBI به عنوان کنترل منفی مرجع استفاده کرد.
(الف) ترکیبات آزمایشی: [1] مهارکننده Hv1 مرجع 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-گوانیدینو بنزوتیازول (GBTA)، [3] (5-تری فلورومتیل-1،3-بنزوتیازول-2-ایل) گوانیدین، [4] نفتو[1،2-d][1، 3] تیازول-2-یل -گوانیدین، [5] (4-متیل-1،3-تیازول-2-یل) گوانیدین، [6] (5-برومو-4-متیل-1،3-تیازول-2-ایل) گوانیدین، [7] فاموتیدین، [8] اتیل استر 2-گوانیدینو-5-متیل-1،3-تیازول-4-کربوکسیلیک اسید، [9] 2-گوانیدینو-4-متیل اتیل-1،3-تیازول-5-کربوکسیلات، [10 ](2-گوانیدینو-4-متیل-1،3-تیازول-5-ایل) اتیل استات، [11]1-[4-(4-کلروفنیل)-1،3-تیازول-2-یل] گوانیدین، [ 12]1-[4-(3،4-دی متوکسی فنیل)-1،3-تیازول-2-ایل] گوانیدین. (ب) مهار فعالیت Hv1 انسانی توسط گوانیدینوتیاازول های نشان داده شده و ترکیب مرجع 2GBI (نوارهای سبز-آبی) جریان‌های پروتون Hv1 در پلاک‌های داخل به بیرون تخمک‌های Xenopus در پاسخ به دپلاریزاسیون از پتانسیل نگهداری 80- تا 120+ میلی‌ولت اندازه‌گیری شد. هر بازدارنده با غلظت 200 میکرومولار pHi = pHo = 6.0 به حمام اضافه شد. داده‌ها میانگین ± SEM (n≥4) هستند. (ج) مهار وابسته به غلظت Hv1 انسانی توسط ترکیبات [2]، [3]، [6] و [11]. هر نقطه نشان‌دهنده میانگین بازداری ± SD از 3 است. تا 15 اندازه گیری این خط یک برازش Hill است که برای به دست آوردن مقادیر ظاهری Kd گزارش شده در جدول تکمیلی 1 استفاده می شود. ضرایب تپه از برازش های گزارش شده در شکل تکمیلی 1 تعیین شد: h(1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 1.306 ± h 0.033، h(3) = 0.07 ± 1.25، h(6) = 0.040 ± 1.109، h (11) = 0.036 ± 1.179 (به روش ها مراجعه کنید).
(الف، ب) ترکیبات 2GBI و GBTA دیمری و مونومر Hv1 را به روشی وابسته به غلظت مهار می‌کنند. هر نقطه نشان‌دهنده میانگین بازداری ± SD از 3 تا 8 اندازه‌گیری است و منحنی برازش Hill است. ضرایب هیل (h) نشان داده شده در هیستوگرام های ورودی از برازش های گزارش شده در شکل های تکمیلی 3 و 4 تعیین شدند. پاسخ غلظت GBTA نشان داده شده در (a) مانند شکل 1c است. برای مقادیر ظاهری Kd به جدول تکمیلی 1 مراجعه کنید. (c) مدل سازی اتصال مشارکتی GBTA به دیمر Hv1. خط مشکی یکپارچه نشان دهنده تناسب با داده های تجربی با معادله (6) است، که مدل اتصال نشان داده شده در (d) را توصیف می کند. خطوط چین با برچسب Sub 1 و Sub 2 نشان دهنده ارتباط دو مولکولی منحنی های تعادل تفکیک رویدادهای اتصال اول و دوم به ترتیب (زیر 1: OO + B ⇄ BO *، Kd1 = 70 ± 290 میکرومولار؛ زیر 2: BO * + B ⇄ B * O *، Kd2 = 29.3 ± 2.5 میکرومولار (د) نمودار شماتیک مکانیسم پیشنهادی بلوک Hv1. در مورد GBTA، اتصال به یک زیر واحد باز میل ترکیبی زیرواحد باز مجاور را افزایش می دهد (Kd2 کانال‌های Hv1 را می‌توان با جایگزین کردن دامنه‌های سیتوپلاسمی ترمینال N و C با بخش‌های مربوط به فسفاتاز CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18،34 Ciona Intestinalis مونومر کرد. آنها را با مهار کانال دیمری (نوع وحشی) مقایسه کردیم (شکل 2a,b). ما دریافتیم که تفاوت در همکاری اتصال بین دو ترکیب در مونومر Hv1 حذف شد، و این توضیح را پشتیبانی می کند که اتصال GBTA به یک زیر واحد افزایش می دهد. تمایل زیرواحد دیگر به بازدارنده. ما استدلال کردیم که اتصال GBTA به یک زیرواحد Hv1 ممکن است به بازآرایی محل اتصال (القای fit35) منجر شود، که باعث بازآرایی محل اتصال خالی زیرواحد مجاور می‌شود و منجر به افزایش اتصال می‌شود. قرابت
برای توصیف کمی اتصال مشارکتی GBTA به کانال، ما از مدلی استفاده کردیم که در آن هر یک از زیرواحدها می‌توانند اولین مولکول بازدارنده را به دنبال یک واکنش دو مولکولی با ثابت تفکیک Kd1 متصل کنند (شکل 2c، زیر 1، OO+ B⇆ BO*). اتصال باعث می شود کانال حالتی اتخاذ کند که در آن زیر واحدهای خالی باقیمانده به دنبال یک واکنش دو مولکولی منحصر به فرد با ثابت تفکیک Kd2 به بازدارنده متصل می شوند، جایی که Kd2 خط مشکی یکپارچه در شکل 2c برازش معادله مدل با منحنی غلظت-پاسخ تجربی است که Kd1 برابر 290 میکرومولار و Kd2 ~29 میکرومولار به دست می‌دهد (بخش روش‌ها، معادله (6)). این مدل همچنین توصیف می‌کند. اتصال 2GBI، که در آن Kd2 ≈ Kd1 = Kd (شکل 2d) میکرومولار، که بیشتر شبیه Kd1 است تا Kd2 (شکل 2d). به عبارت دیگر، محل اتصال مونومر در یک پیکربندی (O°) بیشتر شبیه به حالت میل ترکیبی بالا (BO*) است تا با حالت کم. حالت میل ترکیبی (OO) دایمر، به احتمال زیاد به دلیل حذف رابط بین زیر واحدها.
همانطور که قبلاً برای 2GBI32 نشان داده شد، متوجه شدیم که GBTA جریان Hv1 را با مسدود کردن کانال در هنگام باز کردن آن به جای سخت‌تر کردن باز کردن آن سرکوب می‌کند (شکل تکمیلی 2a,b,d).2GBI همچنین به عنوان القای جریان‌های دم در حال فروپاشی آهسته شناخته شده است. در پاسخ به رپولاریزاسیون غشا، اما این پدیده در GBTA مشاهده نشد (شکل تکمیلی 2c). در حضور غیرفعال شدن Hv1 در حضور 2GBI، دروازه‌های هر زیر واحد نمی‌توانند بسته شوند تا زمانی که مسدودکننده محل اتصال را ترک نکند (" مکانیسم foot gate")، و 2GBI کندتر از بسته شدن دروازه ها باز می شود. اگر یکی از زیرواحدهای Hv1 باز و بسته شود، در حالی که زیرواحد مجاور مسدود باقی بماند، باز شدن مولکول های 2GBI باقی مانده کندتر می شود (گرفتن مسدود کننده). گونه های کانال طولانی مدت با تنها یک زیر واحد مسدود شده، پروتون‌ها را به‌طور موقت قبل از بسته شدن هدایت می‌کند و سهم قابل‌توجهی در جریان دم در حال فروپاشی آهسته دارد.
این یافته که فروپاشی جریان های دنباله Hv1 در حضور GBTA به طور قابل توجهی کند نشده است (شکل تکمیلی 2c) با مکانیسم اتصال هم افزایی برای این مسدود کننده سازگار است (شکل 2d). هنگامی که یک مولکول GBTA از زیر واحد Hv1 جدا شد. میل ترکیبی مسدود کننده به زیر واحد مجاور حدود 10 برابر کاهش می یابد و به روند جداسازی کمک می کند. این بدان معنی است که مولکول دوم GBTA قبل از گیر افتادن در کانال شانس بسیار بیشتری برای باز شدن دارد. گونه های کانالی با عمر طولانی که تولید تنها یک زیرواحد مسدود کننده انتظار می رود در حضور GBTA بسیار بیشتر از حضور 2GBI باشد که منجر به واپاشی سریعتر جریان دم می شود.
برای اینکه GBTA به طور مشترک با هر دو زیر واحد Hv1 متصل شود، مکان‌های اتصال باید به صورت آلوستریک جفت شوند. هر محل اتصال باید بتواند: 1) زنجیره‌ای از رویدادها را ایجاد کند که با زیر واحدهای مجاور متصل به بازدارنده ارتباط برقرار می‌کند، و 2) میانجی گری انتقال از اتصال کم میل ترکیبی به اتصال با میل ترکیبی بالا. ما استدلال کردیم که اگر باقیمانده‌های خاص در محل اتصال به فرآیند همکاری کمک کنند، جهش آنها باید ضریب هیل منحنی غلظت-پاسخ مهار GBTA Hv1 را تغییر دهد. باقیمانده‌های D112، F150 قبلا نشان داده شده بود که S181 و R211 بخشی از محیط اتصال 2GBI29 هستند و ما فرض کردیم که آنها به طور مشابه در اتصال GBTA نقش دارند (شکل 3A). و R211S (شکل 3) و ضرایب هیل آنها را با ضرایب Hv1 نوع وحشی مقایسه کردند، با استفاده از 2GBI به عنوان مرجع. باقیمانده V109 در همان وجه قطعه S1 با D112 است و یک چرخش مارپیچ اضافی در داخل سلول دارد. V109 در اتصال 2GBI29 دخیل نبود، ما از جهش V109A به عنوان کنترل استفاده کردیم (شکل 1). 3 ب).
(الف) باقیمانده‌های پیشنهادی Hv1 که در اتصال مشتقات گوانیدین دخیل هستند. منحنی‌های آبی تیره‌دار زنجیره‌های جانبی پیشنهادی قبلی را احاطه کرده‌اند که با بخش‌های مختلف ترکیب 2GBI29 تعامل دارند. قرمز تیره). هر نقطه نشان‌دهنده بازداری متوسط ​​3 تا 12 اندازه‌گیری ± SD V109 به عنوان یک کنترل منفی است. منحنی‌ها تناسب تپه‌ای هستند که برای به دست آوردن مقادیر Kd ظاهری استفاده می‌شوند (جدول تکمیلی 1 را ببینید). ضرایب Hill (h) نشان داده شده در هیستوگرام های ورودی از برازش های گزارش شده در شکل های تکمیلی 3 و 4 تعیین شدند. مقادیر مرجع برای Hv1 WT به صورت خطوط چین نشان داده شده است. .
ما دریافتیم که جهش D112E به طور قابل توجهی ضریب هیل را کاهش می دهد (p این یافته که ضریب Hill برای اتصال GBTA بالاتر از 1 در دایمر Hv1 است و در کانال مونومر ~ 1 می شود (شکل 2b) با وجود برهمکنش های آلوستریک بین محل های اتصال در دو زیر واحد مطابقت دارد. در این صورت، ضریب تپه اتصال GBTA به دایمری که مسدودکننده به یک زیر واحد به آن متصل شده است باید ~1 باشد. ما این پیش‌بینی را در دایمر متصل Hv1 F150A-WT (شکل 4a) آزمایش کردیم، که در آن میل ترکیبی F150A وجود دارد. زیر واحد برای GBTA بیش از 2 مرتبه بزرگتر از زیرواحد WT بود (شکل 1c و 3d). سپس منحنی های غلظت-پاسخ را برای مهار زیرواحد WT در غلظت پایه 2 میکرومولار GBTA اندازه گیری کردیم. در این غلظت. انتظار می رود مسدود کننده تقریباً 99٪ از زیرواحد F150A و کمتر از 2٪ از زیرواحد WT را متصل کند، و در نتیجه یک نیمه کانال مسدود شده {F150A}b-WT (یا BAO*) ایجاد شود (شکل 4a). کاهش جریان پروتون اندازه گیری شد. پس از افزودن 2 میکرومولار GBTA به کانال F150A-WT (شکل 4b) با مهار زیرواحد F150A مطابقت دارد. منحنی‌های تمرکز-پاسخ برای نیم کانال‌های مسدود شده ضرایب هیل را بسیار نزدیک به 1 نشان می‌دهد (شکل 1). 4c)، تأیید می کند که همکاری اتصال GBTA از جفت شدن آلوستریک بین محل های اتصال در زیر واحدهای مجاور به جای جفت شدن اتصال درون زیر واحدی بین سایت ها ناشی می شود.
(الف) نمودار شماتیک دایمر اتصال F150A-WT که برای تولید نیم کانال مسدود کننده ({F150A}b-WT/BAO*) استفاده می‌شود. الماس‌های سفید محل جهش را نشان می‌دهند. در حالت‌های BAO* و BA*B*، انتظار می رود میل ترکیبی زیر واحد F150A بیشتر از زیرواحد WT باشد. (ب) جریان های پروتون از کانال های F150A-WT در پاسخ به تغییرات پتانسیل غشا از 80- میلی ولت به +120 میلی ولت اندازه گیری می شود. pHi = pHo = 6.0 ردپای خاکستری نشان دهنده جریان های اندازه گیری شده در غیاب بازدارنده است. رد سیاه (شاهد) نشان دهنده جریان اندازه گیری شده پس از افزودن 2 میکرومولار GBTA است. در این غلظت، زیر واحد WT به طور قابل توجهی مهار نشد، در حالی که زیر واحد F150A تقریباً به طور کامل به GBTA متصل شد. ({F150A}b-WT). افزایش بیشتر در غلظت GBTA منجر به مسدود شدن زیرواحد WT (ردهای نارنجی و قرمز) شد. زیر واحد F150A). هر نقطه نشان دهنده میانگین بازداری ± SD از 3 تا 7 اندازه گیری است. منحنی ها برازش های تپه ای بودند که برای به دست آوردن مقادیر ظاهری Kd گزارش شده در جدول تکمیلی 1 استفاده شدند. ضرایب Hill نشان داده شده در هیستوگرام های داخلی از برازش های گزارش شده در شکل های تکمیلی 3 و 4 تعیین شدند. مقادیر h Hv1 WT عبارتند از به صورت خطوط چین نشان داده شده است. ستاره ها تفاوت های آماری معنی داری را در مقایسه با WT دایمر Hv1 نشان می دهند (p از آنجایی که مهار GBTA Hv1 در کانال باز اندازه‌گیری شد، ما استدلال کردیم که می‌توان از همکاری اتصال GBTA برای مطالعه مکانیسم جفت شدن بین زیر واحدها در حالت باز استفاده کرد. 22 و جفت بین زیر واحدی درگیر در دروازه‌بندی پیشنهاد شد که توسط دامنه سیم پیچ سیتوپلاسمی (CCD) 22،25 واسطه شود. بنابراین، ما پرسیدیم که آیا CCD نیز در جفت شدن بین سایت‌های اتصال GBTA در حالت باز دخیل است یا خیر. تری گلیسین جهش در سطح مشترک بین قطعه گذرنده S4 و دامنه سیم پیچ در مطالعات قبلی نشان داده شده است که این دامنه را از بقیه کانال جدا می کند و در عین حال یکپارچگی دایمرسازی را حفظ می کند. بنابراین، ما تأثیر جهش های V220G، K221G و T222G را آزمایش کردیم (شکل 5a، جهش GGG) در همکاری اتصال GBTA. ما یک کاهش آماری ناچیز (p> 0.05) در ضریب اتصال GBTA به کانال های GGG در مقایسه با نوع وحشی (شکل 5c) پیدا کردیم، که نشان می دهد علیرغم نقش آن در حفظ کانال. دو زیرواحد با هم مهم هستند، اما CCD به طور مستقیم واسطه جفت آلوستریک بین زیر واحد بین سایت های اتصال GBTA نیست.
(الف) نمودار شماتیک دایمر Hv1 با جهش تری گلیسین در انتهای داخلی S4 طراحی شده برای ایجاد اختلال در جفت بین زیر واحدی با واسطه‌ی حوزه سیم پیچ سیتوپلاسمی (فلش‌های آبی). (ب) نمایش شماتیک دایمرهای Hv1 و دایمرهای بستن با جهش‌های مشخص شده، طراحی شده برای آزمایش قطعات S1 درگیر در جفت شدن بین زیر واحدها (فلش‌های آبی). ± SD از 3 تا 10 اندازه گیری. منحنی یک برازش Hill بود که برای به دست آوردن مقادیر Kd ظاهری استفاده شد (جدول تکمیلی 1 را ببینید). ضرایب تپه در هیستوگرام های درونیابی همانطور که در بخش روش ها توضیح داده شد تعیین شد (شکل های تکمیلی 3 و 4 را ببینید). مقادیر مرجع برای h Hv1 WT به صورت خطوط چین نشان داده می‌شود. ستاره‌ها تفاوت‌های آماری معنی‌داری را بین گذرگاه‌های جهش یافته و WT نشان می‌دهند (p از آنجایی که CCD را به‌عنوان واسطه مستقیم اتصال مشارکتی GBTA رد کردیم، پرسیدیم که آیا فعل و انفعالات بین VSD ها در جفت شدن آلوستریک بین محل‌های اتصال دخیل است یا خیر. ما دریافتیم که همکاری اتصال GBTA با جهش محافظه‌کارانه باقیمانده D112 (شکل 3c) لغو شد. در بخش گذرنده S1. S1 حاوی دو باقیمانده با بار منفی دیگر، E119 و D123 است که در همان سمت مارپیچ با D112 قرار دارند، اما نزدیک‌تر به انتهای بیرونی 24 قطعه. به D112 از طریق خطوط آبی36،37. بنابراین، ما آزمایش کردیم که آیا E119 و D123 در جفت شدن آلوستریک بین مکان‌های اتصال GBTA دخیل هستند یا خیر (شکل 5b). اما در طرف دیگر مارپیچ S1 (شکل 5b).
ما مهار وابسته به غلظت کانال‌های E119A، D123A و K125A را توسط 2GBI و GBTA اندازه‌گیری کردیم و متوجه شدیم که جهش‌های E119A و K125A به طور قابل‌توجهی ضریب Hill هر یک از بازدارنده‌ها را در مقایسه با نوع وحشی تغییر نمی‌دهند (p > 0.05، شکل 5d،i). ). از سوی دیگر، جهش D123A به طور قابل توجهی ضریب Hill GBTA را کاهش داد (p 0.05/14).
از آنجایی که خنثی کردن بار در موقعیت 123 در هر دو زیرواحد منجر به تغییر شدید در همکاری اتصال GBTA شد، در حالی که معکوس کردن شارژ در هر دو زیر واحد فقط تأثیر کمی داشت، ما تجزیه و تحلیل را گسترش دادیم تا تنها یک زیر واحد را با کانال وارونگی شارژ شامل شود. ما دایمرهای مرتبط با Hv1 را با جایگزینی D123R در زیرواحد C ترمینال تولید کرد (شکل 5b) و مهار واکنش غلظت توسط GBTA و 2GBI را اندازه گیری کرد. ما دریافتیم که ضریب Hill اتصال GBTA به کانال های WT-D123R به طور قابل توجهی بالاتر از آن است. از نوع وحشی Hv1 (p ما همچنین دریافتیم که جهش D112E افزایش ضریب هیل اتصال GBTA تولید شده توسط پس‌زمینه WT-D123R را لغو کرد (شکل 5b,h و شکل تکمیلی 4). شکل 5h و شکل تکمیلی 3). این یافته ها نشان می دهد که جفت شدن آلوستریک تقویت شده بین زیرواحدهای ناشی از بارهای مخالف در موقعیت 123 وقتی محل اتصال در موقعیت D112 مختل می شود، به همکاری اتصال قوی تر ترجمه نمی شود.
ما استدلال کردیم که اگر باقی‌مانده‌های D123 در زیر واحدهای باز مجاور به اندازه‌ای نزدیک باشند که به صورت الکترواستاتیکی با یکدیگر تعامل داشته باشند، برهمکنش دافعه بین بارهای منفی با جایگزینی اسید آسپارتیک به آرژنین به ترکیبی از بارهای منفی و مثبت تبدیل می‌شود. تعامل جذاب بین آنها. یک زیر واحد (WT-D123R دایمر). فعل و انفعالات جذاب می تواند رابط بین انتهای بیرونی قطعه S1 را تقویت کند و منجر به جفت شدن آلوستریک قوی تر بین زیر واحدها و افزایش همکاری اتصال GBTA شود.
برای حمایت از این فرضیه، ما به دنبال راهی برای تقویت رابط بین انتهای بیرونی قطعه S1، که متمایز از تعویض شارژ در موقعیت 123 است، بودیم. علاوه بر این، ساختار کریستالی VSD کایمریک Hv1-CiVSP نشان داد که I127 از انتهای بیرونی مارپیچ S1 تنها با یک باقیمانده جدا شده است. بنابراین ما پرسیدیم که آیا تشکیل یک پیوند کووالانسی بین سیستئین ها در موقعیت 127، که انتظار می رود منجر به یک تعامل قوی تر S1-S1 شود، تأثیری بر همکاری اتصال GBTA دارد که مشابه آن چیزی است که با تغییر بار در موقعیت 123 مشاهده می شود.
ما مهار وابسته به غلظت Hv1 I127C توسط GBTA و 2GBI را در حضور و عدم حضور 10 میلی مولار β-مرکاپتواتانول (βME) اندازه‌گیری کردیم (شکل 6a). همزمان با افزودن بازدارنده به محلول داخل سلولی، کاهش می‌یابد. عامل به محلول خارج سلولی اضافه می شود. یک دایمر متصل با جایگزینی سیستئین تنها در یک زیر واحد (WT-I127C) به عنوان کنترل منفی استفاده شد (شکل 6a). بین زیر واحدهای I127C در مهار 2GBI، زیرا ضریب Hill برای اتصال I127C به Hv1، با یا بدون βME، به طور قابل توجهی با اتصال به دیمرهای جایگزین مونوسیستئین متفاوت بود. ضریب هیل نمی تواند WT-I127C را متمایز کند (شکل 6b و شکل تکمیلی 3). در تضاد کامل، ما اثر چشمگیر پیوند متقابل بین زیر واحدی خود به خودی بر مهار GBTA را اندازه گیری کردیم. ضریب هیل برای اتصال به Hv1 I127C در غیاب βME اندازه گیری شد. (شکل متقاطع روشن) به طور قابل توجهی بالاتر از اندازه گیری شده در حضور βME (خط متقابل) یا استفاده از WT-127C برای اتصال دایمر (در صورت عدم وجود پیوند متقابل) بود (شکل 6c و شکل تکمیلی 4)، که نشان می دهد جفت شدن آلوستریک بین محل‌های اتصال با تشکیل پیوندهای دی سولفیدی بین انتهای بیرونی قطعات S1 بسیار افزایش می‌یابد. این نتایج از تفسیر ما پشتیبانی می‌کند که تعامل الکترواستاتیکی جذاب آسپارتات و آرژنین در موقعیت 123 در دایمر WT-D123R منجر به افزایش جفت آلوستریک بین زیر واحدها
جفت حالت باز توسط فعل و انفعالات فیزیکی مستقیم بین انتهای بیرونی بخش S1 در دو زیر واحد انجام می شود.
(الف) نمایش شماتیک دایمرهای Hv1 جهش یافته و دایمرهای پیوند دهنده، طراحی شده برای بررسی چگونگی تأثیر پیوندهای متقابل سیستئین بین زیر واحدی بر همکاری اتصال GBTA. ه) در حضور یا عدم حضور 10 میلی مولار βME در محلول خارج سلولی. هر نقطه نشان دهنده میانگین مهار ± SD از 3 تا 10 اندازه گیری است. منحنی یک برازش Hill بود که برای به دست آوردن مقادیر Kd استفاده شد (جدول تکمیلی 1 را ببینید). ضرایب تپه در هیستوگرام های داخلی از برازش های گزارش شده در شکل های تکمیلی 3 و 4 تعیین شد. ستاره ها در (c,e) تفاوت های آماری معنی داری را نشان می دهند. بین شرایط مختلف بازداری GBTA (P ما همچنین دریافتیم که در غیاب βME، ضریب Hill اتصال GBTA به دایمر D112E I127C Hv1 به طور قابل‌توجهی بالاتر از ضریب اندازه‌گیری شده در حضور عوامل کاهنده بود (شکل 6e و شکل تکمیلی 4)، که به این معنی است که جهش D112E افزایش همکاری اتصال GBTA ناشی از پیوند متقابل سیستئین 127 را لغو نکرد. ضریب هیل اتصال 2GBI به دایمرهای D112E، I127C Hv1 نیز به طور قابل توجهی تحت تأثیر جهش D112E قرار نگرفت (شکل 1).6d و مکمل شکل 3).
در مجموع، این یافته‌ها نشان می‌دهند که اتصال GBTA با تعامل بین انتهای بیرونی قطعات S1 در زیر واحدهای Hv1 مجاور از طریق برهمکنش‌های الکترواستاتیکی جذاب یا از طریق تشکیل پیوندهای کووالانسی بین سیستئین‌های جایگزین، جفت شدن آلوستریک بین محل‌ها افزایش می‌یابد و منجر به همکاری اتصال می‌شود. در حالی که اثر برهمکنش های الکترواستاتیکی جذاب بر همکاری را می توان با جهش D112E از بین برد، اثر پیوندهای کووالانسی نمی تواند.
در کاوش در فضای شیمیایی موجود برای اتصال مشتقات گوانیدین به کانال‌های Hv1، متوجه شدیم که 2-گوانیدینوتیاازول‌ها مانند GBTA وابستگی به غلظت بیشتری نسبت به 2-گوانیدینوبنزیمیدازول دارند (شکل 1c). تجزیه و تحلیل ضریب هیل اتصال GBTA به هر دو دیمر و کانال های مونومر (شکل 2a,b) و کانال دایمری که در آن یک زیر واحد از قبل به بازدارنده متصل شده بود (شکل 4) ما را به این نتیجه رساند که مهار Hv1 توسط GBTA عمل یک فرآیند هم افزایی است، و مکان‌های اتصال ترکیبات در دو زیرواحد به صورت آلوستریک همراه هستند. کشف که GBTA به کانال باز متصل می‌شود، همانطور که قبلاً برای ترکیب مرتبط 2GBI32 نشان داده شد، نشان می‌دهد که جفت آلوستریک را می‌توان به طور خاص در حالت باز ارزیابی کرد. مدل اتصال مشارکتی ما توانست به طور کمی مهار Hv1 توسط GBTA را توصیف کند (شکل 2c) و اثرات مختلف 2GBI و GBTA را بر روی فروپاشی جریان های دم کانال پس از رپولاریزاسیون غشاء توضیح دهد، که از تفسیر ما از فرآیند اتصال پشتیبانی می کند.
حداکثر ضریب Hill که در یک پروتئین آلوستریک با دو محل اتصال (مانند Hv1) ​​به دست می آید 2 است. ما GBTA را برای اتصال نوع وحشی Hv1 با ضریب 1.31 اندازه گیری کردیم که در Hv1 I127C به 1.88 افزایش یافت. انرژی آزاد هم افزایی، تفاوت بین انرژی‌های آزاد اتصال پایین‌ترین و بالاترین مکان‌های میل ترکیبی (به روش‌ها مراجعه کنید)، 1.3 کیلوکالری بر مول در مورد Hv1 نوع وحشی و 2.7 کیلوکالری بر مول در مورد Hv1 I127C بود. اکسیژن به هموگلوبین مشهورترین و به خوبی مطالعه شده‌ترین نمونه از فرآیند مشارکتی است. kcal/mol، بسته به شرایط تجربی.
در مدل هم افزایی ما، اتصال مولکول‌های GBTA به یک زیر واحد منجر به افزایش میل پیوند زیرواحد مجاور می‌شود. ما فرآیندی را پیش‌بینی می‌کنیم که در آن، بازآرایی محیط اتصال حاصل از اولین رویداد اتصال (تناسب القایی) منجر به تغییرات در برهمکنش بین زیر واحدها. در پاسخ به این تغییرات، زیر واحدهای مجاور محل اتصال خود را تغییر می‌دهند که منجر به اتصال GBTA محکم‌تر می‌شود. در طی این فرآیند، آسپارتات S1 D112 مسئول بازآرایی محل اتصال مرتبط با افزایش تمایل اتصال است.D112 قبلاً نشان داده شده بود که بخشی از مسیر نفوذ پروتون Hv1 است و به عنوان فیلتر انتخابی عمل می کند27،28. نتایج ما نشان می‌دهد که فیلترهای گزینش‌پذیری در دو زیرواحد Hv1 به‌صورت آلوستریک در حالت باز جفت می‌شوند. شکل 7a مکان تقریبی محل اتصال GBTA و مکان باقی‌مانده‌های D112، D123، K125 و I127 را بر روی یک شماتیک از Hv1 VSD نشان می‌دهد. جهت‌های پیشنهادی برای جفت‌شدن آلوستریک شامل انتهای خارج سلولی S1 با فلش‌های سیاه نشان داده شده است.
(الف) شماتیک Hv1 VSD. بر اساس ساختار کریستالی واهی Hv1-CiVSP، بخش‌های مارپیچ به صورت استوانه‌ای نشان داده می‌شوند. در این پیکربندی، انتهای داخلی بخش S4 با CCD ادغام می‌شود (نمایش داده نشده است). مکان‌های پیش‌بینی‌شده GBTA محدود به‌صورت بیضی خاکستری نشان داده شده‌اند. فلش‌های سیاه مسیرهای درگیر در جفت شدن آلوستریک بین محل‌های اتصال در دو زیر واحد مجاور را نشان می‌دهند. موقعیت‌های باقی‌مانده‌های S1 بررسی شده با کره‌های رنگی مشخص شده‌اند. (ب) تصویر شماتیک زیر واحدهای Hv1 مرتب شده‌اند. در دو پیکربندی دایمر متفاوت که از سمت خارج سلولی صفحه غشاء دیده می شود. در صفحه سمت چپ، رابط دایمر توسط مارپیچ S4 تشکیل شده است. چرخش دو VSD 20 درجه در جهت عقربه های ساعت حول یک محور عمود بر صفحه غشاء همراه با جداسازی انتهای بیرونی دو مارپیچ S4 (فلش های چین دار)، آرایش نشان داده شده در سمت راست را ایجاد می کند. در این پیکربندی، باقیمانده های D123 و I127 از زیر واحدهای مجاور اجازه دارند به هم نزدیک شوند. (ج) نمایش شماتیک CiVSP VSD در پیکربندی دایمر موجود در ساختار کریستالی 4G80. موقعیت P140 در CiVSP با موقعیت D123 در Hv1 مطابقت دارد.
نتایج ما نشان می‌دهد که برهم‌کنش الکترواستاتیک دافعه بین باقیمانده 123 (123D/123D یا 123R/123R) با سطح "عادی" همکاری اتصال GBTA در حالت باز مرتبط است و تعامل را از دافعه به جذب (123D/123R) تغییر می‌دهد. افزایش همکاری (شکل 5g). انتظار می رود که حذف برهمکنش دافعه با جایگزینی آلانین نیز منجر به افزایش همکاری شود. با این حال، کاهش همکاری دایمر 123A/123A مشاهده شد (شکل 5e). توضیح این است که اثر بی ثبات کننده قرار دادن بقایای آبگریز در یک محیط آبدوست ممکن است بر اثر تثبیت کننده به دلیل حذف فعل و انفعالات دافعه بین باقیمانده های D123 که منجر به کاهش کلی در همکاری اتصال می شود، بیشتر باشد. Mony و همکاران 39 اخیرا گزارش کردند که دسترسی به حلال در موقعیت D171 Ciona gutis Ci-Hv1 (مرتبط با D123 در Hv1 انسان) با فعال شدن افزایش می‌یابد و از این تصور حمایت می‌کند که D123 در یک محیط آبدوست در حالت باز قرار دارد.
شناخته شده است که دریچه کانال های Hv1 از طریق انتقال های متعدد رخ می دهد19،20،26،39،40،41. Qiu و همکاران26 دریافتند که با دپلاریزاسیون غشا، سنسور ولتاژ Ci-Hv1 دستخوش تغییر ساختاری می شود که کانال را فعال می کند اما همچنان بسته است. تغییر ساختاری حسگر ولتاژ توسط فلورسانس ولتاژ گیره نظارت شد و مشخص شد که انتقال دوم به طور انتخابی توسط جهش در موقعیت D171 مختل شده است. اغتشاش سیگنال فلورسنت با حضور برهمکنش های الکترواستاتیکی بین باقیمانده های D171 زیر واحدهای مجاور در نقطه ای در امتداد مختصات واکنش تغییر ساختاری مطابقت دارد. و واسطه جفت آلوستریک بین سایت های اتصال GBTA است.
فوجیوارا و همکاران 25 پیشنهاد کردند که رابط دایمر دامنه سیم پیچی سیتوپلاسمی به داخل غشاء گسترش می یابد تا حاوی دو مارپیچ S4 باشد (شکل 7b، پانل سمت چپ). کل VSD و آنالیز عملکردی ناحیه اتصال مارپیچ S4 و CCD. در غیاب گرادیان pH گذرنده، کانال‌های Hv1 برای باز شدن نیاز به دپلاریزاسیون غشایی قابل‌توجهی دارند و پیوند متقابل سیستئین در شرایطی رخ می‌دهد که کانال عمدتاً بسته است. بنابراین، رابط S4-S4 شناسایی شده احتمالاً پیکربندی زیرواحد خارج از حالت را منعکس می‌کند. مطالعات دیگر شواهدی مبنی بر دخالت S1 و S2 در تعاملات بین زیر واحدی در طول gating17،21،26 پیدا کرده‌اند که نشان می‌دهد کانال‌ها ممکن است پیکربندی‌های زیرواحد مختلف را در فضای باز و باز اتخاذ کنند. حالت های بسته، ایده ای منطبق با یافته های Mony و همکاران. S1 در حین دروازه 39 حرکت می کند.
در اینجا، نشان می‌دهیم که در حالت باز، انتهای خارج سلولی مارپیچ S1 به اندازه‌ای نزدیک است که از برهمکنش‌های الکترواستاتیک مستقیم پشتیبانی می‌کند که واسطه جفت شدن آلوستریک بین زیرواحدها است. در پیکربندی دایمر با برهمکنش‌های S4-S4 گسترده، مارپیچ‌های S1 خیلی دور هستند. جدا از همدیگر برای تعامل مستقیم. با این حال، چرخش 20 درجه در جهت عقربه های ساعت دو زیرواحد VSD حول محوری عمود بر صفحه غشاء، همراه با جداسازی انتهای بیرونی دو مارپیچ S4، یک پیکربندی S1-S1 را به همراه داشت. با یافته های ما (شکل 7b، پانل سمت راست). ما این پیکربندی را برای کانال در حالت باز توصیه می کنیم.
اگرچه تصور می‌شود که آنزیم CiVSP به عنوان یک مونومر عمل می‌کند، ساختار کریستالی VSD جدا شده آن در حالت دایمر قرار می‌گیرد. انتهای بیرونی مارپیچ‌های S1 در این دایمر از نظر فضایی به هم نزدیک هستند و پیکربندی کلی شبیه به آنچه پیشنهاد شده است. برای Hv1 (شکل 7c). در دایمر CiVSP، نزدیکترین باقیمانده از زیر واحد مجاور، پرولین در موقعیت 140 بود (شکل 7c). جالب توجه است که P140 در CiVSP با موقعیت D123 در Hv1 مطابقت دارد. شباهت در پیکربندی زیر واحد بین Hv1 و دایمرهای CiVSP نشان می‌دهند که VSDهای این پروتئین‌ها تمایل ذاتی به تشکیل یک رابط دارند که در آن انتهای خارج سلولی S1 برهم‌کنش دارند.
نقش اساسی Hv1 در فعال‌سازی سلول‌های اسپرم، این کانال را به یک هدف دارویی جذاب برای کنترل باروری مردان تبدیل می‌کند. علاوه بر این، فعال‌سازی Hv1 در میکروگلیا باعث بدتر شدن بهبودی از سکته مغزی ایسکمیک می‌شود. بقای بیماران مبتلا به سرطان سینه 12 یا کولورکتال 13 و تصور می‌شود که به بدخیمی‌های سلول B کمک می‌کند. بنابراین، داروهای مولکولی کوچکی که Hv1 را هدف قرار می‌دهند، می‌توانند به عنوان عوامل محافظت کننده عصبی یا درمان‌های ضد سرطان استفاده شوند. زیرواحد Hv1 باز، که منجر به افزایش میل اتصال می شود، ممکن است منجر به توسعه داروهای قوی تری شود که کانال های Hv1 را هدف قرار می دهند.
در ساختار Hv1NCCiVSP، باقیمانده های 1-96 و 228-273 Hv1 با باقیمانده های 1-113 و 240-576 CiVSP18 جایگزین شدند. در ساختار Hv1NCCiVSP. C-پایانه یک زیر واحد از طریق پیوند GGSGGSGGSGSGGSGG به انتهای N زیرواحد دوم متصل می شود. پلاسمیدهای pGEMHE حاوی ساختارهای مختلف با آنزیم های محدود کننده Nhe1 یا Sph1 (New England Biolabs) خطی شدند و سنتز RNA با انجام شد. کیت رونویسی mMachine T7 mMessage (Ambion). 1-3 روز قبل از اندازه‌گیری‌های الکتروفیزیولوژیک، cRNA به تخمک Xenopus (50 nl در هر سلول، 0.3-1.5 μg/μl) تزریق شد. تخمک‌های مرحله V و VI از Xenopus laevis (NASCO) به دست آمد. از Ecocyte Bioscience. پس از تزریق RNA، سلول‌ها در محیط ND96 حاوی 96 میلی‌مولار NaCl، 2 میلی‌مولار KCl، 1.8 میلی‌مولار CaCl، 1 میلی‌مولار MgCl، 10 میلی‌مولار HEPES، 5 میلی‌مولار پیرووات، 100 میکروگرم 7 میکروگرم بر میلی‌لیتر سانتی‌گراد، 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر سانتی‌گراد نگهداری شدند. .
2-گوانیدینو-بنزیمیدازول[1]، 2-گوانیدینو-بنزوتیازول[2]، (4-متیل-1،3-تیازول-2-یل) گوانیدین [5]، (5-برومو-4-متیل-1،3 -تیازول-2-ایل) گوانیدین) [6]، اتیل 2-گوانیدینو-5-متیل-1،3-تیازول-4-کربوکسیلات [8]، اتیل 2-گوانیدینو-4- متیل-1،3-تیازول- 5-کربوکسیلات [9] و (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) اتیل استات [10] از Sigma-Aldrich بودند. Famotidine [7] از MP Biomedicals.1-[4] بود. -(4-کلروفنیل)-1،3-تیازول-2-یل]گوانیدین[11] و 1-[4-(3،4-دی متوکسی فنیل)-1،3- تیازول-2-یل] گوانیدین [12] بود. از Matrix Scientific. این ترکیبات دارای بالاترین خلوص تجاری موجود هستند. آنها در DMSO خشک حل شدند تا یک محلول ذخیره 100 میلی مولار تولید شود، که سپس در محلول ضبط شده در غلظت نهایی مورد نظر رقیق شد. ترکیبات 3 و 4 در زیر سنتز شدند. حداقل خلوص 99 درصد
به سوسپانسیون 2-آمینو-4-(تری فلورومتیل) بنزنتیول هیدروکلراید (1.02 گرم، 4.5 میلی مول) در 25 میلی لیتر اسید هیدروکلریک آبی (2.5 نیوتن) دی سیاندی آمید جامد (380 میلی گرم، 4.5 میلی مول)، و مخلوط ناهمگن حاصل اضافه شد. مخلوط واکنش تا دمای اتاق خنک شد و با افزودن تدریجی 10 نیوتن هیدروکسید پتاسیم خنثی شد. 65 درجه سانتیگراد) به مدت چند ساعت، و سپس از اتیل استات/پترول اتر متبلور شد تا جامد سفید (500 میلی گرم، 48 درصد) به دست آید. mp 221-222 ° C (نور 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 مگاهرتز، DMSO-d6): δ [ppm] = 7.25 (s بسیار وسیع، 4 H)، 7.40 (d، 1 H، J = 8.1 هرتز)، 7.73 (s، 1 H)، 7.92 (d ، 1 H، J = 8.1 هرتز). 13C NMR (200 مگاهرتز، DMSO-d6): δ = 114.2 (d، J = 3.5 هرتز)، 117.5 (d، J = 3.5 هرتز)، 121.7، 124.6 (q، J = 272 هرتز)، 126.1 (q، J = 272 هرتز) = 31.6 هرتز)، 134.8، 152.1، 158.4، 175.5.HRMS (ESI): m/z مقدار محاسبه شده. برای C9H8F3N4S (M + H) +: 416، یافت شد. : 261.0419.
نفتو[1،2-d]تیازول-2 آمین (300 میلی گرم، 1.5 میلی مول)، سنتز شده همانطور که قبلا توضیح داده شد، در یک حمام روغن در یک لوله آزمایش کوچک تا دمای 200 درجه سانتیگراد حرارت داده شد. 300 میلی گرم (بیش از حد زیاد) سیانامید و 1.0 میلی لیتر conc. به ترکیب داغ به سرعت اسید کلریدریک اضافه شد و مخلوط به مدت 2 دقیقه در حمام روغن نگه داشت و در این مدت بیشتر آب تبخیر شد. سپس مخلوط واکنش تا دمای اتاق خنک شد و مواد جامد حاصل شد. به قطعات کوچک شکسته شد و با آب شسته شد تا یک جامد آمورف زرد کم رنگ ایجاد شود. 1H NMR (500 مگاهرتز، DMSO-d6، D2O): δ [ppm] = 7.59 (t، 1 H، J = 8.2 هرتز)، 7.66 (t، 1 H، J = 8.3 هرتز)، 7.77 (d، 1 Hz ، J = 8.6 هرتز)، 7.89 (d، 1 H، J = 8.6 هرتز)، 8.02 (d، 1 H، J = 8.2 هرتز)، 8.35 (d، 1 H، J = 8.3 هرتز).13C NMR (150 مگاهرتز، DMSO-d6): δ = 119.9، 122.7، 123.4، 123.6، 126.5، 127.1، 128.7، 132.1، 140.7، 169.1.HRMS (ESI): m/z: m/z: H20H4+1. ، یافت شده: 243.0704.
جریان پروتون در تکه‌های داخلی و خارجی تخمک‌ها که ساختارهای متفاوتی را بیان می‌کنند با استفاده از تقویت‌کننده Axopatch 200B که توسط Axon Digidata 1440A (دستگاه‌های مولکولی) با نرم‌افزار pClamp10 کنترل می‌شود اندازه‌گیری شد. محلول‌های درون سلولی و خارج سلولی دارای ترکیب یکسانی هستند: 100 mMM اسید اتان سولفونیک (MES)، 30 میلی‌مولار تترا اتیل آمونیوم (TEA) مزیلات، 5 میلی‌مولار کلرید چای، 5 میلی‌مولار اتیلن گلیکول-بیس (2-آمینواتیل)-N، N، N'، N'-تترااستیک اسید (EGTA)، تنظیم شده به pH 6.0 با هیدروکسید TEA. همه اندازه‌گیری‌ها در دمای 2 ± 22 درجه سانتی‌گراد انجام شد. پیپت دارای مقاومت دسترسی 1.5-4 MΩ است. آثار فعلی در 1 کیلوهرتز فیلتر شدند، در 5 کیلوهرتز نمونه‌برداری شدند و با Clampfit10.2 (دستگاه‌های مولکولی) آنالیز شدند. ) و Origin8.1 (OriginLab).
محلول‌های حاوی غلظت‌های مختلف بازدارنده Hv1 و در برخی موارد 10 میلی‌مولار βME توسط گرانش از طریق یک منیفولد متصل به یک سیستم شیر پرفیوژن VC-6 (Instr. Warner) وارد حمام شدند که از طریق نرم‌افزار pClamp TTL (Transistor-) عبور داده شد. سیگنال‌های منطق ترانزیستوری اندازه گیری پالس دپلاریزاسیون +120 میلی ولت. GV همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد. برای تصحیح واپاشی جریان 18 استفاده می شود. نمودار GV با معادله بولتزمن مطابقت دارد:
ثابت‌های تفکیک ظاهری (Kd) برای ترکیب‌های مختلف کانال‌ها و بازدارنده‌ها (جدول تکمیلی 1) با برازش وابستگی به غلظت مهار (میانگین درصد مقادیر بازدارنده) با معادله Hill تعیین شد:
که در آن [I] غلظت بازدارنده I و h ضریب هیل است. برای محاسبه ضریب هیل، معادله (2) به صورت زیر مرتب می شود: