Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія веб-переглядача, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений веб-переглядач (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити продовження підтримки, ми будемо відображати сайт без стилів і JavaScript.
Напругозалежний протонний канал Hv1 є димерним комплексом, що складається з двох напругочутливих доменів (VSD), кожен з яких містить закритий шлях проникнення протонів. Дімеризація контролюється цитоплазматичним спіральним доменом. Перехід від закритого стану до відомо, що відкритий стан в обох VSD відбувається спільно; однак мало що відомо про механізми, що лежать в основі. Інтерфейси між суб'одиницями відіграють ключову роль в алостеричних процесах; однак такі інтерфейси не були ідентифіковані у відкритих каналах Hv1. Тут ми демонструємо, що похідні 2-гуанідинотіазолу спільно блокують два VSD Hv1 і використовують одну з цих сполук як зонд для алостеричного зв’язку між відкритими субодиницями. Ми виявили, що позаклітинний кінець першого трансмембранного фрагмента VSD утворює міжсуб'одиничний інтерфейс, який опосередковує зв'язування між сайтами зв'язування, тоді як спіральний домен не бере безпосередньої участі в цьому процесі. Ми також знайшли вагомі докази того, що протон-селективний фільтр каналу контролює кооперативність зв'язування блокаторів .
Напругозалежні протонні канали відіграють важливу роль у різноманітних організмах, від фітопланктону до людини1. У більшості клітин ці канали опосередковують вихід протонів із протонної мембрани та регулюють активність НАДФН-оксидази. Єдиний відомий напругозалежний протонний канал у людини є Hv1, який є продуктом гена HVCN12,3. Показано, що Hv1 (він же VSOP) відіграє роль у проліферації В-клітин4, виробництві активних форм кисню вродженою імунною системою5,6,7,8, сперматозоїдом регуляція рухливості9 та рН рідини на поверхні дихальних шляхів10. Цей канал бере участь у кількох типах раку, таких як В-клітинні злоякісні новоутворення4,11 та рак молочної залози та колоректальний рак12,13. Було виявлено, що надмірна активність Hv1 збільшує метастатичний потенціал ракових клітин11,12. У мозку Hv1 експресується мікроглією, і було показано, що його активність посилює пошкодження мозку на моделях ішемічного інсульту.
Білок Hv1 містить вольтаж-чутливий домен (VSD), який складається з чотирьох трансмембранних сегментів, які називаються S1-S414. VSD нагадує відповідні домени вольтаж-залежних Na+, K+ і Ca2+-каналів і вольтаж-чутливих фосфатаз, таких як CiVSP з Ciona gutis15. У цих інших білках C-кінець S4 приєднаний до ефекторного модуля, домену пор або ферменту. У Hv1 S4 пов’язаний із доменом спіралі (CCD), розташованим на цитоплазматичній стороні мембрани. .Канал є димерним комплексом, що складається з двох VSD, кожен з яких містить закритий шлях проникнення протонів16,17,18. Було виявлено, що ці дві субодиниці Hv1 відкриваються спільно19,20,21,22, що свідчить про алостеричне з’єднання та взаємодію між субодиницями. грає важливу роль у процесі стробування. Інтерфейс між субодиницями всередині спірального домену добре визначений, оскільки доступні кристалічні структури двох ізольованих доменів 22, 23. З іншого боку, інтерфейс між VSD всередині мембрани не добре зрозуміло. Кристалічна структура химерного білка Hv1-CiVSP не надає інформації про цей інтерфейс, оскільки тримерна організація комплексу кристалізованого каналу може бути результатом заміни нативного Hv1 CCD дріжджовою лейциновою застібкою GCN424.
Нещодавнє дослідження субодиничної організації каналу Hv1 показало, що дві спіралі S4 переходять у CCD без серйозного порушення вторинної структури, що призводить до довгих спіралей, які починаються від мембрани та виступають у цитоплазму. На основі аналізу зшивання цистеїну, це дослідження передбачає, що Hv1 VSD контактують один з одним вздовж сегмента S4. Однак інші дослідження пропонують альтернативні інтерфейси між VSD. Ці інтерфейси включають сегменти S1 17, 21, 26 і зовнішні кінці сегмента S2 21. Можлива причина конфлікту Результати цих досліджень полягають у тому, що алостеричний зв’язок між VSD досліджувався у зв’язку з процесом стробування, який залежить від закритого та відкритого станів, а межа розділу між VSD може змінюватися в різних станах і змінах конформації.
Тут ми виявили, що 2-гуанідинотіазол інгібує канали Hv1 шляхом синергічного зв’язування з двома відкритими VSD, і використали одну зі сполук, 2-гуанідинобензотіазол (GBTA), щоб дослідити взаємодію між субодиницями у відкритому стані. Ми виявили, що крива зв’язування GBTA може бути добре описана кількісною моделлю, у якій зв’язування інгібітора з однією субодиницею призводить до збільшення афінності зв’язування сусідньої субодиниці. Ми також виявили, що залишки D112, селективні фільтри для канал 27, 28 і частина сайту 29 зв'язування похідного гуанідину контролюють кооперативність зв'язування GBTA. Ми показуємо, що кооперативне зв'язування підтримується в димері Hv1, де CCD відокремлюється від сегмента S4, що свідчить про те, що міжсубодиничний інтерфейс у CCD не впливає безпосередньо на опосередковують алостеричне з’єднання між ділянками зв’язування GBTA. Навпаки, ми виявили, що фрагмент S1 є частиною інтерфейсу між субодиницями, і пропонуємо розташування суміжних VSD з позаклітинним кінцем спіралі S4, віддаленим від центру димера, щоб дозволити фрагмент S1 перебувати у відкритому стані.
Маленькі молекулярні інгібітори Hv1 корисні як протипухлинні ліки та нейропротекторні агенти. Однак на сьогоднішній день небагато сполук здатні інгібувати канал30,31,32,33. Серед них 2-гуанідінобензімідазол (2GBI, сполука [1] на рис. Було виявлено, що 2-гуанідинобензотіазол (GBTA, сполука [2] на малюнку 1a) і його похідні блокують проникнення протонів через канал. раніше було показано, що він інгібує Hv1 майже так само ефективно, як 2GBI при тестуванні в концентрації 200 мкМ (рис. 1b). Ми досліджували інші похідні тіазолу та виявили, що деякі з них інгібують канал з такою ж або більшою ефективністю, ніж GBTA (рис. 1 і додаткова інформація). текст). Ми визначили криві концентраційної відповіді чотирьох похідних тіазолу (GBTA та сполук [3], [6] і [11], рис. 1c) і виявили, що вони крутіші, ніж у 2GBI. Коефіцієнти Хілла (h) похідних тіазолу коливався від 1,109 ± 0,040 до 1,306 ± 0,033 (рис. 1c і додатковий рис. 1). Навпаки, коефіцієнт Хілла для 2GBI становив 0,975 ± 0,024 29, рис. 2a і додатковий рис. 1). Коефіцієнт Хілла вище 1 вказує на кооперативність зв’язування. Оскільки кожна субодиниця Hv1 має власний інгібітор- сайту зв’язування,29,32 ми припустили, що зв’язування похідної тіазолу з однією субодиницею може посилити зв’язування другої молекули інгібітора з сусідньою субодиницею. GBTA була досліджуваною сполукою з найвищим коефіцієнтом Хілла. Тому ми вибрали цю сполуку для далі вивчали механізм синергії зв'язування і використовували 2GBI як еталонний негативний контроль.
(a) Досліджувані сполуки: [1] Еталонний інгібітор Hv1 2-гуанідино-бензімідазол (2GBI).[2] 2-гуанідино-бензотіазол (GBTA), [3] (5-трифторметил-1,3-бензотіазол-2-іл)гуанідин, [4] нафто[1,2-d][1, 3] тіазол-2-іл -гуанідин, [5](4-метил-1,3-тіазол-2-іл)гуанідин, [6](5-бром-4-метил-1,3-тіазол-2-іл)гуанідин, [7] фамотидин, [8] етиловий ефір 2-гуанідино-5-метил-1,3-тіазол-4-карбонової кислоти, [9] 2-гуанідино-4-метил етил-1,3-тіазол-5-карбоксилат, [10 ](2-гуанідино-4-метил-1,3-тіазол-5-іл)етилацетат, [11]1-[4-(4-хлорфеніл)-1,3-тіазол-2-іл]гуанідин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифеніл)-1,3-тіазол-2-іл]гуанідин. (b) Інгібування активності людського Hv1 зазначеними гуанідинотіазолами та еталонною сполукою 2GBI (синьо-зелені стовпчики) Протонні струми .Hv1 вимірювали в бляшках ооцитів Xenopus у відповідь на деполяризацію від утримуючого потенціалу від -80 мВ до +120 мВ. Кожен інгібітор додавали до ванни в концентрації 200 мкМ. pHi = pHo = 6,0 .Дані є середніми ± SEM (n≥4). (c) Залежне від концентрації інгібування людського Hv1 сполуками [2], [3], [6] і [11]. Кожна точка представляє середнє інгібування ± SD 3 до 15 вимірювань. Лінія є підгонкою Хілла, яка використовується для отримання уявних значень Kd, наведених у Додатковій таблиці 1. Коефіцієнти Хілла були визначені на основі підгонки, наведеної в Додатковому малюнку 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (див. Методи).
(a,b) Сполуки 2GBI і GBTA інгібували димерний і мономерний Hv1 залежно від концентрації. Кожна точка представляє середнє інгібування ± стандартне відхилення від 3 до 8 вимірювань, а крива є підгонкою Хілла. Коефіцієнти Хілла (h), показані на вставлені гістограми були визначені з підгонки, наведеної на додаткових малюнках 3 і 4. Концентраційна реакція GBTA, показана на (a), є такою ж, як на рис. 1c. Див. Додаткову таблицю 1 для уявних значень Kd. (c) Моделювання кооперативне зв’язування GBTA з димерним Hv1. Суцільна чорна лінія відображає відповідність експериментальним даним за рівнянням (6), яке описує модель зв’язування, показану в (d). Пунктирні лінії, позначені Sub 1 і Sub 2, представляють бімолекулярну асоціацію -криві рівноваги дисоціації для першої та другої подій зв’язування відповідно (підпункт 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 мкМ; підпункт 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 мкМ ).(d) Схематична діаграма запропонованого механізму блоку Hv1. У випадку GBTA зв’язування з однією відкритою субодиницею збільшує спорідненість сусідньої відкритої субодиниці (Kd2 Канали Hv1 можна мономеризувати шляхом заміни їх N- і C-кінцевих цитоплазматичних доменів відповідними частинами вольтаж-чутливої фосфатази Ciona Intestinalis CiVSP (Hv1NCCiVSP)18, 34. Ми виміряли концентраційну залежність інгібування мономерного Hv1 GBTA і 2GBI і порівняли їх із інгібуванням димерного каналу (дикого типу) (рис. 2a, b). Ми виявили, що різниця в кооперативності зв’язування між двома сполуками була усунена в мономерному Hv1, підтверджуючи пояснення того, що зв’язування GBTA з однією субодиницею збільшує спорідненість іншої субодиниці з інгібітором. Ми припустили, що зв’язування GBTA з однією субодиницею Hv1 може призвести до перегрупування сайту зв’язування (індукуючи fit35), що призведе до перегрупування вакантного сайту зв’язування сусідньої субодиниці, що призведе до посилення зв’язування спорідненість.
Щоб кількісно описати кооперативне зв’язування GBTA з каналом, ми використали модель, у якій будь-яка субодиниця може зв’язувати першу молекулу інгібітора після бімолекулярної реакції з константою дисоціації Kd1 (рис. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*). Зв’язування призводить до того, що канал приймає стан, у якому залишилися порожні субодиниці зв’язуються з інгібітором після унікальної бімолекулярної реакції з константою дисоціації Kd2, де Kd2 Суцільна чорна лінія на малюнку 2c — це підгонка рівняння моделі до експериментальної кривої концентрація-відповідь, що дає Kd1 ~290 мкМ і Kd2 ~29 мкМ (розділ «Методи», рівняння (6)). Модель також описує зв’язування 2GBI, де Kd2 ≈ Kd1 = Kd (рис. 2d). У мономерному Hv1 є лише один сайт зв’язування та один Kdm (O° + B ⇆ B°). У випадку GBTA Kdm становить близько 54 мкМ, що більше схоже на Kd1, ніж на Kd2 (рис. 2d). Іншими словами, сайт зв’язування мономеру знаходиться в конфігурації (O°), більш подібній до високоафінного стану (BO*), ніж низько- стан спорідненості (OO) димера, швидше за все, внаслідок усунення поверхні розділу між субодиницями.
Як було показано раніше для 2GBI32, ми виявили, що GBTA пригнічує струми Hv1, блокуючи канал, коли він був відкритий, а не ускладнює його відкриття (додатковий рис. 2a, b, d). Відомо також, що 2GBI викликає повільно загасаючі хвостові струми у відповідь на реполяризацію мембрани, але це явище не спостерігалося у GBTA (додаткова рис. 2c). За наявності інактивації Hv1 у присутності 2GBI ворота в кожній субодиниці не можуть закритися, доки блокатор не покине сайт зв’язування (« механізм ножних воріт), а 2GBI від’єднується повільніше, ніж ворота закриваються. Якщо одну субодиницю Hv1 розблокувати та закрити, а сусідня субодиниця залишається заблокованою, роз’єднання решти молекул 2GBI стає повільнішим (захоплення блокаторів). Довгоживучі канальні види з лише одна заблокована субодиниця тимчасово проводить протони перед закриттям і робить значний внесок у повільно затухаючий хвостовий струм.
Висновок про те, що розпад хвостових струмів Hv1 не сповільнювався суттєво в присутності GBTA (додаткова рис. 2c), узгоджується з синергетичним механізмом зв’язування для цього блокатора (рис. 2d). Після того, як молекула GBTA від’єднується від субодиниці Hv1, , спорідненість блокатора до сусідньої субодиниці падає приблизно в 10 разів, сприяючи процесу роз’єднання. Це означає, що друга молекула GBTA має набагато більший шанс розпастися, перш ніж потрапить у пастку каналу. Довгоживучі канальні види, Очікується, що продукція лише однієї блокуючої субодиниці буде набагато більшою у присутності GBTA, ніж у присутності 2GBI, що призводить до швидшого розпаду хвостового струму.
Щоб GBTA міг спільно зв’язуватися з обома субодиницями Hv1, сайти зв’язування мають бути алостерично пов’язані. Кожен сайт зв’язування має бути здатним: 1) запускати ланцюг подій, які взаємодіють із сусідніми субодиницями, зв’язаними з інгібітором, і 2) опосередковувати перехід від зв’язування з низькою спорідненістю до зв’язування з високою спорідненістю. Ми прийшли до висновку, що якщо специфічні залишки в межах сайту зв’язування сприяють процесу взаємодії, їх мутація повинна змінити коефіцієнт Хілла на кривій «концентрація-відповідь» інгібування GBTA Hv1. Залишки D112, F150 Раніше було показано, що S181 і R211 є частиною середовища зв’язування 2GBI29, і ми припустили, що вони так само будуть залучені до зв’язування GBTA (рис. 3A). Ми виміряли криві інгібіторної концентрації-відповіді GBTA для мутантних каналів D112E, F150A, S181A і R211S (рис. 3) і порівняли їхні коефіцієнти Хілла з коефіцієнтами Hv1 дикого типу, використовуючи 2GBI як еталон. Залишок V109 знаходиться на тій самій поверхні сегмента S1, що й D112, і має один додатковий спіральний поворот всередині клітини. Оскільки V109 не брав участь у зв'язуванні 2GBI29, ми використовували мутант V109A як контроль (рис. 3б).
(a) Передбачувані залишки Hv1, що беруть участь у зв’язуванні похідного гуанідину. Пунктирні сині криві оточують раніше запропоновані бічні ланцюги, які взаємодіють з різними частинами сполуки 2GBI29. (bf) Залежне від концентрації інгібування вказаних мутантів Hv1 сполуками 2GBI (блакитний) і GBTA ( темно-червоний). Кожна точка представляє середнє інгібування від 3 до 12 вимірювань ± SD V109 як негативний контроль. Криві є підгонкою Хілла, що використовується для отримання уявних значень Kd (див. Додаткову таблицю 1). Коефіцієнти Хілла (h), показані в вставлені гістограми були визначені з відповідностей, наведених на додаткових малюнках 3 і 4. Еталонні значення h для Hv1 WT показані пунктирними лініями. Зірочки вказують на статистично значущі відмінності між пасажами мутанта та WT (p Ми виявили, що мутація D112E значно зменшила коефіцієнт Хілла (p Виявлення того, що коефіцієнт Хілла для зв’язування GBTA є вищим за 1 у димері Hv1 і стає ~1 у мономерному каналі (рис. 2b), узгоджується з існуванням алостеричних взаємодій між сайтами зв’язування в двох субодиницях. Якщо це у цьому випадку коефіцієнт Хілла зв’язування GBTA з димером, з яким блокатор зв’язувався з однією субодиницею, має становити ~1. Ми перевірили це передбачення на пов’язаному димері Hv1 F150A-WT (рис. 4a), де спорідненість F150A Субодиниця GBTA була більш ніж на 2 порядки вище, ніж у субодиниці WT (рис. 1c і 3d). Потім ми виміряли криві концентрація-відповідь для інгібування субодиниці WT при базальній концентрації 2 мкМ GBTA. При цій концентрації , очікується, що блокатор зв’яже приблизно 99% субодиниці F150A та (a) Схематична діаграма димера з’єднання F150A-WT, який використовується для створення блокуючого півканалу ({F150A}b-WT/BAO*). Білі ромби показують розташування мутації. У станах BAO* і BA*B* Очікується, що спорідненість субодиниці F150A буде вищою, ніж субодиниці WT. (b) Протонні струми з каналів F150A-WT, виміряні у відповідь на зміни мембранного потенціалу від -80 мВ до +120 мВ. pHi = pHo = 6,0 .Сірі сліди представляють струми, виміряні за відсутності інгібітора. Чорні сліди (контроль) представляють струм, виміряний після додавання 2 мкМ GBTA. При цій концентрації субодиниця WT істотно не пригнічується, тоді як субодиниця F150A майже повністю зв’язується з GBTA ({F150A}b-WT). Подальше збільшення концентрації GBTA призвело до блокування субодиниці WT (помаранчеві та червоні сліди). (c) Залежне від концентрації інгібування димеру {F150A}b-WT (інгібітор, попередньо зв’язаний з Субодиниця F150A). Кожна точка представляє середнє інгібування ± стандартне відхилення від 3 до 7 вимірювань. Криві були підгонками Хілла, використаними для отримання уявних значень Kd, наведених у Додатковій таблиці 1. Коефіцієнти Хілла, показані на вставних гістограмах, були визначені з підгонок, наведених у Додаткових малюнках 3 і 4. Значення h Hv1 WT є показано пунктирними лініями. Зірочки вказують на статистично значущі відмінності порівняно з WT димером Hv1 (p Оскільки інгібування GBTA Hv1 вимірювали у відкритому каналі, ми припустили, що кооперативність зв’язування GBTA може бути використана для вивчення механізму з’єднання між суб’одиницями у відкритому стані. Раніше було встановлено, що ці дві субодиниці Hv1 є кооперативно закритими 19, 20, 21, 22, і було запропоновано, що міжсубодиничне з’єднання, яке бере участь у стробуванні, опосередковується цитоплазматичним спіральним доменом (CCD) 22, 25. Тому ми запитали, чи бере участь CCD також у з’єднанні між GBTA-зв’язуючими сайтами у відкритому стані. Тригліцин мутації на межі між трансмембранним фрагментом S4 і доменом спіралі, як було показано в попередніх дослідженнях, відокремлюють цей домен від решти каналу, зберігаючи при цьому цілісність димеризації. Таким чином, ми протестували ефект мутацій V220G, K221G і T222G (рис. 5a, мутант GGG) на кооперативність зв'язування GBTA. Ми виявили статистично незначуще (p > 0,05) зниження коефіцієнта Хілла зв'язування GBTA з GGG-каналами порівняно з диким типом (рис. 5c), що свідчить про те, що, незважаючи на його роль у збереженні дві субодиниці разом важливі, але CCD безпосередньо не опосередковує міжсубодиничне алостеричне з’єднання між сайтами зв’язування GBTA.
(a) Схематична діаграма димеру Hv1 з мутацією тригліцину на внутрішньому кінці S4, розробленою для порушення міжсубодиничного зв’язку, опосередкованого цитоплазматичним доменом спіралі (сині стрілки). (b) Схематичне зображення димерів Hv1 і димерів лігування з зазначені мутації, призначені для перевірки фрагментів S1, залучених до зв’язування між субодиницями (сині стрілки). (c–h) 2GBI (блакитний) і GBTA (темно-червоний) інгібують вказані конструкції залежно від концентрації. Кожна точка представляє середнє інгібування ± SD від 3 до 10 вимірювань. Крива була підгонкою Хілла, використовуваною для отримання уявних значень Kd (див. Додаткову таблицю 1). Коефіцієнти Хілла в інтерпольованих гістограмах були визначені, як описано в розділі «Методи» (див. Додаткові рис. 3 і 4). Довідкові значення h для Hv1 WT показано пунктирними лініями. Зірочки вказують на статистично значущі відмінності між пасажами мутанта та WT (p Оскільки ми виключили CCD як прямий посередник кооперативного зв’язування GBTA, ми запитали, чи взаємодія між VSD залучена до алостеричного зв’язування між сайтами зв’язування. Ми виявили, що кооперативність зв’язування GBTA була скасована консервативною мутацією залишку D112 (рис. 3c), розташованого у трансмембранному сегменті S1. S1 містить два інші негативно заряджені залишки, E119 і D123, розташовані з того самого боку спіралі, що й D112, але ближче до зовнішнього кінця 24 фрагмента. Ранні молекулярно-динамічні моделювання показали, що ці залишки були пов’язані між собою. до D112 через ватерлінії36,37. Таким чином, ми перевірили, чи E119 і D123 беруть участь в алостеричному з’єднанні між GBTA-зв’язуючими сайтами (рис. 5b). Як негативний контроль ми перевірили збережену позитивно заряджену позицію K125, яка розташована поблизу D123 але з іншого боку спіралі S1 (рис. 5b).
Ми виміряли залежне від концентрації інгібування каналів E119A, D123A та K125A за допомогою 2GBI та GBTA та виявили, що мутації E119A та K125A істотно не змінили коефіцієнт Хілла будь-якого інгібітора порівняно з диким типом (p> 0,05, рис. 5d,i). ). З іншого боку, мутація D123A значно зменшила коефіцієнт Хілла GBTA (p 0,05/14).
Оскільки нейтралізація заряду в позиції 123 на обох субодиницях призвела до сильної зміни кооперативності зв’язування GBTA, тоді як реверсування заряду на обох субодиницях мало лише невеликий ефект, ми розширили аналіз, щоб включити лише одну субодиницю з каналом інверсії заряду. Ми генерували Hv1-пов’язані димери із заміщенням D123R у C-кінцевій субодиниці (рис. 5b) і вимірювали інгібування концентраційної відповіді за допомогою GBTA та 2GBI. Ми виявили, що коефіцієнт Хілла зв’язування GBTA з каналами WT-D123R був значно вищим, ніж дикого типу Hv1 (p Ми також виявили, що мутація D112E скасувала збільшення коефіцієнта Хілла зв’язування GBTA, спричинене фоном WT-D123R (рис. 5b,h та додаткова рис. 4). Вплив на коефіцієнт Хілла зв’язування 2GBI також було усунено ( Рис. 5h і додаткова рис. 3). Ці висновки свідчать про те, що посилений алостеричний зв’язок між субодиницями, викликаний протилежними зарядами в позиції 123, не перетворюється на сильнішу кооперативність зв’язування, коли сайт зв’язування в позиції D112 порушується.
Ми припустили, що якби залишки D123 на сусідніх відкритих субодиницях були достатньо близькі, щоб електростатично взаємодіяти одна з одною, відштовхуюча взаємодія між негативними зарядами перетворилася б на комбінацію негативних і позитивних зарядів шляхом заміни аспарагінової кислоти на аргінін. приваблива взаємодія між ними. Одна субодиниця (димер WT-D123R). Приваблива взаємодія може зміцнити інтерфейс між зовнішніми кінцями фрагмента S1, що призводить до сильнішого алостеричного зв’язку між субодиницями та збільшення кооперативності GBTA-зв’язування.
Щоб підтвердити цю гіпотезу, ми шукали спосіб зміцнення межі між зовнішніми кінцями сегмента S1, який відрізняється від перемикання заряду в позиції 123. Лі та ін. Мутація залишку Hv1 I127 на цистеїн була виявлена раніше що призводить до спонтанного міжсубодиничного перехресного зшивання17. Крім того, кристалічна структура химерного VSD Hv1-CiVSP вказує на те, що I127 відокремлений від зовнішнього кінця спіралі S1 лише одним залишком24. Тому ми запитали, чи утворення ковалентного зв’язку між цистеїни в положенні 127, які, як очікується, призведуть до більш сильної взаємодії S1-S1, мають вплив на кооперативність зв'язування GBTA, подібний до того, що спостерігається при зміні заряду в положенні 123.
Ми вимірювали залежне від концентрації інгібування Hv1 I127C за допомогою GBTA та 2GBI у присутності та відсутності 10 мМ β-меркаптоетанолу (βME) (рис. 6a). У той же час, коли інгібітор додають до внутрішньоклітинного розчину, зниження агент додають до позаклітинного розчину. Зв’язаний димер із заміщенням цистеїну лише в одній субодиниці (WT-I127C) використовувався як негативний контроль (рис. 6а). Нам не вдалося виміряти будь-який ефект спонтанного міжсубодиничного зшивання між субодиницями I127C при інгібуванні 2GBI, оскільки коефіцієнт Хілла для зв’язування I127C з Hv1, з або без βME, значно відрізнявся від коефіцієнта для зв’язування з димерами, заміщеними моноцистеїном. Коефіцієнт Хілла не міг диференціювати WT-I127C (рис. 6b і додатковий рис. 3). На відміну від цього, ми виміряли драматичний ефект спонтанного зшивання між субодиницями на інгібування GBTA. Коефіцієнт Хілла для зв’язування з Hv1 I127C за відсутності βME (поперечне зшивання увімкнено) було значно вищим, ніж виміряно в присутності βME (поперечне зшивання вимкнено) або з використанням WT-127C для зв’язування димеру (за відсутності зшивання) (рис. 6c і додатковий рис. 4), що вказує на те, що алостеричний зв’язок між сайтами зв’язування значно посилюється утворенням дисульфідних зв’язків між зовнішніми кінцями фрагментів S1. Ці результати підтверджують нашу інтерпретацію того, що приваблива електростатична взаємодія аспартату та аргініну в положенні 123 у димері WT-D123R призводить до збільшення алостеричного зв’язку між субодиниці.
З’єднання у відкритому стані опосередковується прямою фізичною взаємодією між зовнішніми кінцями сегмента S1 у двох субодиницях.
(a) Схематичне представлення мутантних димерів Hv1 і димерів лінкерів, призначених для дослідження того, як міжсубодиничні зшивки цистеїну впливають на кооперативність зв’язування GBTA. (bd) Залежне від концентрації інгібування вказаних конструкцій 2GBI (b, d) і GBTA (c, e) у присутності або відсутності 10 мМ βME у позаклітинному розчині. Кожна точка являє собою середнє інгібування ± стандартне відхилення від 3 до 10 вимірювань. Крива була підгонкою Хілла, яка використовувалася для отримання значень Kd (див. Додаткову таблицю 1). Коефіцієнти Хілла у вставних гістограмах були визначені на основі підгонок, наведених у Додаткових малюнках 3 і 4. Зірочки в (c,e) вказують на статистично значущі відмінності між різними умовами інгібування GBTA (p 0,05).
Ми також виявили, що за відсутності βME коефіцієнт Хілла зв’язування GBTA з димером D112E I127C Hv1 був значно вищим, ніж виміряний у присутності відновників (рис. 6e та додатковий рис. 4), що означає, що мутація D112E не скасовує підвищення кооперативної здатності зв’язування GBTA в результаті перехресного зшивання цистеїну 127. Коефіцієнт Хілла зв’язування 2GBI з димерами D112E, I127C Hv1 також не зазнав суттєвого впливу мутації D112E (рис. 1). 6d і додаткові рис. 3).
У сукупності ці результати свідчать про те, що зв’язування GBTA посилюється взаємодією між зовнішніми кінцями фрагментів S1 у сусідніх субодиницях Hv1 через привабливі електростатичні взаємодії або через утворення ковалентних зв’язків між заміщеними цистеїнами. Алостеричний зв’язок між сайтами збільшується та призводить до кооперативності зв’язування. У той час як вплив привабливих електростатичних взаємодій на кооперативність можна скасувати мутацією D112E, ефект ковалентних зв’язків не може.
У нашому дослідженні хімічного простору, доступного для зв’язування похідних гуанідину з каналами Hv1, ми виявили, що 2-гуанідинотіазоли, такі як GBTA, мають більш різку залежність від концентрації, ніж 2-гуанідинобензимідазоли (рис. 1c). Аналіз коефіцієнта Хілла зв’язування GBTA з обома димерами і мономерних каналів (рис. 2a, b) і димерного каналу, в якому одна субодиниця була попередньо зв’язана з інгібітором (рис. 4), привели нас до висновку, що інгібування Hv1 за допомогою GBTA Дія є синергетичним процесом, і сайти зв’язування сполук у двох субодиницях алостерично з’єднані. Відкриття того, що GBTA зв’язується з відкритим каналом, як було показано раніше для спорідненої сполуки 2GBI32, свідчить про те, що алостеричне з’єднання можна спеціально оцінити у відкритому стані. Наша кооперативна модель зв’язування вдалося кількісно описати інгібування Hv1 за допомогою GBTA (рис. 2c) і пояснити різні ефекти 2GBI і GBTA на розпад хвостових струмів каналу після реполяризації мембрани, що підтверджує нашу інтерпретацію процесу зв’язування.
Максимальний коефіцієнт Хілла, якого можна досягти в алостеричному білку з двома сайтами зв’язування (наприклад, Hv1), становить 2. Ми виміряли GBTA для зв’язування Hv1 дикого типу з коефіцієнтом 1,31, який збільшився до 1,88 у Hv1 I127C. синергетичної вільної енергії, різниця між вільними енергіями зв’язування сайтів найнижчої та найвищої афінності (див. Методи) становила 1,3 ккал/моль у випадку Hv1 дикого типу та 2,7 ккал/моль у випадку Hv1 I127C. Зв’язування Перетворення кисню в гемоглобін є найвідомішим і добре вивченим прикладом спільного процесу38. Для людського гемоглобіну (тетрамер із чотирма алостерично пов’язаними сайтами зв’язування) коефіцієнт Хілла коливається від 2,5-3,0 із значеннями від 1,26 до 3,64 ккал/моль, залежно від експериментальних умов38. Таким чином, з точки зору глобальної енергетики, кооперативність зв’язування GBTA з Hv1 суттєво не відрізняється від зв’язування O2 з гемоглобіном, якщо врахувати різну кількість білкових субодиниць у двох системах.
У нашій моделі синергії зв’язування молекул GBTA з однією субодиницею призводить до збільшення спорідненості зв’язування сусідньої субодиниці. Ми передбачаємо процес, у якому перегрупування середовища зв’язування в результаті першої події зв’язування (індукована відповідність) призводить до зміни у взаємодіях між субодиницями. У відповідь на ці зміни сусідні субодиниці змінюють свої сайти зв’язування, що призводить до міцнішого зв’язування GBTA. Під час цього процесу S1 аспартат D112 відповідає за реорганізацію сайту зв’язування, пов’язану зі збільшенням афінності зв’язування. D112 раніше було показано, що він є частиною шляху проникнення протонів Hv1 і діє як селективний фільтр 27, 28. Наші результати показують, що фільтри селективності в двох субодиницях Hv1 алостерично пов’язані у відкритому стані. На малюнку 7а показано приблизне розташування сайту зв’язування GBTA та розташування залишків D112, D123, K125 та I127 на схемі Hv1 VSD на основі про кристалічну структуру химери Hv1-CiVSP. Пропоновані напрямки алостеричного зчеплення, що включає позаклітинний кінець S1, показано чорними стрілками.
(a) Схема Hv1 VSD. Виходячи з кристалічної структури химери Hv1-CiVSP, показано, що спіральні сегменти є циліндричними. У цій конфігурації внутрішній кінець сегмента S4 зливається з CCD (не показано). Передбачувані місця розташування зв’язаного GBTA показані сірими овалами. Чорні стрілки вказують шляхи, що беруть участь в алостеричному зв’язуванні між сайтами зв’язування в двох сусідніх субодиницях. Положення досліджуваних залишків S1 позначені кольоровими сферами. (b) Схематичне зображення розташованих субодиниць Hv1 у двох різних конфігураціях димерів, як видно з позаклітинної сторони площини мембрани. На лівій панелі межа розділу димерів утворена спіраллю S4. Обертання двох VSD на 20 градусів за годинниковою стрілкою навколо осі, перпендикулярної до площини мембрани, супроводжується поділ зовнішніх кінців двох спіралей S4 (штрихові стрілки) створює розташування, показане праворуч. У цій конфігурації залишкам D123 і I127 із сусідніх субодиниць дозволяється зближуватися. (c) Схематичне зображення CiVSP VSD у конфігурації димера, знайденої в кристалічній структурі 4G80. Положення P140 у CiVSP відповідає положенню D123 у Hv1.
Наші результати показують, що відштовхуюча електростатична взаємодія між залишком 123 (123D/123D або 123R/123R) пов’язана з «нормальним» рівнем зв’язування GBTA у відкритому стані та зміщує взаємодію з відштовхування на притягнуте (123D/123R) , посилення взаємодії (рис. 5g). Очікується, що усунення відштовхувальної взаємодії із заміщенням аланіну також призведе до підвищення кооперативності. Однак спостерігалося зниження кооперативності димеру 123A/123A (рис. 5e). Одна з можливих Пояснення полягає в тому, що дестабілізуючий ефект розміщення гідрофобних залишків у гідрофільному середовищі може переважити стабілізуючий ефект через усунення відштовхувальних взаємодій між залишками D123, що призводить до загального зниження зв’язувальної кооперативності. Mony та ін.39 нещодавно повідомили, що доступність розчинника при положення D171 Ciona gutis Ci-Hv1 (відповідає D123 у Hv1 людини) збільшується при активації, підтверджуючи уявлення про те, що D123 знаходиться в гідрофільному середовищі у відкритому стані.
Відомо, що стробування каналів Hv1 відбувається через численні переходи19, 20, 26, 39, 40, 41. Qiu та ін. , за яким слідує чіткий перехід, який змушує протони відкривати провідність на шляху обох субодиниць. Конформаційну зміну датчика напруги відстежували за допомогою флуоресценції фіксації напруги, і було виявлено, що другий перехід був вибірково порушений мутацією в положенні D171. Збурення флуоресцентного сигналу узгоджується з наявністю електростатичних взаємодій між залишками D171 сусідніх субодиниць у деякій точці вздовж координат реакції конформаційної зміни. Ця інтерпретація узгоджується з нашим висновком, що залишок D123 електростатично взаємодіє у відкритому стані. і забезпечує алостеричне зчеплення між сайтами зв'язування GBTA.
Fujiwara та інші25 припустили, що дімерний інтерфейс цитоплазматичного домену спіралі проходить у мембрану, щоб містити дві спіралі S4 (рис. 7b, ліва панель). Модель цієї взаємодії між суб’одиницями базується на аналізі перехресних зв’язків цистеїну, що охоплює весь VSD і функціональний аналіз області, що з’єднує спіраль S4 і CCD. За відсутності трансмембранного градієнта рН канали Hv1 вимагають значної деполяризації мембрани, щоб відкрити, і зшивання цистеїну відбувається в умовах, коли канал переважно закритий. Таким чином, виявлений інтерфейс S4-S4, ймовірно, відображає конфігурацію субодиниці поза станом. Інші дослідження знайшли докази участі S1 і S2 у взаємодії між субодиницями під час стробування17,21,26, що свідчить про те, що канали можуть приймати різні конфігурації субодиниці у відкритому та закриті стани, ідея узгоджується з висновками Моні та ін. S1 рухається на 39 під час стробування.
Тут ми показуємо, що у відкритому стані позаклітинні кінці спіралі S1 розташовані достатньо близько, щоб підтримувати прямі електростатичні взаємодії, які забезпечують алостеричний зв’язок між субодиницями. У конфігурації димера з розширеними взаємодіями S4-S4 спіралі S1 розташовані занадто далеко окремо один від одного, щоб безпосередньо взаємодіяти. Однак обертання на 20° за годинниковою стрілкою двох субодиниць VSD навколо осі, перпендикулярної до площини мембрани, у поєднанні з розділенням зовнішніх кінців двох спіралей S4 призвело до узгодженої конфігурації S1-S1. з нашими висновками (рис. 7b, права панель). Ми рекомендуємо цю конфігурацію для каналу у відкритому стані.
Хоча вважається, що фермент CiVSP функціонує як мономер, кристалічна структура його ізольованого VSD зафіксована в стані димера. Зовнішні кінці спіралей S1 у цьому димері просторово близькі один до одного, а загальна конфігурація подібна до запропонованої. для Hv1 (рис. 7c). У димері CiVSP найближчим залишком із сусідньої субодиниці був пролін у положенні 140 (рис. 7c). Цікаво, що P140 у CiVSP відповідає положенню D123 у Hv1. Подібність конфігурації субодиниці між Hv1 і димерів CiVSP свідчить про те, що VSD цих білків мають внутрішню тенденцію утворювати інтерфейс, де взаємодіють позаклітинні кінці S1.
Суттєва роль Hv1 в активації сперматозоїдів робить цей канал привабливою лікарською мішенню для контролю чоловічої фертильності. Крім того, було показано, що активація Hv1 у мікроглії погіршує відновлення після ішемічного інсульту. Виявлено, що посилена активність Hv1 пов’язана з нижчою виживання пацієнтів з раком молочної залози 12 або колоректальним раком 13 і, як вважають, сприяють злоякісним пухлинам B-клітин 11. Таким чином, низькомолекулярні препарати, націлені на Hv1, можна використовувати як нейропротекторні агенти або протипухлинні терапевтичні засоби. Відкриття того, що похідні гуанідинотіазолу можуть індукувати конформаційні перебудови в відкрита субодиниця Hv1, що призводить до збільшення афінності зв’язування, може призвести до розробки більш потужних ліків, спрямованих на канали Hv1.
Сайт-спрямований мутагенез Hv1 людини проводили з використанням стандартних методів ПЛР. У конструкції Hv1NCCiVSP залишки 1-96 і 228-273 Hv1 були замінені на залишки 1-113 і 240-576 CiVSP18. У зв'язаному з Hv1 димері C-кінець однієї субодиниці з’єднаний з N-кінцем другої субодиниці через лінкер GGSGGSGGSGSSGGSGG. Плазміди pGEMHE, що містять різні конструкції, були лінеаризовані ферментами рестрикції Nhe1 або Sph1 (New England Biolabs), а синтез РНК проводили за допомогою Набір для транскрипції T7 mMessage mMachine (Ambion). За 1-3 дні до електрофізіологічних вимірювань кРНК вводили в ооцити Xenopus (50 нл на клітину, 0,3-1,5 мкг/мкл). Були отримані ооцити стадії V і VI від Xenopus laevis (NASCO). від Ecocyte Bioscience. Після ін’єкції РНК клітини витримували в середовищі ND96, що містило 96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl, 1 мМ MgCl, 10 мМ HEPES, 5 мМ пірувату, 100 мкг/мл гентаміцину, pH 7,2 18°C .
2-гуанідино-бензімідазол[1], 2-гуанідино-бензотіазол[2], (4-метил-1,3-тіазол-2-іл)гуанідин [5], (5-бром-4-метил-1,3 -тіазол-2-іл)гуанідин) [6], етил 2-гуанідино-5-метил-1,3-тіазол-4-карбоксилат [8], етил 2-гуанідино-4- метил-1,3-тіазол- 5-карбоксилат [9] і (2-гуанідино-4-метил-1,3-тіазол-5-іл)етилацетат [10] були від Sigma-Aldrich. Фамотидин [7] був від MP Biomedicals.1-[4 -(4-хлорфеніл)-1,3-тіазол-2-іл]гуанідин[11] та 1-[4-(3,4-диметоксифеніл)-1,3-тіазол-2-іл]гуанідин [12] від Matrix Scientific. Ці сполуки найвищої чистоти, доступні на ринку. Їх розчиняли в сухому ДМСО для отримання 100 мМ основного розчину, який потім розводили в розчині для запису до бажаної кінцевої концентрації. Сполуки 3 і 4 синтезували нижче за допомогою не менше 99% чистоти.
До суспензії гідрохлориду 2-аміно-4-(трифторметил)бензолтіолу (1,02 г, 4,5 ммоль) у 25 мл водного розчину соляної кислоти (2,5 н.) додавали твердий диціандиамід (380 мг, 4,5 ммоль) і отриману гетерогенну суміш кип'ятили зі зворотним холодильником при інтенсивному перемішуванні протягом 4 годин. Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури і нейтралізували поступовим додаванням 10 н. гідроксиду калію. Білий осад, що утворився, відфільтровували, промивали холодною водою (3 × 50 мл), сушили в сушильній шафі ( 65 °C) протягом кількох годин, а потім перекристалізовували з етилацетату/петролейного ефіру з отриманням білої твердої речовини (500 мг, 48 %); т.пл. 221–222 °C (світло 225–226 °C) 45; 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (дуже широкий s, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Гц), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Гц).13C ЯМР (200 МГц, DMSO-d6): δ = 114,2 (d, J = 3,5 Гц), 117,5 (d, J = 3,5 Гц), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Гц), 126,1 (q, J = 272 Гц) = 31,6 Гц), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5. HRMS (ESI): m/z розраховане значення. Для C9H8F3N4S (M + H)+: 261,0416, знайдено : 261,0419.
Нафто[1,2-d]тіазол-2-амін (300 мг, 1,5 ммоль), синтезований, як описано раніше, нагрівали до 200 °C на масляній бані в маленькій пробірці. 300 мг (великий надлишок) ціанаміду та 1,0 мл конц. До гарячої сполуки швидко додавали хлористоводневу кислоту і суміш витримували на масляній бані приблизно 2 хвилини, за цей час більша частина води випарувалася. Потім реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури, і отриманий матеріал затвердів. розбивали на дрібні шматочки та промивали водою, отримуючи блідо-жовту аморфну тверду речовину (38 мг, 10%), т.пл. 246-250 °C; 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (т, 1 Н, J = 8,2 Гц), 7,66 (т, 1 Н, J = 8,3 Гц), 7,77 (д, 1 Н , J = 8,6 Гц), 7,89 (д, 1Н, J = 8,6 Гц), 8,02 (д, 1Н, J = 8,2 Гц), 8,35 (д, 1Н, J = 8,3 Гц).13C ЯМР (150 МГц, ДМСО-d6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1. HRMS (ESI): m/z розраховане значення. Для C12H11N4S (M + H)+: 243,069 9 , знайдено: 243,0704.
Протонні струми вимірювали у внутрішніх і зовнішніх ділянках ооцитів, що експресують різні конструкції, використовуючи підсилювач Axopatch 200B, керований Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) з програмним забезпеченням pClamp10. Внутрішньоклітинні та позаклітинні розчини мають однаковий склад: 100 мМ 2-(N-морфоліно). )етансульфонова кислота (MES), 30 мМ мезилат тетраетиламонію (TEA), 5 мМ хлорид TEA, 5 мМ етиленгліколь-біс(2-аміноетил)-N,N,N',N'-тетраоцтова кислота (EGTA), доведено до pH 6,0 з гідроксидом TEA. Усі вимірювання проводили при 22 ± 2 °C. Піпетка має опір доступу 1,5–4 МОм. Сліди струму фільтрували при 1 кГц, відбирали при 5 кГц і аналізували за допомогою Clampfit10.2 (Molecular Devices). ) і Origin8.1 (OriginLab).
Розчини, що містять різні концентрації інгібітора Hv1 і в деяких випадках 10 мМ βME, вводили у ванну під дією тяжіння через колектор, з’єднаний із системою перфузійного клапана VC-6 (Warner Instr.), який пропускали через програмне забезпечення pClamp TTL (Transistor- Transistor Logic). Експерименти швидкої перфузії проводили з використанням перфузійного олівця з кількома трубками (AutoMate Sci.) із наконечником доставки діаметром 360 мкм, встановленим перед піпеткою-патчем. Інгібування каналу визначали за допомогою ізохрональних амперометричних вимірювань наприкінці Деполяризаційний імпульс +120 мВ. Вимірювання GV проводили, як описано раніше18, 20. Кінцеві струми реєстрували при -40 мВ після кроків деполяризації при різних напругах від -20 мВ до +120 мВ, якщо не вказано інше. Еталонний імпульс, що передує тестовому імпульсу, використовується для корекції спаду струму 18. Графік GV відповідає рівнянню Больцмана:
Уявні константи дисоціації (Kd) для різних комбінацій каналів та інгібіторів (додаткова таблиця 1) були визначені шляхом підгонки концентраційної залежності інгібування (середніх значень %inhib) з рівнянням Хілла:
де [I] — концентрація інгібітора I, а h — коефіцієнт Хілла. Щоб обчислити коефіцієнт Хілла, рівняння (2) переставляється у вигляді:
Час публікації: 07 червня 2022 р
