Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për t'u siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Kanali i protonit i mbyllur nga tensioni Hv1 është një kompleks dimerik i përbërë nga dy domene sensorë të tensionit (VSD), secila prej të cilave përmban një rrugë të depërtimit të protonit. Dimerizimi kontrollohet nga domeni i mbështjelljes citoplazmike. Kalimi nga gjendja e mbyllur në gjendja e hapur në të dy VSD-të dihet se ndodh në mënyrë bashkëpunuese; megjithatë, dihet pak për mekanizmat themelorë. Ndërfaqet ndërnënnjësive luajnë një rol kyç në proceset alosterike; megjithatë, ndërfaqe të tilla nuk janë identifikuar në kanalet e hapura Hv1. Këtu ne demonstrojmë se derivatet e 2-guanidinotiazolit bllokojnë dy Hv1 VSD në një mënyrë bashkëpunuese dhe përdorin një nga këto komponime si një sondë për bashkimin alosterik midis nënnjësive të hapura. Ne zbuluam se jashtëqelizore fundi i fragmentit të parë transmembranor të VSD formon një ndërfaqe ndërnënnjësi që ndërmjetëson bashkimin midis vendeve lidhëse, ndërsa domeni i mbështjelljes së mbështjellur nuk është i përfshirë drejtpërdrejt në këtë proces. Ne gjetëm gjithashtu prova të forta që filtri përzgjedhës i protoneve të kanalit kontrollon bashkëpunimin e lidhjes së bllokuesit .
Kanalet protonike të mbyllura me tension luajnë role të rëndësishme në një sërë organizmash, nga fitoplanktoni te njerëzit1. Në shumicën e qelizave, këto kanale ndërmjetësojnë rrjedhjen e protonit nga membrana e protonit dhe rregullojnë aktivitetin e oksidazës NADPH. Kanali i vetëm i njohur i protonit me voltazh te njerëzit është Hv1, i cili është produkt i gjenit HVCN12,3. Hv1 (aka VSOP) është treguar se luan një rol në përhapjen e qelizave B4, prodhimin e specieve reaktive të oksigjenit nga sistemi imunitar i lindur5,6,7,8, qeliza e spermës lëvizshmëria9 dhe rregullimi i pH i lëngut sipërfaqësor të rrugëve të frymëmarrjes10. Ky kanal është i përfshirë në disa lloje kanceri të mbishprehura si malinjet e qelizave B4,11 dhe kanceret e gjirit dhe kolorektalit12,13. Aktiviteti i tepërt i Hv1 u zbulua se rrit potencialin metastatik të qelizave kancerogjene 11, 12. Në tru, Hv1 shprehet nga mikroglia, dhe aktiviteti i saj është treguar se përkeqëson dëmtimin e trurit në modelet e goditjes ishemike.
Proteina Hv1 përmban një domen të sensorit të tensionit (VSD), i cili përbëhet nga katër segmente transmembranore të quajtura S1 deri në S414. VSD i ngjan domeneve përkatëse të kanaleve Na+, K+ dhe Ca2+ të kufizuara nga tensioni dhe fosfatazave të ndjeshme ndaj tensionit, të tilla si CiVSP nga Ciona gutis15. Në këto proteina të tjera, fundi C i S4 është i lidhur me një modul efektor, domenin e poreve ose enzimën. Në Hv1, S4 është i lidhur me domenin me mbështjellje të mbështjellur (CCD) që ndodhet në anën citoplazmike të membranës Kanali është një kompleks dimerik i përbërë nga dy VSD, secila përmban një rrugë të mbyllur të përshkimit të protonit16,17,18. Këto dy nënnjësi Hv1 u zbuluan se hapen në mënyrë bashkëpunuese19,20,21,22, duke sugjeruar që bashkimi alosterik dhe ndërveprimet ndër-nënnjësive luajnë një rol të rëndësishëm në procesin e hapjes. Ndërfaqja ndërmjet nënnjësive brenda domenit të mbështjelljes së mbështjellur është e mirëpërcaktuar sepse strukturat kristalore të dy domeneve të izoluara janë të disponueshme22,23. Nga ana tjetër, ndërfaqja ndërmjet VSD-ve brenda membranës nuk është Kuptohet mirë. Struktura kristalore e proteinës kimerike Hv1-CiVSP nuk jep informacion në lidhje me këtë ndërfaqe, pasi organizimi trimerik i kompleksit të kanalit të kristalizuar mund të rezultojë nga zëvendësimi i CCD Hv1 vendas nga zinxhiri i leucinës së majave GCN424.
Një studim i fundit i organizimit të nënnjësive të kanalit Hv1 arriti në përfundimin se dy spirale S4 kalojnë në CCD pa ndërprerje të rëndë të strukturës dytësore, duke rezultuar në spirale të gjata që fillojnë nga membrana dhe projektohen në citoplazmë. Bazuar në analizën e ndërlidhjes së cisteinës, ky studim propozon që VSD-të Hv1 të kontaktojnë njëri-tjetrin përgjatë segmentit S4. Megjithatë, studime të tjera kanë propozuar ndërfaqe alternative ndërmjet VSD-ve. Këto ndërfaqe përfshijnë segmentet S1 17, 21, 26 dhe skajet e jashtme të segmentit S2 21. Një arsye e mundshme për konfliktin rezultatet e këtyre studimeve është se bashkimi alosterik midis VSD-ve u ekzaminua në lidhje me procesin e hyrjes, i cili varet nga gjendjet e mbyllura dhe të hapura, dhe ndërfaqja midis VSD-ve mund të ndryshojë në ndryshime të gjendjeve të ndryshme në konformacion.
Këtu, ne zbuluam se 2-guanidinotiazoli frenon kanalet Hv1 duke u lidhur në mënyrë sinergjike me dy VSD të hapura dhe përdorëm një nga komponimet, 2-guanidinobenzotiazole (GBTA), për të hetuar ndërveprimin midis nënnjësive në gjendje të hapur. ndërfaqe. Ne zbuluam se kurba e lidhjes GBTA mund të përshkruhet mirë nga një model sasior në të cilin lidhja e një frenuesi me një nënnjësi rezulton në një rritje të afinitetit të lidhjes së nënnjësisë ngjitur. Ne zbuluam gjithashtu se mbetjet D112, filtrat e selektivitetit për kanali 27, 28 dhe një pjesë e vendit të lidhjes së derivatit të guanidinës 29 kontrollojnë bashkëpunimin e lidhjes GBTA. Ne tregojmë se lidhja bashkëpunuese ruhet në dimerin Hv1, ku CCD ndahet nga segmenti S4, duke sugjeruar që ndërfaqja ndërnënnjësi në CCD nuk është drejtpërdrejt ndërmjetëson bashkimin alosterik midis vendeve lidhëse GBTA. Në të kundërt, ne zbulojmë se fragmenti S1 është pjesë e ndërfaqes midis nënnjësive dhe propozon një rregullim të VSD-ve ngjitur me skajin jashtëqelizor të spirales S4 larg qendrës së dimerit për të lejuar fragmenti S1 të jetë në gjendje të hapur.
Frenuesit e molekulave të vogla të Hv1 janë të dobishëm si ilaçe antikancerogjene dhe agjentë neuroprotektivë. Megjithatë, deri më sot, pak përbërës kanë qenë në gjendje të frenojnë kanalin30,31,32,33. Midis tyre, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, përbërje [1] në Fig. 1a) dhe derivatet e tij u gjetën se bllokojnë depërtimin VSD29,32 të protoneve përmes kanalit. Lidhja e këtyre komponimeve mendohet se ndodh në mënyrë të pavarur në dy nënnjësitë e hapura. më parë është treguar se frenon Hv1 pothuajse në mënyrë efektive si 2GBI kur u testua në një përqendrim prej 200 μM (Figura 1b). Ne ekzaminuam derivatet e tjerë të tiazolit dhe zbuluam se disa prej tyre frenuan kanalin me fuqi të ngjashme ose më të madhe se GBTA (Fig. 1 dhe Suplementare Teksti). Ne përcaktuam kurbat e përgjigjes së përqendrimit të katër derivateve të tiazolit (GBTA dhe komponimet [3], [6] dhe [11], Fig. 1c) dhe zbuluam se ato ishin më të pjerrëta se ato të 2GBI. Koeficientët Hill (h) e derivateve të tiazolit varionin nga 1,109 ± 0,040 në 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c dhe Figura plotësuese 1). Në të kundërt, koeficienti Hill për 2GBI ishte 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a dhe Fig. Suplementare 1). Një koeficient Hill mbi 1 tregon bashkëpunimin lidhës. Për shkak se çdo nënnjësi Hv1 ka frenuesin e vet vendi i lidhjes,29,32 ne arsyetuam se lidhja e një derivati të tiazolit me një nënnjësi mund të përmirësonte lidhjen e një molekule frenuese të dytë me nënnjësinë ngjitur. GBTA ishte përbërësi testues me koeficientin më të lartë Hill. Prandaj, ne zgjodhëm këtë përbërje për të studioni më tej mekanizmin e sinergjisë lidhëse dhe përdori 2GBI si një kontroll negativ referues.
(a) Përbërjet testuese: [1] Referenca e frenuesit Hv1 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidinë, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidine, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidine, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-acid karboksilik etilik ester, [9] 2-guanidin-4-metil Etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10 ](2-guanidin-4-metil-1,3-tiazol-5-il)acetat etil, [11]1-[4-(4-Klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidinë, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidinë. (b) Frenimi i aktivitetit të Hv1 të njeriut nga guanidinotiazolet e treguara dhe përbërësi referencë 2GBI (shirita blu-jeshile) Rrymat e protonit Hv1 u matën në pllakat brenda-jashtë të ovociteve Xenopus në përgjigje të depolarizimit nga një potencial mbajtës prej -80 mV në +120 mV. Çdo frenues u shtua në banjë në një përqendrim prej 200 μM. pHi = pHo = 6.0 .Të dhënat janë mesatare±SEM (n≥4). (c) Frenimi i varur nga përqendrimi i Hv1 njerëzor nga komponimet [2], [3], [6] dhe [11]. Çdo pikë përfaqëson frenimin mesatar ± SD prej 3 deri në 15 matje. Linja është një përshtatje Hill e përdorur për të marrë vlerat e dukshme Kd të raportuara në tabelën plotësuese 1. Koeficientët e kodrës u përcaktuan nga përshtatjet e raportuara në Fig. 1 plotësuese: h(1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (shih Metodat).
(a,b) Komponimet 2GBI dhe GBTA frenuan Hv1 dimerike dhe monomerike në një mënyrë të varur nga përqendrimi. Çdo pikë përfaqëson frenimin mesatar ± SD prej 3 deri në 8 matje dhe kurba është një përshtatje Hill. Koeficientët Hill (h) të treguar në histogramet e futura u përcaktuan nga përshtatjet e raportuara në figurat suplementare 3 dhe 4. Përgjigja e përqendrimit të GBTA e treguar në (a) është e njëjtë me atë në Fig. 1c. Shih tabelën plotësuese 1 për vlerat e dukshme të Kd. (c) Modelimi i lidhja bashkëpunuese e GBTA me dimerik Hv1. Vija e zezë e ngurtë përfaqëson përshtatjen me të dhënat eksperimentale me ekuacionin (6), i cili përshkruan modelin e lidhjes të paraqitur në (d). Vijat e ndërprera të etiketuara Sub 1 dhe Sub 2 përfaqësojnë lidhjen bimolekulare -Kurbat e ekuilibrit të disociimit të ngjarjeve lidhëse të parë dhe të dytë, përkatësisht (Nën 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Nën 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagrami skematik i mekanizmit të propozuar të bllokut Hv1. Në rastin e GBTA, lidhja me një nënnjësi të hapur rrit afinitetin e nënnjësisë së hapur ngjitur (Kd2 Kanalet Hv1 mund të monomerizohen duke zëvendësuar domenet e tyre citoplazmike N- dhe C-terminale me pjesët përkatëse të Ciona Intestinalis fosfatazës së ndjeshme ndaj tensionit CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34. Ne matëm varësinë e përqendrimit të frenimit të GBTA dhe GB2 monomerike nga Hv1 i krahasuam ato me atë të frenimit të kanalit dimerik (të tipit të egër) (Fig. 2a,b). Ne zbuluam se ndryshimi në bashkëpunimin lidhës midis dy përbërjeve u eliminua në monomerik Hv1, duke mbështetur shpjegimin se lidhja GBTA me një nënnjësi rrit afiniteti i nënnjësisë tjetër për frenuesin. Ne arsyetuam se lidhja GBTA me një nënnjësi Hv1 mund të çojë në rirregullimin e vendit të lidhjes (duke nxitur përshtatjen35), gjë që do të shkaktonte rirregullimin e vendit të lirë të lidhjes së nënnjësisë ngjitur, duke çuar në rritjen e lidhjes afiniteti.
Për të përshkruar në mënyrë sasiore lidhjen bashkëpunuese të GBTA me kanalin, ne përdorëm një model në të cilin secila nënnjësi mund të lidhë molekulën e parë frenuese pas një reaksioni bimolekular me një konstante disociimi Kd1 (Fig. 2c, Nën 1, OO+ B ⇆ BO* ). Lidhja bën që kanali të adoptojë një gjendje në të cilën nënnjësitë e mbetura boshe lidhen me frenuesin pas një reaksioni bimolekular unik me një konstante disociimi Kd2, ku Kd2 Vija e zezë e fortë në figurën 2c është përshtatja e ekuacionit të modelit me lakoren eksperimentale të përqendrimit-përgjigje, duke dhënë një Kd1 prej ~290 μM dhe një Kd2 prej ~29 μM (seksioni i metodave, ekuacioni (6)). Modeli përshkruan gjithashtu lidhja e 2GBI, ku Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). Në Hv1 monomerik, ka vetëm një vend lidhës dhe një Kdm (O° + B ⇆ B°). Në rastin e GBTA, Kdm është rreth 54 μM, e cila është më e ngjashme me Kd1 sesa Kd2 (Fig. 2d). Me fjalë të tjera, vendi lidhës i monomerit është në një konfigurim (O°) më i ngjashëm me gjendjen e afinitetit të lartë (BO*) sesa me gjendjen e ulët. gjendja e afinitetit (OO) e dimerit, ka shumë të ngjarë për shkak të eliminimit të ndërfaqes midis nënnjësive.
Siç u tregua më parë për 2GBI32, ne zbuluam se GBTA shtypi rrymat Hv1 duke bllokuar kanalin kur ishte i hapur dhe jo duke e bërë më të vështirë hapjen (Fig. 2a,b,d). në përgjigje të ripolarizimit të membranës, por ky fenomen nuk u vu re në GBTA (Fig. Suplementar 2c). Në prani të inaktivizimit të Hv1 në prani të 2GBI, portat në secilën nënnjësi nuk mund të mbyllen derisa bllokuesi të largohet nga vendi i lidhjes (" mekanizmi i portës së këmbës”), dhe 2GBI shkëputet më ngadalë se sa mbyllen portat. Nëse një nënnjësi Hv1 zhbllokohet dhe mbyllet, ndërsa nënnjësia ngjitur mbetet e bllokuar, çlidhja e molekulave të mbetura 2 GBI bëhet më e ngadalshme (kapja e bllokuesit). Llojet e kanaleve jetëgjatë me vetëm një nënnjësi e bllokuar përcjell protonet në mënyrë të përkohshme përpara mbylljes dhe jep një kontribut të rëndësishëm në rrymën e bishtit që kalbet ngadalë.
Zbulimi se prishja e rrymave të bishtit Hv1 nuk u ngadalësua ndjeshëm në prani të GBTA (Fig. 2c plotësuese) është në përputhje me një mekanizëm lidhës sinergjik për këtë bllokues (Fig. 2d). Pasi një molekulë GBTA të jetë e palidhur nga nënnjësia Hv1 , afiniteti i bllokuesit me nënnjësinë ngjitur bie rreth 10 herë, duke favorizuar procesin e çlidhjes. Kjo do të thotë se molekula e dytë e GBTA ka një shans shumë më të lartë për t'u zbërthyer përpara se të bllokohet në kanal. Llojet e kanalit jetëgjatë që prodhojnë vetëm një nënnjësi bllokuese pritet të jenë shumë më të bollshme në prani të GBTA sesa në prani të 2GBI, duke rezultuar në prishje më të shpejtë të rrymës së bishtit.
Në mënyrë që GBTA të lidhet në mënyrë bashkëpunuese me të dy njësitë Hv1, vendet lidhëse duhet të jenë të lidhura në mënyrë alosterike. Çdo vend lidhës duhet të jetë në gjendje të: 1) të shkaktojë një zinxhir ngjarjesh që komunikojnë me nënnjësitë ngjitur të lidhura me frenuesin dhe 2) të ndërmjetësojë kalimi nga lidhja me afinitet të ulët në lidhjen me afinitet të lartë. Ne arsyetuam se nëse mbetjet specifike brenda vendit të lidhjes kontribuan në procesin e bashkëpunimit, mutacioni i tyre duhet të ndryshojë koeficientin Hill të kurbës përqendrim-përgjigje të frenimit GBTA të Hv1. Mbetjet D112, F150 , S181 dhe R211 më parë u treguan se ishin pjesë e mjedisit lidhës 2GBI29 dhe ne supozuam se ato do të përfshiheshin në mënyrë të ngjashme në lidhjen GBTA (Fig. 3A). Ne matëm kurbat frenuese të përqendrimit-përgjigje të GBTA për kanalet mutant D112E, F150A, S181A , dhe R211S (Figura 3) dhe krahasuan koeficientët e tyre Hill me ato të tipit të egër Hv1, duke përdorur 2GBI si referencë. Mbetja V109 është në të njëjtën faqe të segmentit S1 si D112 dhe ka një kthesë spirale shtesë brenda qelizës. Meqenëse V109 nuk ishte i përfshirë në lidhjen e 2GBI29, ne përdorëm mutantin V109A si kontroll (Fig. 3b).
(a) Mbetjet e sugjeruara të Hv1 të përfshira në lidhjen e derivatit të guanidinës. Lakoret blu të ndërprera rrethojnë zinxhirët anësor të propozuar më parë që ndërveprojnë me pjesë të ndryshme të përbërjes 2GBI29. (bf) Frenimi i varur nga përqendrimi i mutantëve të treguar Hv1 nga përbërësit 2GBI (cian) dhe GBTA ( e kuqe e errët). Çdo pikë përfaqëson frenimin mesatar prej 3 deri në 12 matje ± SD V109 si një kontroll negativ. Kurbat janë përshtatje të kodrës të përdorura për të marrë vlerat e dukshme të Kd (shih tabelën plotësuese 1). Koeficientët Hill (h) të treguar në histogramet e futura u përcaktuan nga përshtatjet e raportuara në figurat plotësuese 3 dhe 4. Vlerat e referencës h për Hv1 WT tregohen si vija të ndërprera. Yjet tregojnë dallime statistikisht të rëndësishme midis pasazheve mutant dhe WT (p Ne zbuluam se mutacioni D112E uli ndjeshëm koeficientin Hill (p Gjetja që koeficienti Hill për lidhjen GBTA është më i lartë se 1 në dimerin Hv1 dhe bëhet ~ 1 në kanalin monomerik (Fig. 2b) është në përputhje me ekzistencën e ndërveprimeve alosterike midis vendeve lidhëse në dy nënnjësitë. Nëse kjo është rasti, koeficienti Hill i lidhjes GBTA me dimerin me të cilin bllokuesi është lidhur me një nënnjësi duhet të jetë ~ 1. Ne e testuam këtë parashikim në dimerin e lidhur Hv1 F150A-WT (Fig. 4a), ku afiniteti i F150A nënnjësia për GBTA ishte më shumë se 2 rend magnitudë më e lartë se ajo e nënnjësisë WT (Fig. 1c dhe 3d). Më pas matëm kurbat përqendrim-përgjigje për frenimin e nënnjësisë WT në një përqendrim bazal prej 2 μM GBTA. Në këtë përqendrim , bllokuesi pritet të lidhë afërsisht 99% të nën-njësisë F150A dhe (a) Diagrami skematik i dimerit të kryqëzimit F150A-WT i përdorur për të gjeneruar gjysmëkanalin bllokues ({F150A}b-WT/BAO*). Diamantet e bardha tregojnë vendndodhjen e mutacionit. Në gjendjet BAO* dhe BA*B*, afiniteti i nën-njësisë F150A pritet të jetë më i lartë se ai i nën-njësisë WT. (b) Rrymat e protonit nga kanalet F150A-WT të matura në përgjigje të ndryshimeve në potencialin e membranës nga -80 mV në +120 mV. pHi = pHo = 6.0 Gjurmët gri përfaqësojnë rrymat e matura në mungesë të frenuesit. Gjurma e zezë (kontrolli) përfaqëson rrymën e matur pas shtimit të 2 μM GBTA. Në këtë përqendrim, nënnjësia WT nuk u frenua ndjeshëm, ndërsa nënnjësia F150A u lidh pothuajse plotësisht me GBTA ({F150A}b-WT). Një rritje e mëtejshme në përqendrimin e GBTA rezultoi në bllokimin e nën-njësisë WT (gjurmë portokalli dhe të kuqe). (c) Frenim i varur nga përqendrimi i dimerit {F150A}b-WT (frenuesi i lidhur para Nënnjësia F150A).Çdo pikë paraqet frenimin mesatar ± SD prej 3 deri në 7 matje. Lakoret ishin përshtatjet e kodrës të përdorura për të marrë vlerat e dukshme të Kd të raportuara në tabelën plotësuese 1. Koeficientët Hill të paraqitur në histogramet e futura u përcaktuan nga përshtatjet e raportuara në Figura plotësuese 3 dhe 4. Vlerat h të Hv1 WT janë tregohen si vija të ndërprera. Yllkat tregojnë dallime statistikisht të rëndësishme në krahasim me dimerin WT Hv1 (p Meqenëse frenimi GBTA i Hv1 u mat në kanalin e hapur, ne arsyetuam se bashkëpunimi lidhës GBTA mund të përdoret për të studiuar mekanizmin e bashkimit ndërnënnjësi në gjendje të hapur. Këto dy nën-njësi Hv1 më parë u zbuluan se ishin të kufizuara në mënyrë bashkëpunuese 19,20,21. 22 dhe bashkimi ndërnën-njësi i përfshirë në mbyllje u propozua të ndërmjetësohej nga domeni i mbështjelljes citoplazmike (CCD) 22,25. Prandaj, ne pyetëm nëse CCD është gjithashtu i përfshirë në lidhjen midis vendeve të lidhjes GBTA në gjendje të hapur. Triglicina mutacionet në ndërfaqen ndërmjet fragmentit transmembranor S4 dhe domenit me mbështjellje të mbështjellur janë treguar në studimet e mëparshme për të shkëputur këtë domen nga pjesa tjetër e kanalit duke ruajtur integritetin e dimerizimit. Prandaj, ne testuam efektin e mutacioneve V220G, K221G dhe T222G (Fig. 5a, mutant GGG) në bashkëpunimin lidhës GBTA. Ne gjetëm një rënie statistikisht të parëndësishme (p > 0.05) në koeficientin Hill të lidhjes GBTA me kanalet GGG krahasuar me llojin e egër (Fig. 5c), duke sugjeruar se pavarësisht nga roli i tij në mbajtjen e dy nën-njësi së bashku janë të rëndësishme, por CCD nuk ndërmjetëson drejtpërdrejt bashkimin alosterik ndërnënjësi ndërmjet vendeve lidhëse GBTA.
(a) Diagrami skematik i dimerit Hv1 me një mutacion triglicine në skajin e brendshëm të S4, i projektuar për të prishur lidhjen ndërnënnjësi të ndërmjetësuar nga domeni i mbështjelljes citoplazmike (shigjetat blu). (b) Paraqitja skematike e dimerëve Hv1 dhe dimerëve të lidhjes me mutacionet e treguara, të dizajnuara për të testuar fragmentet S1 të përfshira në bashkimin midis nënnjësive (shigjetat blu). (c–h) 2GBI (cian) dhe GBTA (e kuqe e errët) pengojnë konstruktet e treguara në një mënyrë të varur nga përqendrimi. Çdo pikë përfaqëson frenimin mesatar ± SD prej 3 deri në 10 matje. Lakorja ishte një përshtatje Hill e përdorur për të marrë vlerat e dukshme të Kd (shih tabelën plotësuese 1). Koeficientët e kodrës në histogramet e interpoluara u përcaktuan siç përshkruhet në seksionin Metodat (shih Figurat suplementare 3 dhe 4). Vlerat e referencës h për Hv1 WT tregohen si vija të ndërprera. Yllqet tregojnë dallime statistikisht të rëndësishme midis pasazheve mutant dhe WT (p Meqenëse ne përjashtuam CCD si një ndërmjetës të drejtpërdrejtë të lidhjes bashkëpunuese GBTA, ne pyetëm nëse ndërveprimet midis VSD-ve janë të përfshira në bashkimin alosterik midis vendeve lidhëse. Ne zbuluam se bashkëpunimi lidhës GBTA u shfuqizua nga mutacioni konservativ i mbetjes D112 (Fig. 3c) i vendosur në segmentin transmembranor S1.S1 përmban dy mbetje të tjera të ngarkuara negativisht, E119 dhe D123, të vendosura në të njëjtën anë të spirales si D112, por më afër skajit të jashtëm 24 të fragmentit. Simulimet e hershme të dinamikës molekulare treguan se këto mbetje ishin të lidhura në D112 nëpërmjet linjave ujore36,37. Prandaj, ne testuam nëse E119 dhe D123 janë të përfshirë në bashkimin alosterik midis vendeve të lidhjes GBTA (Fig. 5b). Si një kontroll negativ, ne testuam pozicionin e ruajtur të ngarkuar pozitivisht K125, i cili ndodhet pranë D123 por në anën tjetër të spirales S1 (Fig. 5b).
Ne matëm frenimin e varur nga përqendrimi të kanaleve E119A, D123A dhe K125A nga 2GBI dhe GBTA dhe zbuluam se mutacionet E119A dhe K125A nuk e ndryshuan ndjeshëm koeficientin Hill të asnjërit frenues në krahasim me llojin e egër (p > 0.05, Fig. 5d,i). ). Nga ana tjetër, mutacioni D123A uli ndjeshëm koeficientin Hill të GBTA (p 0.05/14).
Meqenëse neutralizimi i ngarkesës në pozicionin 123 në të dy nënnjësitë rezultoi në një ndryshim të fortë në bashkëpunimin e lidhjes GBTA, ndërsa kthimi i ngarkesës në të dy nënnjësitë pati vetëm një efekt të vogël, ne e zgjeruam analizën për të përfshirë vetëm një nënnjësi me kanalin e përmbysjes së ngarkesës. Ne gjeneruan dimerë të lidhur me Hv1 me zëvendësim D123R në nënnjësinë C-terminale (Fig. 5b) dhe matën frenimin e reagimit të përqendrimit nga GBTA dhe 2GBI. Ne zbuluam se koeficienti Hill i lidhjes GBTA me kanalet WT-D123R ishte dukshëm më i lartë se ai e Hv1 të tipit të egër (p Ne zbuluam gjithashtu se mutacioni D112E shfuqizoi rritjen e koeficientit Hill të lidhjes GBTA të prodhuar nga sfondi WT-D123R (Fig. 5b, h dhe Fig. Suplementare 4). Efekti në koeficientin Hill të lidhjes 2GBI u eliminua gjithashtu Fig. 5h dhe Fig. Suplementare 3). Këto gjetje sugjerojnë që bashkimi i zgjeruar alosterik midis nënnjësive të shkaktuara nga ngarkesa të kundërta në pozicionin 123 nuk përkthehet në bashkëpunim më të fortë lidhës kur vendi i lidhjes në pozicionin D112 është i shqetësuar.
Ne arsyetuam se nëse mbetjet D123 në njësitë e hapura ngjitur do të ishin mjaft afër për të bashkëvepruar elektrostatikisht me njëra-tjetrën, ndërveprimi i neveritshëm midis ngarkesave negative do të shndërrohej në një kombinim të ngarkesave negative dhe pozitive duke zëvendësuar acidin aspartik në argininë. ndërveprim tërheqës ndërmjet tyre.Një nënnjësi (dimer WT-D123R). Ndërveprimet tërheqëse mund të forcojnë ndërfaqen ndërmjet skajeve të jashtme të fragmentit S1, duke çuar në bashkim më të fortë alosterik midis nënnjësive dhe rritje të bashkëpunimit lidhës GBTA.
Për të mbështetur këtë hipotezë, ne kërkuam një mënyrë për të forcuar ndërfaqen midis skajeve të jashtme të segmentit S1, i cili dallon nga ndërrimi i ngarkesës në pozicionin 123. Lee et al. Më parë u gjet mutacioni i mbetjes Hv1 I127 në cisteinë për të rezultuar në ndërlidhje tërthore spontane ndërnënnjësi17. Për më tepër, struktura kristalore e VSD kimerike Hv1-CiVSP tregoi se I127 ndahet nga fundi i jashtëm i spirales S1 nga vetëm një mbetje24. Prandaj ne pyetëm nëse formimi i një lidhje kovalente midis cisteinat në pozicionin 127, i cili pritet të rezultojë në një ndërveprim më të fortë S1-S1, ka një efekt në bashkëpunimin lidhës GBTA të ngjashëm me atë të vërejtur duke ndryshuar ngarkesën në pozicionin 123.
Ne matëm frenimin e varur nga përqendrimi i Hv1 I127C nga GBTA dhe 2 GBI në prani dhe mungesë të 10 mM β-merkaptoetanol (βME) (Fig. 6a). Në të njëjtën kohë me shtimin e inhibitorit në tretësirën ndërqelizore, zvogëlohet agjenti shtohet në tretësirën jashtëqelizore. Një dimer i lidhur me zëvendësim të cisteinës në vetëm një nënnjësi (WT-I127C) është përdorur si kontroll negativ (Fig. 6a). ndërmjet nënnjësive I127C në frenimin 2GBI, sepse koeficienti Hill për lidhjen I127C me Hv1, me ose pa βME, ishte dukshëm i ndryshëm nga ai për lidhjen me dimerët e zëvendësuar me monocisteinë. Koeficienti Hill nuk mund të dallonte WT-I127C (Fig. 6b dhe Fig. Suplementare 3). Në kontrast të plotë, ne matëm efektin dramatik të ndërlidhjes spontane ndërnënnjësi në frenimin e GBTA. Koeficienti Hill për lidhjen me Hv1 I127C në mungesë të βME (lidhja e kryqëzuar e ndezur) ishte dukshëm më e lartë se sa matet në prani të βME (lidhja e kryqëzuar e shkëputur) ose duke përdorur WT-127C për të lidhur dimerin (në mungesë të lidhjes së kryqëzuar) (Fig. 6c dhe Fig. suplementare 4), duke treguar se bashkimi alosterik ndërmjet vendeve lidhëse është rritur shumë nga formimi i lidhjeve disulfide midis skajeve të jashtme të fragmenteve S1. Këto rezultate mbështesin interpretimin tonë se ndërveprimi elektrostatik tërheqës i aspartatit dhe argininës në pozicionin 123 në dimerin WT-D123R rezulton në një bashkim alosterik të rritur midis nënnjësitë.
Lidhja në gjendje të hapur ndërmjetësohet nga ndërveprimet e drejtpërdrejta fizike midis skajeve të jashtme të segmentit S1 në dy nënnjësitë.
(a) Paraqitja skematike e dimerëve mutantë Hv1 dhe dimerëve lidhës, i projektuar për të hetuar se si lidhjet e kryqëzuara të cisteinës ndërnënjësi ndikojnë në bashkëpunimin lidhës GBTA. e) në prani ose mungesë të 10 mM βME në tretësirën jashtëqelizore.Çdo pikë përfaqëson frenimin mesatar ± SD prej 3 deri në 10 matje. Kurba ishte një përshtatje Hill e përdorur për të marrë vlerat Kd (shih tabelën plotësuese 1). Koeficientët e kodrës në histogramet e futura u përcaktuan nga përshtatjet e raportuara në figurat suplementare 3 dhe 4. Yjet në (c,e) tregojnë dallime të rëndësishme statistikisht ndërmjet kushteve të ndryshme të frenimit GBTA (p 0.05).
Ne zbuluam gjithashtu se në mungesë të βME, koeficienti Hill i lidhjes GBTA me dimerin D112E I127C Hv1 ishte dukshëm më i lartë se ai i matur në prani të agjentëve reduktues (Fig. 6e dhe Fig. suplementare 4), duke nënkuptuar se mutacioni D112E nuk e shfuqizoi rritjen e kooperativitetit të lidhjes GBTA që rezulton nga ndërlidhja e cisteinës 127. Koeficienti Hill i lidhjes 2GBI me dimerët D112E, I127C Hv1 gjithashtu nuk u ndikua ndjeshëm nga mutacioni D112E (Figura 1).6d dhe suplementar Fig. 3).
Të marra së bashku, këto gjetje sugjerojnë që lidhja GBTA përmirësohet nga ndërveprimi midis skajeve të jashtme të fragmenteve S1 në nënnjësitë ngjitur Hv1 përmes ndërveprimeve tërheqëse elektrostatike ose përmes formimit të lidhjeve kovalente midis cisteinave të zëvendësuara Lidhja alosterike midis vendeve rritet dhe rezulton në bashkëpunimin lidhës. Ndërsa efekti i ndërveprimeve tërheqëse elektrostatike në kooperativitet mund të shfuqizohet nga mutacioni D112E, efekti i lidhjeve kovalente nuk mundet.
Në eksplorimin tonë të hapësirës kimike të disponueshme për lidhjen e derivateve të guanidinës me kanalet Hv1, zbuluam se 2-guanidinotiazolet si GBTA kanë një varësi më të madhe nga përqendrimi sesa 2-guanidinobenzimidazolet (Fig. 1c). Analiza e koeficientit Hill të lidhjes GBTA me të dy dimerët dhe kanalet monomerike (Fig. 2a,b) dhe në kanalin dimerik në të cilin një nënnjësi ishte e lidhur paraprakisht me frenuesin (Fig. 4) na çuan në përfundimin se frenimi i Hv1 nga GBTA Veprimi është një proces sinergjik, dhe vendet e lidhjes së komponimeve në dy nënnjësitë janë të lidhura në mënyrë alosterike. Zbulimi që GBTA lidhet me kanalin e hapur, siç u tregua më parë për përbërjen përkatëse 2GBI32, sugjeron që bashkimi alosterik mund të vlerësohet në mënyrë specifike në gjendje të hapur. Modeli ynë i lidhjes bashkëpunuese ishte në gjendje të përshkruante në mënyrë sasiore frenimin e Hv1 nga GBTA (Fig. 2c) dhe të shpjegonte efektet e ndryshme të 2GBI dhe GBTA në prishjen e rrymave të bishtit të kanalit pas ripolarizimit të membranës, gjë që mbështet interpretimin tonë të procesit të lidhjes.
Koeficienti maksimal Hill që mund të arrihet në një proteinë alosterike me dy vende lidhëse (si Hv1) është 2. Ne matëm GBTA për të lidhur Hv1 të tipit të egër me një koeficient prej 1.31, i cili u rrit në 1.88 në Hv1 I127C. energjia e lirë sinergjike, diferenca midis energjive të lira lidhëse të vendeve me afinitet më të ulët dhe më të lartë (shih Metodat), ishte 1,3 kcal/mole në rastin e Hv1 të tipit të egër dhe 2,7 kcal/mole në rastin e Hv1 I127C. Lidhja i oksigjenit në hemoglobinë është shembulli më i famshëm dhe i studiuar mirë i procesit të bashkëpunimit. kcal/mol, në varësi të kushteve eksperimentale38. Kështu, për sa i përket energjetikës globale, bashkëpunimi i lidhjes së GBTA me Hv1 nuk është thelbësisht i ndryshëm nga ai i lidhjes së O2 me hemoglobinën kur merren parasysh numrat e ndryshëm të nënnjësive të proteinave në të dy sistemet.
Në modelin tonë të sinergjisë, lidhja e molekulave GBTA me një nënnjësi rezulton në një rritje të afinitetit të lidhjes së nën-njësisë ngjitur. ndryshimet në ndërveprimet ndërmjet nënnjësive. Në përgjigje të këtyre ndryshimeve, nënnjësitë ngjitur ndryshojnë vendet e tyre të lidhjes, duke rezultuar në lidhje më të ngushtë GBTA. Gjatë këtij procesi, aspartati S1 D112 është përgjegjës për rirregullimin e vendit të lidhjes që shoqërohet me rritjen e afinitetit të lidhjes.D112 është treguar më parë se është pjesë e rrugës së përshkimit të protonit Hv1 dhe se vepron si filtër selektiviteti27,28. Rezultatet tona tregojnë se filtrat e selektivitetit në dy nënnjësitë Hv1 janë të lidhur në mënyrë alosterike në gjendje të hapur. Figura 7a tregon vendndodhjen e përafërt të vendit të lidhjes GBTA dhe vendndodhjen e mbetjeve D112, D123, K125 dhe I127 në një skemë të Hv1 VSD bazuar në strukturën kristalore të kimerës Hv1-CiVSP.Drejtimet e sugjeruara për bashkimin alosterik që përfshin skajin jashtëqelizor të S1 tregohen me shigjeta të zeza.
(a) Skema e Hv1 VSD. Bazuar në strukturën kristalore të kimerës Hv1-CiVSP, segmentet spirale tregohen të jenë cilindrike. Në këtë konfigurim, fundi i brendshëm i segmentit S4 bashkohet me CCD (nuk tregohet). Vendndodhjet e parashikuara të GBTA-së së lidhur tregohen si ovale gri. Shigjetat e zeza tregojnë shtigjet e përfshira në bashkimin alosterik midis vendeve lidhëse në dy nënnjësi ngjitur. Pozicionet e mbetjeve S1 të hetuara janë shënuar me sfera me ngjyra. (b) Ilustrimi skematik i nënnjësive Hv1 të rregulluara në dy konfigurime të ndryshme dimerësh siç shihen nga ana jashtëqelizore e planit të membranës.Në panelin e majtë, ndërfaqja e dimerit formohet nga spiralen S4.Rrotullimi i dy VSD-ve 20 gradë në drejtim të akrepave të orës rreth një boshti pingul me rrafshin e membranës, i shoqëruar nga ndarja e skajeve të jashtme të dy spiraleve S4 (shigjeta të ndërprera), prodhon rregullimin e treguar në të djathtë. Në këtë konfigurim, mbetjet D123 dhe I127 nga nënnjësitë ngjitur lejohen të afrohen njëra-tjetrës. (c) Paraqitja skematike e CiVSP VSD në konfigurimin e dimerit që gjendet në strukturën kristalore 4G80.Pozicioni P140 në CiVSP korrespondon me pozicionin D123 në Hv1.
Rezultatet tona tregojnë se ndërveprimi elektrostatik refuzues midis mbetjes 123 (123D/123D ose 123R/123R) shoqërohet me një nivel "normal" të bashkëpunimit të lidhjes GBTA në gjendje të hapur dhe e zhvendos ndërveprimin nga zmbrapsja në të tërhequr (123D/123R) , rritja e bashkëpunimit (Fig. 5g). Pritet që heqja e ndërveprimit repulsiv me zëvendësimin e alaninës do të çonte gjithashtu në rritjen e bashkëpunimit. Megjithatë, u vu re një rënie në kooperativitetin e dimerit 123A/123A (Fig. 5e). Një e mundshme shpjegimi është se efekti destabilizues i vendosjes së mbetjeve hidrofobike në një mjedis hidrofilik mund të jetë më i madh se efekti stabilizues për shkak të eliminimit të ndërveprimeve të neveritshme midis mbetjeve të D123, duke rezultuar në një reduktim të përgjithshëm në bashkëpunimin lidhës. Mony et al.39 raportuan kohët e fundit se aksesi ndaj tretësit në pozicioni D171 i Ciona gutis Ci-Hv1 (që korrespondon me D123 në Hv1 njerëzor) rritet me aktivizimin, duke mbështetur nocionin se D123 ndodhet në një mjedis hidrofil në gjendje të hapur.
Dihet se mbyllja e kanaleve Hv1 ndodh përmes kalimeve të shumëfishta19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 zbuluan se pas depolarizimit të membranës, sensori i tensionit të Ci-Hv1 pëson një ndryshim konformues që e lë kanalin të aktivizuar por ende të mbyllur. , e ndjekur nga një tranzicion i dallueshëm që bën që protonet të hapin përçueshmërinë në shtegun e të dy nënnjësive. Ndryshimi konformativ i sensorit të tensionit u monitorua nga fluoreshenca e kapëses së tensionit dhe u zbulua se tranzicioni i dytë u trazua në mënyrë selektive nga mutacioni në pozicionin D171. Shqetësimi i sinjalit fluoreshent është në përputhje me praninë e ndërveprimeve elektrostatike midis mbetjeve D171 të nënnjësive ngjitur në një pikë përgjatë koordinatave të reagimit të ndryshimit konformues. Ky interpretim është në përputhje me gjetjen tonë që mbetja D123 ndërvepron elektrostatikisht në gjendje të hapur dhe ndërmjetëson bashkimin alosterik midis vendeve lidhëse GBTA.
Fujiwara et al25 propozuan që ndërfaqja e dimerit të domenit të mbështjelljes citoplazmike të shtrihet në membranë për të përmbajtur dy spirale S4 (Fig. 7b, paneli i majtë). Një model i këtij ndërveprimi ndërnënnjësi bazohet në analizën e ndërlidhjes së cisteinës. e gjithë VSD dhe analiza funksionale e rajonit që lidh spiralen S4 dhe CCD. Në mungesë të një gradienti pH transmembranor, kanalet Hv1 kërkojnë depolarizimin e konsiderueshëm të membranës për t'u hapur, dhe ndërlidhja e cisteinës ndodh në kushtet kur kanali është kryesisht i mbyllur. Prandaj, ndërfaqja e zbuluar S4-S4 ka të ngjarë të pasqyrojë konfigurimin e njësisë jashtë gjendjes. Studime të tjera kanë gjetur prova për përfshirjen e S1 dhe S2 në ndërveprimet ndërnënnjësore gjatë gating17,21,26 duke sugjeruar që kanalet mund të adoptojnë konfigurime të ndryshme nën-njësi në të hapur dhe gjendjet e mbyllura, një ide në përputhje me gjetjet e Mony et al. S1 lëviz 39 gjatë hyrjes.
Këtu, ne tregojmë se, në gjendje të hapur, skajet jashtëqelizore të spirales S1 janë mjaft afër për të mbështetur ndërveprimet e drejtpërdrejta elektrostatike që ndërmjetësojnë bashkimin alosterik midis nënnjësive. Në konfigurimin e dimerit me ndërveprime të zgjeruara S4-S4, spiralet S1 janë shumë larg veç njëri-tjetrit për të bashkëvepruar drejtpërdrejt. Megjithatë, një rrotullim 20° në drejtim të akrepave të orës i dy nënnjësive VSD rreth një boshti pingul me rrafshin e membranës, i kombinuar me ndarjen e skajeve të jashtme të dy helikave S4, dha një konfigurim të qëndrueshëm S1-S1 me gjetjet tona (Fig. 7b, paneli djathtas). Ne e rekomandojmë këtë konfigurim për kanalin në gjendje të hapur.
Megjithëse enzima CiVSP mendohet të funksionojë si monomer, struktura kristalore e VSD-së së saj të izoluar kapet në një gjendje dimeri. Skajet e jashtme të spiraleve S1 në këtë dimer janë afër njëra-tjetrës nga ana hapësinore dhe konfigurimi i përgjithshëm është i ngjashëm me atë të propozuar. për Hv1 (Fig. 7c). Në dimerin CiVSP, mbetja më e afërt nga nënnjësia ngjitur ishte prolina në pozicionin 140 (Fig. 7c). Interesante, P140 në CiVSP korrespondon me pozicionin D123 në Hv1. Ngjashmëria në konfigurimin e nënnjësisë midis Hv1 dhe dimerët CiVSP sugjerojnë që VSD-të e këtyre proteinave kanë një tendencë të brendshme për të formuar një ndërfaqe ku skajet jashtëqelizore të S1 ndërveprojnë.
Roli thelbësor i Hv1 në aktivizimin e qelizave të spermës e bën këtë kanal një objektiv tërheqës medikamenti për kontrollin e fertilitetit mashkullor. Për më tepër, aktivizimi i Hv1 në mikroglia është treguar se përkeqëson rikuperimin nga goditja ishemike. Aktiviteti i përmirësuar i Hv1 u zbulua se shoqërohet me më pak mbijetesa në pacientët me kancer gjiri 12 ose kolorektal 13 dhe mendohet se kontribuon në tumoret malinje të qelizave B 11 . Prandaj, medikamentet me molekula të vogla që synojnë Hv1 mund të përdoren si agjentë neuroprotektivë ose terapi antikancerogjene. Zbulimi që derivatet e guanidinotiazolit mund të nxisin formimin e pasmë Nën-njësia e hapur Hv1, që çon në rritjen e afinitetit të lidhjes, mund të çojë në zhvillimin e barnave më të fuqishme që synojnë kanalet Hv1.
Mutagjeneza e drejtuar nga vendi i Hv1 njerëzore u krye duke përdorur teknika standarde PCR. Në konstruktin Hv1NCCiVSP, mbetjet 1-96 dhe 228-273 të Hv1 u zëvendësuan nga mbetjet 1-113 dhe 240-576 të CiVSP18. Në dimerin e lidhur me Hv1, C-terminusi i njërës nënnjësi është i lidhur me terminalin N të nënnjësisë së dytë përmes lidhësit GGSGGSGGSGSGGSGG. Plazmidet pGEMHE që përmbajnë konstruksione të ndryshme janë linearizuar me enzimat kufizuese Nhe1 ose Sph1 (New England Biolabs) dhe ARN u krye sinteza Kompleti i transkriptimit mMachine T7 mMessage (Ambion).1-3 ditë përpara matjeve elektrofiziologjike, cARN u injektua në oocitet e Xenopus (50 nl për qelizë, 0.3-1.5 μg/μl). Janë marrë ovocitet e fazës V dhe VI nga Xenopus laevis (NASCO). nga Ecocyte Bioscience. Pas injektimit të ARN-së, qelizat u mbajtën në mjedisin ND96 që përmban 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM piruvat, 100 μg2, p. .
2-guanidino-benzimidazol[1], 2-guanidino-benzotiazol[2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidine [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -tiazol-2-il)guanidinë) [6], etil 2-guanidin-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilat [8], etil 2-guanidin-4-metil-1,3-tiazol- 5-karboksilate [9] dhe (2-guanidin-4-metil-1,3-tiazol-5-il) acetat etilik [10] ishin nga Sigma-Aldrich. Famotidina [7] ishte nga MP Biomedicals.1-[4 -(4-Klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidine[11] dhe 1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-Tiazol-2-il]guanidine [12] ishte nga Matrix Scientific. Këto komponime janë të pastërtisë më të lartë të disponueshme në treg. Ata u tretën në DMSO të thatë për të gjeneruar një zgjidhje 100 mM, e cila më pas u hollua në tretësirën e regjistrimit në përqendrimin përfundimtar të dëshiruar. Përbërjet 3 dhe 4 u sintetizuan më poshtë me pastërti të paktën 99%.
Në një suspension të hidroklorurit 2-amino-4-(trifluorometil)benzenetiol (1,02 g, 4,5 mmol) në 25 ml acid klorhidrik ujor (2,5 N) iu shtua diciandiamid i ngurtë (380 mg, 4,5 mmol) dhe përzierja heterogjene që rezulton. u kthye në refluks me përzierje të fuqishme për 4 orë. Përzierja e reaksionit u fto në temperaturën e dhomës dhe u neutralizua me shtimin graduale të hidroksidit të kaliumit 10 N. Precipitati i bardhë i formuar filtrohet, lahet me ujë të ftohtë (3 × 50 ml), thahet në furrë 65 °C) për disa orë, dhe më pas rikristalizohet nga acetat etilik/eter nafte për të dhënë një të ngurtë të bardhë (500 mg, 48 %); mp 221–222 °C (drita 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (s shumë e gjerë, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114,2 (d, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): vlera e llogaritur m/z. Për C9H8F3N4S (M + H)+: 416, gjetur 26. : 261.0419.
Nafto[1,2-d]tiazol-2-amina (300 mg, 1.5 mmol), e sintetizuar siç përshkruhet më parë, u ngroh në 200 °C në një banjë vaji në një epruvetë të vogël. 300 mg (tepricë e madhe) cianamide dhe Komponimit të nxehtë iu shtua acid klorhidrik me shpejtësi dhe përzierja u mbajt në banjë vaji për rreth 2 minuta, gjatë së cilës kohë pjesa më e madhe e ujit u avullua. Përzierja e reaksionit u fto më pas në temperaturën e dhomës dhe materiali që rezulton u ngurtësua u thye në copa të vogla dhe u la me ujë për të siguruar një të ngurtë amorfe të verdhë të zbehtë. (38 mg, 10%) mp 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 Hz , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d , 1 H, J = 8,3 Hz).13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): m/z1, vlera e përllogaritur (ESI): m/z12H +291. , gjetur: 243.0704.
Rrymat e protoneve u matën në pjesë të brendshme dhe të jashtme të ovociteve që shprehin konstruksione të ndryshme duke përdorur një përforcues Axopatch 200B të kontrolluar nga një Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) me softuerin pClamp10. Tretësirat brendaqelizore dhe jashtëqelizore kanë të njëjtën përbërje: 100-(N-mMM) )acid etansulfonik (MES), 30 mM tetraetilamonium (TEA) mesilat, 5 mM klorid TEA, 5 mM etilen glikol-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-acid tetraacetik (EGTA), i rregulluar në pH 6.0 me hidroksid TEA. Të gjitha matjet u kryen në 22 ± 2 °C. Pipeta ka një rezistencë aksesi prej 1.5–4 MΩ. Gjurmët aktuale u filtruan në 1 kHz, u morën kampione në 5 kHz dhe u analizuan me Clampfit10.2 (Pajisjet molekulare ) dhe Origin8.1 (OriginLab).
Zgjidhjet që përmbajnë përqendrime të ndryshme të frenuesit Hv1 dhe në disa raste 10 mM βME u futën në banjë me anë të gravitetit përmes një kolektori të lidhur me një sistem valvulash perfuzioni VC-6 (Warner Instr.), i cili kaloi përmes softuerit pClamp TTL (Transistor- Transistor Logic) sinjale. Eksperimentet e perfuzionit të shpejtë u kryen duke përdorur një laps perfuzioni me shumë tuba (AutoMate Sci.) me një majë shpërndarjeje me diametër 360 μm të montuar përpara një pipete patch. Frenimi i kanalit u përcaktua nga matjet amperometrike izokronale në fund të Pulsi depolarizues +120 mV. Matjet GV u kryen siç u përshkrua më parë18,20. Rrymat e bishtit u regjistruan në -40 mV pas hapave të depolarizimit në tensione të ndryshme nga -20 mV në +120 mV, përveç rasteve kur përcaktohet ndryshe. Pulsi i referencës që i paraprin pulsit të provës është përdoret për të korrigjuar zbërthimin e rrymës 18 .Grafiku GV përshtatet me ekuacionin e Boltzmann-it:
Konstantat e dukshme të disociimit (Kd) për kombinime të ndryshme të kanaleve dhe frenuesve (Tabela plotësuese 1) u përcaktuan duke përshtatur varësinë e përqendrimit të frenimit (vlerat mesatare të %inhib) me ekuacionin Hill:
ku [I] është përqendrimi i frenuesit I dhe h është koeficienti Hill. Për të llogaritur koeficientin Hill, ekuacioni (2) është riorganizuar si:
Koha e postimit: Qershor-07-2022
