Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). voortdurende ondersteuning, we zullen de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Het spanningsafhankelijke protonkanaal van Hv1 is een dimeer complex dat bestaat uit twee spanningsgevoelige domeinen (VSD's), die elk een gepoorte protonpermeatieroute bevatten. Dimerisatie wordt gecontroleerd door het cytoplasmatische spiraalvormige domein. De overgang van de gesloten toestand naar Het is bekend dat de open toestand in beide VSD's coöperatief plaatsvindt; er is echter weinig bekend over de onderliggende mechanismen. Intersubunit-interfaces spelen een sleutelrol in allosterische processen; dergelijke interfaces zijn echter niet geïdentificeerd in open Hv1-kanalen. Hier demonstreren we dat 2-guanidinothiazoolderivaten twee Hv1-VSD's op een coöperatieve manier blokkeren en een van deze verbindingen gebruiken als een probe voor allosterische koppeling tussen open subeenheden. We ontdekten dat de extracellulaire Het uiteinde van het eerste transmembraanfragment van VSD vormt een intersubunit-interface die de koppeling tussen bindingsplaatsen bemiddelt, terwijl het opgerolde domein niet direct bij dit proces betrokken is. We hebben ook sterk bewijs gevonden dat het protonselectieve filter van het kanaal de blokkerings-bindende coöperativiteit controleert .
Spanningsafhankelijke protonkanalen spelen een belangrijke rol in een verscheidenheid aan organismen, van fytoplankton tot mensen1. In de meeste cellen bemiddelen deze kanalen de protonenefflux uit het protonmembraan en reguleren ze de activiteit van NADPH-oxidase. Het enige bekende spanningsafhankelijke protonkanaal bij mensen is Hv1, het product van het HVCN1-gen2,3. Er is aangetoond dat Hv1 (ook bekend als VSOP) een rol speelt bij de proliferatie van B-cellen4, de productie van reactieve zuurstofsoorten door het aangeboren immuunsysteem5,6,7,8, spermacellen motiliteit9 en pH-regulatie van luchtwegoppervlakvloeistof10. Dit kanaal is betrokken bij verschillende soorten kanker die tot overexpressie komen, zoals B-celmaligniteiten4,11 en borst- en colorectale kankers12,13. Overmatige Hv1-activiteit bleek het metastatische potentieel van kankercellen te vergroten 11, 12. In de hersenen komt Hv1 tot expressie door microglia, en er is aangetoond dat de activiteit ervan hersenbeschadiging verergert in modellen van ischemische beroerte.
Het Hv1-eiwit bevat een spanningsgevoelig domein (VSD), dat bestaat uit vier transmembraansegmenten, S1 tot S414 genaamd. De VSD lijkt op de overeenkomstige domeinen van spanningsafhankelijke Na+-, K+- en Ca2+-kanalen en spanningsgevoelige fosfatasen, zoals CiVSP van Ciona gutis15. In deze andere eiwitten is de C-terminus van S4 bevestigd aan een effectormodule, het poriedomein of enzym. In Hv1 is S4 gekoppeld aan het coiled-coil domein (CCD) gelegen aan de cytoplasmatische kant van het membraan Het kanaal is een dimeer complex dat bestaat uit twee VSD's, die elk een gated protonpermeatiepad bevatten16,17,18. Deze twee Hv1-subeenheden bleken coöperatief te openen19,20,21,22, wat suggereert dat allosterische koppeling en interacties tussen subeenheden spelen een belangrijke rol in het poortproces. Het grensvlak tussen de subeenheden binnen het opgerolde spoeldomein is goed gedefinieerd omdat de kristalstructuren van de twee geïsoleerde domeinen beschikbaar zijn. Aan de andere kant is het grensvlak tussen VSD's binnen het membraan niet goed begrepen. De kristalstructuur van het chimere eiwit Hv1-CiVSP geeft geen informatie over dit grensvlak, aangezien de trimere organisatie van het gekristalliseerde kanaalcomplex het gevolg kan zijn van de vervanging van de natieve Hv1 CCD door de gistleucinerits GCN424.
Een recent onderzoek naar de subeenheidorganisatie van het Hv1-kanaal concludeerde dat twee S4-helices overgaan in de CCD zonder ernstige verstoring van de secundaire structuur, wat resulteert in lange helices die beginnen vanaf het membraan en uitsteken in het cytoplasma. Gebaseerd op cysteïne-crosslinking-analyse, deze studie stelt voor dat Hv1 VSD's met elkaar in contact komen langs het S4-segment. Andere studies hebben echter alternatieve interfaces tussen VSD's voorgesteld. Deze interfaces omvatten S1-segmenten 17, 21, 26 en de buitenste uiteinden van S2-segment 21. Een mogelijke reden voor de conflicterende De resultaten van deze onderzoeken zijn dat de allosterische koppeling tussen VSD's werd onderzocht in relatie tot het poortproces, dat afhangt van de gesloten en open toestanden, en dat de interface tussen VSD's kan variëren bij verschillende toestandsveranderingen in conformatie.
Hier ontdekten we dat 2-guanidinothiazol Hv1-kanalen remt door synergetisch te binden aan twee open VSD's, en gebruikten we een van de verbindingen, 2-guanidinobenzothiazool (GBTA), om de interactie tussen subeenheden in de open toestand te onderzoeken. interface. We ontdekten dat de GBTA-bindingscurve goed kan worden beschreven door een kwantitatief model waarin binding van een remmer aan één subeenheid resulteert in een toename van de bindingsaffiniteit van de aangrenzende subeenheid. We vonden ook dat residuen D112, selectiviteit filtert voor de kanaal 27, 28 en een deel van de bindingsplaats 29 van het guanidinederivaat controleren de GBTA-bindingscoöperatie. We laten zien dat de coöperatieve binding wordt gehandhaafd in het Hv1-dimeer, waar de CCD zich scheidt van het S4-segment, wat suggereert dat de intersubunit-interface in de CCD niet direct bemiddelen allosterische koppeling tussen GBTA-bindingsplaatsen. Daarentegen vinden we dat het S1-fragment deel uitmaakt van het grensvlak tussen de subeenheden en stellen we een opstelling voor van aangrenzende VSD's met het extracellulaire uiteinde van de S4-helix weg van het midden van het dimeer om dit mogelijk te maken het S1-fragment bevindt zich in de open toestand.
Kleine molecuulremmers van Hv1 zijn nuttig als kankermedicijnen en neuroprotectieve middelen. Tot nu toe zijn echter weinig verbindingen in staat geweest het kanaal te remmen30,31,32,33. Waaronder 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, verbinding [1] in Fig. 1a) en zijn derivaten bleken de permeatie van protonen door VSD29,32 door het kanaal te blokkeren. Aangenomen wordt dat de binding van dergelijke verbindingen onafhankelijk plaatsvindt in de twee open subeenheden. 2-guanidinobenzothiazool (GBTA, verbinding [2] in figuur 1a) werd gevonden. eerder is aangetoond dat het Hv1 bijna net zo effectief remt als 2GBI wanneer het wordt getest bij een concentratie van 200 μM (figuur 1b). We onderzochten andere thiazoolderivaten en ontdekten dat sommige van hen het kanaal met een vergelijkbare of grotere potentie remden dan GBTA (figuur 1 en aanvullende We bepaalden de concentratie-responscurven van vier thiazoolderivaten (GBTA en verbindingen [3], [6] en [11], figuur 1c) en ontdekten dat ze steiler waren dan die van 2GBI. De Hill-coëfficiënten (h) van thiazoolderivaten varieerde van 1,109 ± 0,040 tot 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c en aanvullende figuur 1). Daarentegen was de Hill-coëfficiënt voor 2GBI 0,975 ± 0,024 (29, figuur 2a en aanvullende figuur 1). Een Hill-coëfficiënt boven 1 duidt op bindingscoöperatie. Omdat elke Hv1-subeenheid zijn eigen remmer heeft. bindingsplaats29,32 redeneerden we dat de binding van een thiazoolderivaat aan één subeenheid de binding van een tweede remmermolecuul aan de aangrenzende subeenheid zou kunnen versterken. GBTA was de testverbinding met de hoogste Hill-coëfficiënt. Daarom kozen we deze verbinding om verder onderzoek doen naar het mechanisme van bindingsynergie en 2GBI gebruiken als referentie-negatieve controle.
(a) Testverbindingen: [1] Referentie-Hv1-remmer 2-guanidino-benzimidazool (2GBI). [2] 2-guanidinobenzothiazool (GBTA), [3] (5-trifluormethyl-1,3-benzothiazool-2-yl)guanidine, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Thiazool-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazool-2-yl)guanidine, [6](5-broom-4-methyl-1,3-thiazool-2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazool-4-carbonzuurethylester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazool-5-carboxylaat, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazool-5-yl)ethylacetaat, [11]1-[4-(4-chloorfenyl)-1,3-thiazool-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyfenyl)-1,3-thiazool-2-yl]guanidine.(b) Remming van menselijke Hv1-activiteit door de aangegeven guanidinothiazolen en de referentieverbinding 2GBI (blauwgroene balken) .Hv1-protonstromen werden gemeten in inside-out plaques van Xenopus-oöcyten als reactie op depolarisatie van een houdpotentiaal van -80 mV tot +120 mV. Elke remmer werd aan het bad toegevoegd in een concentratie van 200 μM. pHi = pHo = 6,0 Gegevens zijn gemiddelde ± SEM (n≥ 4). (c) Concentratie-afhankelijke remming van menselijk Hv1 door verbindingen [2], [3], [6] en [11]. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde remming ± SD van 3 tot 15 metingen. De lijn is een Hill-fit die wordt gebruikt om de schijnbare Kd-waarden te verkrijgen gerapporteerd in aanvullende tabel 1. Hill-coëfficiënten werden bepaald op basis van de fits gerapporteerd in aanvullende figuur 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (zie methoden).
( a, b ) Verbindingen 2GBI en GBTA remden dimere en monomere Hv1 op een concentratieafhankelijke manier. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde remming ± SD van 3 tot 8 metingen en de curve is een Hill-fit. De Hill-coëfficiënten (h) weergegeven in de inzethistogrammen werden bepaald op basis van de aanvallen gerapporteerd in aanvullende figuren 3 en 4. De concentratierespons van GBTA getoond in (a) is dezelfde als die in figuur 1c. Zie aanvullende tabel 1 voor schijnbare Kd-waarden. (c) Modellering van de coöperatieve binding van GBTA aan dimere Hv1. De ononderbroken zwarte lijn vertegenwoordigt de aanpassing aan de experimentele gegevens door vergelijking (6), die het bindingsmodel beschrijft dat wordt weergegeven in (d). De stippellijnen met de aanduiding Sub 1 en Sub 2 vertegenwoordigen de bimoleculaire associatie -dissociatie-evenwichtscurven van respectievelijk de eerste en tweede bindingsgebeurtenissen (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM (d) Schematisch diagram van het voorgestelde mechanisme van het Hv1-blok. In het geval van GBTA verhoogt binding aan één open subeenheid de affiniteit van de aangrenzende open subeenheid (Kd2
Om de coöperatieve binding van GBTA aan het kanaal kwantitatief te beschrijven, hebben we een model gebruikt waarin elke subeenheid het eerste remmermolecuul kan binden na een bimoleculaire reactie met een dissociatieconstante Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*). Binding zorgt ervoor dat het kanaal een toestand aanneemt waarin de resterende lege subeenheden binden aan de remmer na een unieke bimoleculaire reactie met een dissociatieconstante Kd2, waarbij Kd2 De ononderbroken zwarte lijn in figuur 2c is de aanpassing van de modelvergelijking aan de experimentele concentratie-responscurve, wat een Kd1 van ~290 μM en een Kd2 van ~29 μM oplevert (sectie Methoden, vergelijking (6)). Het model beschrijft ook de binding van 2GBI, waarbij Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). In monomeer Hv1 is er slechts één bindingsplaats en één Kdm (O° + B ⇆ B°). In het geval van GBTA is Kdm ongeveer 54 μM, wat meer lijkt op Kd1 dan op Kd2 (Fig. 2d). Met andere woorden, de bindingsplaats van het monomeer bevindt zich in een configuratie (O°) die meer lijkt op de toestand met hoge affiniteit (BO*) dan de toestand met lage affiniteit (BO*). affiniteitstoestand (OO) van het dimeer, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van de eliminatie van het grensvlak tussen subeenheden.
Zoals eerder getoond voor 2GBI , ontdekten we dat GBTA Hv1-stromen onderdrukte door het kanaal te blokkeren wanneer het open was in plaats van door het moeilijker te maken om te openen (aanvullende figuur 2a, b, d). Het is ook bekend dat 2GBI langzaam afnemende staartstromen induceert als reactie op membraanrepolarisatie, maar dit fenomeen werd niet waargenomen in GBTA (aanvullende figuur 2c). In aanwezigheid van Hv1-inactivatie in aanwezigheid van 2GBI kunnen de poorten in elke subeenheid niet sluiten totdat de blokker de bindingsplaats verlaat (de " foot gate”-mechanisme), en 2GBI ontbindt langzamer dan de poorten sluiten. Als één Hv1-subeenheid wordt gedeblokkeerd en gesloten, terwijl de aangrenzende subeenheid geblokkeerd blijft, wordt het ontbinden van de resterende 2GBI-moleculen langzamer (blokkervangst). Langlevende kanaalsoorten met slechts één geblokkeerde subeenheid geleidt protonen tijdelijk voordat ze sluiten en levert een aanzienlijke bijdrage aan de langzaam afnemende staartstroom.
De bevinding dat het verval van Hv1-staartstromen niet significant werd vertraagd in de aanwezigheid van GBTA (aanvullende figuur 2c) is consistent met een synergetisch bindingsmechanisme voor deze blokker (figuur 2d). Zodra een GBTA-molecuul is losgemaakt van de Hv1-subeenheid daalt de affiniteit van de blokker voor de aangrenzende subeenheid ongeveer tien keer, wat het ontbindingsproces bevordert. Dit betekent dat het tweede molecuul van GBTA een veel grotere kans heeft om te ontrafelen voordat het vast komt te zitten in het kanaal. Langlevende kanaalsoorten die die slechts één blokkerende subeenheid produceren, zullen naar verwachting veel overvloediger aanwezig zijn in de aanwezigheid van GBTA dan in de aanwezigheid van 2GBI, wat resulteert in een sneller verval van de staartstroom.
Om ervoor te zorgen dat GBTA coöperatief kan binden met beide Hv1-subeenheden, moeten de bindingsplaatsen allosterisch gekoppeld zijn. Elke bindingsplaats moet in staat zijn om: 1) een keten van gebeurtenissen teweeg te brengen die communiceren met aangrenzende subeenheden die aan de remmer gebonden zijn, en 2) het bemiddelen van de overgang van binding met lage naar hoge affiniteit. We redeneerden dat als specifieke residuen binnen de bindingsplaats zouden bijdragen aan het coöperatieve proces, hun mutatie de Hill-coëfficiënt van de concentratie-responscurve van GBTA-remming van Hv1 zou moeten veranderen. Residuen D112, F150 Eerder werd aangetoond dat S181 en R211 deel uitmaken van de 2GBI29-bindingsomgeving en we veronderstelden dat ze op vergelijkbare wijze betrokken zouden zijn bij GBTA-binding (Fig. 3A). We maten remmende concentratie-responscurven van GBTA voor mutante kanalen D112E, F150A, S181A , en R211S (Figuur 3) en vergeleken hun Hill-coëfficiënten met die van Hv1-wildtype, met behulp van 2GBI als referentie. Residu V109 bevindt zich op hetzelfde vlak van het S1-segment als D112 en heeft één extra spiraalvormige winding in de cel. V109 was niet betrokken bij de binding van 2GBI29, we gebruikten de V109A-mutant als controle (Fig. 3b).
(a) Voorgestelde Hv1-residuen die betrokken zijn bij de binding van guanidinederivaten. Blauwe stippellijnen omringen eerder voorgestelde zijketens die interageren met verschillende delen van verbinding 2GBI29. (bf) Concentratie-afhankelijke remming van de aangegeven Hv1-mutanten door verbindingen 2GBI (cyaan) en GBTA ( donkerrood). Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde remming van 3 tot 12 metingen ± SD V109 als een negatieve controle. Curven zijn Hill-fits die worden gebruikt om schijnbare Kd-waarden te verkrijgen (zie aanvullende tabel 1). De Hill-coëfficiënten (h) weergegeven in de inzethistogrammen werden bepaald op basis van de aanvallen gerapporteerd in aanvullende figuren 3 en 4. Referentie-h-waarden voor Hv1 WT worden weergegeven als stippellijnen. Sterretjes geven statistisch significante verschillen aan tussen mutant- en WT-passages (p We ontdekten dat de D112E-mutatie de Hill-coëfficiënt (p De bevinding dat de Hill-coëfficiënt voor GBTA-binding hoger is dan 1 in het Hv1-dimeer en ~1 wordt in het monomere kanaal (Fig. 2b) is consistent met het bestaan van allosterische interacties tussen de bindingsplaatsen in de twee subeenheden. In dat geval zou de Hill-coëfficiënt van GBTA-binding aan het dimeer waaraan de blokker aan één subeenheid is gebonden ~1 moeten zijn. We hebben deze voorspelling getest in het Hv1 F150A-WT-gekoppelde dimeer (Fig. 4a), waarbij de affiniteit van de F150A subeenheid voor GBTA was meer dan 2 ordes van grootte hoger dan die van de WT-subeenheid (figuren 1c en 3d). Vervolgens maten we concentratie-responscurven voor remming van de WT-subeenheid bij een basale concentratie van 2 μM GBTA. Bij deze concentratie wordt verwacht dat de blokker ongeveer 99% van de F150A-subeenheid en (a) Schematisch diagram van het F150A-WT-junctiedimeer dat wordt gebruikt om het blokkerende hemikanaal te genereren ({F150A}b-WT/BAO*). Witte ruiten tonen de locatie van de mutatie. In de BAO*- en BA*B*-toestanden: de affiniteit van de F150A-subeenheid zal naar verwachting hoger zijn dan die van de WT-subeenheid. (b) Protonstromen van F150A-WT-kanalen gemeten als reactie op veranderingen in membraanpotentiaal van −80 mV tot +120 mV.pHi = pHo = 6,0 Grijze sporen vertegenwoordigen stromen gemeten in afwezigheid van een remmer. Het zwarte spoor (controle) vertegenwoordigt de stroom gemeten na toevoeging van 2 μM GBTA. Bij deze concentratie werd de WT-subeenheid niet significant geremd, terwijl de F150A-subeenheid bijna volledig aan GBTA bond ({F150A}b-WT). Een verdere toename van de GBTA-concentratie resulteerde in blokkering van de WT-subeenheid (oranje en rode sporen). (c) Concentratie-afhankelijke remming van {F150A}b-WT-dimeer (remmer vooraf gebonden aan F150A-subeenheid). Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde remming ± SD van 3 tot 7 metingen. De curven waren Hill-fits die werden gebruikt om de schijnbare Kd-waarden te verkrijgen gerapporteerd in aanvullende tabel 1. De Hill-coëfficiënten weergegeven in de inzethistogrammen werden bepaald op basis van de fits gerapporteerd in aanvullende figuren 3 en 4. De h-waarden van Hv1 WT zijn weergegeven als stippellijnen. Sterretjes geven statistisch significante verschillen aan vergeleken met WT-dimeer Hv1 (p Omdat GBTA-remming van Hv1 werd gemeten in het open kanaal, redeneerden we dat de GBTA-bindingscoöperatie zou kunnen worden gebruikt om het mechanisme van intersubunit-koppeling in de open toestand te bestuderen. Eerder werd gevonden dat deze twee Hv1-subeenheden coöperatief zijn gepoort 19,20,21, Er werd voorgesteld dat de intersubunit-koppeling die betrokken is bij gating wordt gemedieerd door het cytoplasmatische coiled-coil domein (CCD) 22,25. Daarom vroegen we of CCD ook betrokken is bij de koppeling tussen GBTA-bindingsplaatsen in de open toestand. In eerdere onderzoeken werd aangetoond dat mutaties op het grensvlak tussen het S4-transmembraanfragment en het opgerolde domein dit domein ontkoppelen van de rest van het kanaal terwijl de dimerisatie-integriteit behouden blijft. Daarom testten we het effect van de mutaties V220G, K221G en T222G (Fig. 5a, GGG-mutant) op GBTA-bindingscoöperatie. We vonden een statistisch onbelangrijke (p > 0,05) afname van de Hill-coëfficiënt van GBTA-binding aan GGG-kanalen vergeleken met wildtype (Fig. 5c), wat suggereert dat ondanks zijn rol bij het behouden van de . twee subeenheden samen belangrijk, maar CCD bemiddelt niet direct tussen de allosterische koppeling tussen GBTA-bindingsplaatsen.
(a) Schematisch diagram van het Hv1-dimeer met een triglycinemutatie aan het binneneinde van S4, ontworpen om de intersubunitkoppeling te verstoren die wordt gemedieerd door het cytoplasmatische opgerolde domein (blauwe pijlen). (b) Schematische weergave van Hv1-dimeren en ligatiedimeren met aangegeven mutaties, ontworpen om S1-fragmenten te testen die betrokken zijn bij de koppeling tussen subeenheden (blauwe pijlen). (c – h) 2GBI (cyaan) en GBTA (donkerrood) remmen de aangegeven constructen op een concentratieafhankelijke manier. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde remming ± SD van 3 tot 10 metingen. De curve was een Hill-fit die werd gebruikt om schijnbare Kd-waarden te verkrijgen (zie aanvullende tabel 1). Hill-coëfficiënten in de geïnterpoleerde histogrammen werden bepaald zoals beschreven in de sectie Methoden (zie aanvullende figuren 3 en 4). Referentie h-waarden voor Hv1 WT wordt weergegeven als stippellijnen. Sterretjes geven statistisch significante verschillen aan tussen mutant- en WT-passages (p Omdat we CCD als een directe bemiddelaar van GBTA-coöperatieve binding hebben uitgesloten, hebben we gevraagd of interacties tussen VSD's betrokken zijn bij allosterische koppeling tussen bindingsplaatsen. We ontdekten dat GBTA-bindende coöperatie werd afgeschaft door conservatieve mutatie van residu D112 (Fig. 3c) gelokaliseerd in in het S1-transmembraansegment. S1 bevat twee andere negatief geladen residuen, E119 en D123, gelokaliseerd aan dezelfde kant van de helix als D112, maar dichter bij het uiteinde 24 van het fragment. Vroege moleculaire dynamica-simulaties gaven aan dat deze residuen met elkaar verbonden waren naar D112 via waterlijnen. Daarom hebben we getest of E119 en D123 betrokken zijn bij allosterische koppeling tussen GBTA-bindingsplaatsen (Fig. 5b). Als negatieve controle hebben we de geconserveerde positief geladen positie K125 getest, die zich nabij D123 bevindt. maar aan de andere kant van de S1-helix (Fig. 5b).
We maten de concentratie-afhankelijke remming van E119A-, D123A- en K125A-kanalen door 2GBI en GBTA en ontdekten dat E119A- en K125A-mutaties de Hill-coëfficiënt van geen van beide remmers significant veranderden in vergelijking met wildtype (p> 0,05, Fig. 5d, i). ). Aan de andere kant verminderde mutatie D123A de Hill-coëfficiënt van GBTA aanzienlijk (p 0,05/14).
Omdat het neutraliseren van de lading op positie 123 op beide subeenheden resulteerde in een sterke verandering in de GBTA-bindingscoöperatie, terwijl het omkeren van de lading op beide subeenheden slechts een klein effect had, hebben we de analyse uitgebreid met slechts één subeenheid met het inversiekanaal van de lading. genereerde Hv1-gekoppelde dimeren met D123R-substitutie in de C-terminale subeenheid (Fig. 5b) en mat de concentratie-responsremming door GBTA en 2GBI. We ontdekten dat de Hill-coëfficiënt van GBTA-binding aan WT-D123R-kanalen aanzienlijk hoger was dan die van wildtype Hv1 (p We ontdekten ook dat de D112E-mutatie de toename van de GBTA-bindende Hill-coëfficiënt, geproduceerd door de WT-D123R-achtergrond, teniet deed (Fig. 5b, h en Aanvullende Fig. 4). Het effect op de Hill-coëfficiënt van 2GBI-binding werd ook geëlimineerd (Fig. 5b, h en Aanvullende Fig. 4). Figuur 5h en aanvullende figuur 3). Deze bevindingen suggereren dat de verbeterde allosterische koppeling tussen subeenheden veroorzaakt door tegengestelde ladingen op positie 123 zich niet vertaalt in sterkere bindingscoöperatie wanneer de bindingsplaats op positie D112 wordt verstoord.
We redeneerden dat als de D123-residuen op aangrenzende open subeenheden dichtbij genoeg waren om elektrostatisch met elkaar te interageren, de afstotende interactie tussen de negatieve ladingen zou worden omgezet in een combinatie van negatieve en positieve ladingen door vervanging van asparaginezuur door arginine. aantrekkelijke interactie daartussen. Eén subeenheid (WT-D123R-dimeer). Aantrekkelijke interacties kunnen het grensvlak tussen de uiteinden van het S1-fragment versterken, wat leidt tot een sterkere allosterische koppeling tussen de subeenheden en een verhoogde GBTA-bindende samenwerking.
Om deze hypothese te ondersteunen, hebben we gezocht naar een manier om het grensvlak tussen de uiteinden van het S1-segment te versterken, wat verschilt van de ladingswisseling op positie 123. Lee et al. Mutatie van Hv1-residu I127 naar cysteïne werd eerder gevonden om te resulteren in spontane verknoping tussen subunits17. Bovendien gaf de kristalstructuur van de chimere VSD Hv1-CiVSP aan dat I127 door slechts één residu van het uiteinde van de S1-helix is gescheiden. We vroegen daarom of de vorming van een covalente binding tussen cysteïnes op positie 127, waarvan wordt verwacht dat ze resulteren in een sterkere S1-S1-interactie, hebben een effect op de GBTA-bindingscoöperatie die vergelijkbaar is met het effect dat wordt waargenomen door het veranderen van de lading op positie 123.
We maten de concentratie-afhankelijke remming van Hv1 I127C door GBTA en 2GBI in de aanwezigheid en afwezigheid van 10 mM β-mercaptoethanol (βME) (Fig. 6a). Op hetzelfde moment dat de remmer aan de intracellulaire oplossing wordt toegevoegd, wordt de reducerende agens wordt aan de extracellulaire oplossing toegevoegd. Een gekoppeld dimeer met cysteïnesubstitutie in slechts één subeenheid (WT-I127C) werd gebruikt als een negatieve controle (Fig. 6a). We konden geen enkel effect van spontane intersubeenheid-verknoping meten tussen de I127C-subeenheden bij 2GBI-remming, omdat de Hill-coëfficiënt voor I127C-binding aan Hv1, met of zonder βME, significant verschilde van die voor binding aan monocysteïne-gesubstitueerde dimeren. De Hill-coëfficiënt kon WT-I127C niet differentiëren (figuur 6b en aanvullende figuur 3). In schril contrast maten we het dramatische effect van spontane intersubunit-verknoping op GBTA-remming. De Hill-coëfficiënt voor binding aan Hv1 I127C in de afwezigheid van βME (crosslink aan) was significant hoger dan gemeten in de aanwezigheid van βME (crosslink uit) of met behulp van WT-127C om het dimeer te koppelen (bij afwezigheid van crosslink) (figuur 6c en aanvullende figuur 4), wat aangeeft dat de allosterische koppeling tussen bindingsplaatsen wordt aanzienlijk versterkt door de vorming van disulfidebindingen tussen de uiteinden van de S1-fragmenten. Deze resultaten ondersteunen onze interpretatie dat de aantrekkelijke elektrostatische interactie van aspartaat en arginine op positie 123 in het WT-D123R-dimeer resulteert in een verhoogde allosterische koppeling tussen de subeenheden.
Open-state koppeling wordt tot stand gebracht door directe fysieke interacties tussen de uiteinden van het S1-segment in de twee subeenheden.
(a) Schematische weergave van mutante Hv1-dimeren en linker-dimeren, ontworpen om te onderzoeken hoe intersubunit cysteïne-verknopingen de GBTA-bindingscoöperatie beïnvloeden. (bd) Concentratie-afhankelijke remming van de aangegeven constructen door 2GBI (b,d) en GBTA (c, e) in aanwezigheid of afwezigheid van 10 mM βME in extracellulaire oplossing. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde remming ± SD van 3 tot 10 metingen. De curve was een Hill-fit die werd gebruikt om Kd-waarden te verkrijgen (zie aanvullende tabel 1). Hill-coëfficiënten in de inzethistogrammen werden bepaald op basis van de fits gerapporteerd in aanvullende figuren 3 en 4. Sterretjes in (c, e) geven statistisch significante verschillen aan tussen verschillende GBTA-remmingsomstandigheden (p 0,05).
We ontdekten ook dat bij afwezigheid van βME de Hill-coëfficiënt van GBTA-binding aan het D112E I127C Hv1-dimeer significant hoger was dan die gemeten in de aanwezigheid van reductiemiddelen (Fig. 6e en Aanvullende Fig. 4), wat impliceert dat de D112E-mutatie heeft de toename van de GBTA-bindingscoöperatie als gevolg van de verknoping van cysteïne 127 niet afgeschaft. De Hill-coëfficiënt van 2GBI-binding aan D112E, I127C Hv1-dimeren werd ook niet significant beïnvloed door de D112E-mutatie (Figuur 1).6d en aanvullende Afb. 3).
Alles bij elkaar suggereren deze bevindingen dat GBTA-binding wordt versterkt door de interactie tussen de uiteinden van S1-fragmenten in aangrenzende Hv1-subeenheden door aantrekkelijke elektrostatische interacties of door de vorming van covalente bindingen tussen gesubstitueerde cysteïnes. Allosterische koppeling tussen plaatsen neemt toe en resulteert in bindende coöperatie. Hoewel het effect van aantrekkelijke elektrostatische interacties op de coöperativiteit kan worden opgeheven door mutatie D112E, kan het effect van covalente bindingen dat niet.
Bij onze verkenning van de chemische ruimte die beschikbaar is voor het binden van guanidinederivaten aan Hv1-kanalen, hebben we ontdekt dat 2-guanidinothiazolen zoals GBTA een sterkere concentratieafhankelijkheid hebben dan 2-guanidinobenzimidazolen (figuur 1c). De Hill-coëfficiëntanalyse van GBTA-binding aan zowel de dimere en monomere kanalen (Fig. 2a, b) en aan het dimere kanaal waarin één subeenheid vooraf gebonden was aan de remmer (Fig. 4) leidde ons tot de conclusie dat de remming van Hv1 door GBTA de actie een synergetisch proces is, en de bindingsplaatsen van de verbindingen in de twee subeenheden zijn allosterisch gekoppeld. De ontdekking dat GBTA aan het open kanaal bindt, zoals eerder aangetoond voor de verwante verbinding 2GBI32, suggereert dat allosterische koppeling specifiek kan worden beoordeeld in de open toestand. Ons coöperatieve bindingsmodel was in staat om de remming van Hv1 door GBTA kwantitatief te beschrijven (figuur 2c) en de verschillende effecten van 2GBI en GBTA op het verval van kanaalstaartstromen na membraanrepolarisatie te verklaren, wat onze interpretatie van het bindingsproces ondersteunt.
De maximale Hill-coëfficiënt die kan worden bereikt in een allosterisch eiwit met twee bindingsplaatsen (zoals Hv1) is 2. We hebben GBTA gemeten om het wildtype Hv1 te binden met een coëfficiënt van 1,31, die toenam tot 1,88 in Hv1 I127C. synergetische vrije energie, het verschil tussen de bindingsvrije energieën van de plaatsen met de laagste en hoogste affiniteit (zie Methoden), was 1,3 kcal/mol in het geval van het wildtype Hv1 en 2,7 kcal/mol in het geval van Hv1 I127C. van zuurstof naar hemoglobine is het bekendste en best bestudeerde voorbeeld van het samenwerkingsproces38. Voor menselijk hemoglobine (een tetrameer met vier allosterisch gekoppelde bindingsplaatsen) varieert de Hill-coëfficiënt van 2,5-3,0, met waarden variërend van 1,26 tot 3,64 kcal/mol, afhankelijk van experimentele omstandigheden38. In termen van globale energie verschilt de coöperativiteit van GBTA-binding aan Hv1 dus niet substantieel van die van O2-binding aan hemoglobine wanneer de verschillende aantallen eiwitsubeenheden in de twee systemen in ogenschouw worden genomen.
In ons synergiemodel resulteert de binding van GBTA-moleculen aan één subeenheid in een toename van de bindingsaffiniteit van de aangrenzende subeenheid. We stellen ons een proces voor waarin een herschikking van de bindingsomgeving als gevolg van de eerste bindingsgebeurtenis (geïnduceerde fit) leidt tot veranderingen in de interacties tussen subeenheden. Als reactie op deze veranderingen veranderen aangrenzende subeenheden hun bindingsplaatsen, wat resulteert in een nauwere GBTA-binding. Tijdens dit proces is het S1-aspartaat D112 verantwoordelijk voor de herschikking van de bindingsplaats geassocieerd met verhoogde bindingsaffiniteit. D112 Eerder werd aangetoond dat het deel uitmaakt van de Hv1-protonpermeatieroute en fungeert als selectiviteitsfilter . Onze resultaten laten zien dat selectiviteitsfilters in de twee Hv1-subeenheden allosterisch gekoppeld zijn in de open toestand. Figuur 7a toont de geschatte locatie van de GBTA-bindingsplaats en de locatie van residuen D112, D123, K125 en I127 op een schema van de op Hv1 VSD gebaseerde over de kristalstructuur van de Hv1-CiVSP-chimeer. Voorgestelde richtingen voor allosterische koppeling waarbij het extracellulaire uiteinde van S1 betrokken is, worden weergegeven met zwarte pijlen.
(a) Schematische voorstelling van de Hv1 VSD. Gebaseerd op de kristalstructuur van de Hv1-CiVSP-chimeer, wordt getoond dat de spiraalvormige segmenten cilindrisch zijn. In deze configuratie versmelt het binnenste uiteinde van het S4-segment met de CCD (niet getoond). De voorspelde locaties van gebonden GBTA worden weergegeven als grijze ovalen. Zwarte pijlen geven routes aan die betrokken zijn bij allosterische koppeling tussen bindingsplaatsen in twee aangrenzende subeenheden. De posities van de onderzochte S1-residuen zijn gemarkeerd met gekleurde bollen. (b) Schematische weergave van Hv1-subeenheden gerangschikt in twee verschillende dimeerconfiguraties gezien vanaf de extracellulaire zijde van het membraanvlak. Op het linkerpaneel wordt het dimeergrensvlak gevormd door de S4-helix. Rotatie van de twee VSD's 20 graden met de klok mee rond een as loodrecht op het membraanvlak, vergezeld van scheiding van de buitenste uiteinden van de twee S4-helices (stippelpijlen), levert de opstelling op die rechts wordt weergegeven. In deze configuratie mogen de residuen D123 en I127 van aangrenzende subeenheden dicht bij elkaar komen. (c) Schematische weergave van de CiVSP VSD in de dimeerconfiguratie gevonden in de 4G80-kristalstructuur. Positie P140 in CiVSP komt overeen met positie D123 in Hv1.
Onze resultaten laten zien dat de afstotende elektrostatische interactie tussen residu 123 (123D/123D of 123R/123R) geassocieerd is met een “normaal” niveau van GBTA-bindende coöperatie in de open toestand en de interactie verschuift van afstoting naar aangetrokken (123D/123R). Er wordt verwacht dat het verwijderen van de afstotende interactie met alaninesubstitutie ook zou leiden tot verhoogde coöperativiteit. Er werd echter een afname in coöperativiteit van het 123A/123A-dimeer waargenomen (Fig. 5e). Eén mogelijke mogelijkheid De verklaring hiervoor is dat het destabiliserende effect van het plaatsen van hydrofobe residuen in een hydrofiele omgeving mogelijk opweegt tegen het stabiliserende effect als gevolg van de eliminatie van afstotende interacties tussen D123-residuen, resulterend in een algehele vermindering van de bindingscoöperatie. Mony et al.39 rapporteerden onlangs dat de toegankelijkheid van oplosmiddelen bij positie D171 van Ciona gutis Ci-Hv1 (overeenkomend met D123 in menselijk Hv1) wordt verhoogd bij activering, wat het idee ondersteunt dat D123 zich in een hydrofiele omgeving in de open toestand bevindt.
Het is bekend dat het poorten van Hv1-kanalen plaatsvindt via meerdere overgangen19,20,26,39,40,41. Qiu et al. ontdekten dat bij membraandepolarisatie de spanningssensor van Ci-Hv1 een conformationele verandering ondergaat waardoor het kanaal geactiveerd maar nog steeds gesloten blijft. , gevolgd door een duidelijke overgang die ervoor zorgt dat protonen de geleiding in het pad van beide subeenheden openen. De conformationele verandering van de spanningssensor werd gevolgd door spanningsklemfluorescentie, en er werd gevonden dat de tweede overgang selectief werd verstoord door de mutatie op positie D171. De verstoring van het fluorescentiesignaal komt overeen met de aanwezigheid van elektrostatische interacties tussen de D171-residuen van aangrenzende subeenheden op een bepaald punt langs de reactiecoördinaten van de conformationele verandering. Deze interpretatie komt overeen met onze bevinding dat het D123-residu elektrostatisch interageert in de open toestand. en bemiddelt allosterische koppeling tussen GBTA-bindingsplaatsen.
Fujiwara et al. stelden voor dat het dimeergrensvlak van het cytoplasmatische spiraalvormige domein zich uitstrekt tot in het membraan en twee S4-helices bevat (Fig. 7b, linkerpaneel). Een model van deze intersubunit-interactie is gebaseerd op cysteïne-verknopingsanalyse die betrekking heeft op de volledige VSD en functionele analyse van het gebied dat de S4-helix en de CCD verbindt. Bij afwezigheid van een transmembraan pH-gradiënt vereisen Hv1-kanalen aanzienlijke membraandepolarisatie om te openen, en cysteïne-verknoping vindt plaats onder omstandigheden waarin het kanaal overwegend gesloten is. Daarom weerspiegelt de gedetecteerde S4-S4-interface waarschijnlijk de off-state subeenheidconfiguratie. Andere onderzoeken hebben bewijs gevonden voor de betrokkenheid van S1 en S2 bij intersubeenheidinteracties tijdens poorting, wat suggereert dat kanalen verschillende subeenheidconfiguraties kunnen aannemen in de open en gesloten staten, een idee dat consistent is met de bevindingen van Mony et al. S1 beweegt 39 tijdens het poortproces.
Hier laten we zien dat, in de open toestand, de extracellulaire uiteinden van de S1-helix dichtbij genoeg zijn om directe elektrostatische interacties te ondersteunen die allosterische koppeling tussen subeenheden bemiddelen. In de dimeerconfiguratie met uitgebreide S4-S4-interacties zijn de S1-helices te ver weg. van elkaar gescheiden om direct op elkaar in te werken. Een rotatie van 20° met de klok mee van de twee VSD-subeenheden rond een as loodrecht op het membraanvlak, gecombineerd met de scheiding van de buitenste uiteinden van de twee S4-helices, leverde echter een S1-S1-configuratie op die consistent was met onze bevindingen (Fig. 7b, rechterpaneel). We raden deze configuratie aan voor het kanaal in open toestand.
Hoewel men denkt dat het CiVSP-enzym als monomeer functioneert, wordt de kristalstructuur van de geïsoleerde VSD gevangen in een dimeertoestand. De buitenste uiteinden van de S1-helices in dit dimeer liggen ruimtelijk dicht bij elkaar en de algehele configuratie is vergelijkbaar met de voorgestelde configuratie. voor Hv1 (Fig. 7c). In het CiVSP-dimeer was het dichtstbijzijnde residu van de aangrenzende subeenheid proline op positie 140 (Fig. 7c). Interessant genoeg komt P140 in CiVSP overeen met positie D123 in Hv1. De gelijkenis in subeenheidconfiguratie tussen Hv1 en CiVSP-dimeren suggereren dat de VSD's van deze eiwitten een intrinsieke neiging hebben om een grensvlak te vormen waar de extracellulaire uiteinden van S1 op elkaar inwerken.
De essentiële rol van Hv1 bij de activering van spermacellen maakt dit kanaal tot een aantrekkelijk medicijndoelwit voor de controle van de mannelijke vruchtbaarheid. Bovendien is aangetoond dat activering van Hv1 in microglia het herstel na een ischemische beroerte verergert. Verbeterde Hv1-activiteit bleek geassocieerd te zijn met lagere overleving bij patiënten met borst- of colorectale kanker 13 en er wordt aangenomen dat ze bijdragen aan B-celmaligniteiten 11. Daarom kunnen kleine molecuulgeneesmiddelen die zich richten op Hv1 worden gebruikt als neuroprotectieve middelen of als antikankertherapie. De ontdekking dat guanidinothiazoolderivaten conformationele herschikkingen kunnen veroorzaken in de open Hv1-subeenheid, leidend tot verhoogde bindingsaffiniteit, kan leiden tot de ontwikkeling van krachtigere geneesmiddelen die zich richten op Hv1-kanalen.
Plaatsgerichte mutagenese van menselijk Hv1 werd uitgevoerd met behulp van standaard PCR-technieken. In het Hv1NCCiVSP-construct werden residuen 1-96 en 228-273 van Hv1 vervangen door residuen 1-113 en 240-576 van CiVSP18. In het Hv1-gekoppelde dimeer, de C-terminus van één subeenheid is gekoppeld aan de N-terminus van de tweede subeenheid via de GGGSGGSGGSGSGGSGG-linker. De pGEMHE-plasmiden die de verschillende constructen bevatten, werden gelineariseerd met Nhe1- of Sph1-restrictie-enzymen (New England Biolabs) en RNA-synthese werd uitgevoerd met de T7 mMessage mMachine transcriptiekit (Ambion). 1-3 dagen vóór elektrofysiologische metingen werd cRNA geïnjecteerd in Xenopus-oöcyten (50 nl per cel, 0,3-1,5 μg/μl). Stadium V- en VI-oöcyten van Xenopus laevis (NASCO) werden verkregen van Ecocyte Bioscience. Na RNA-injectie werden de cellen in ND96-medium gehouden dat 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvaat, 100 μg/ml gentamicine, pH 7,2 18°C bevatte. .
2-guanidinobenzimidazool[1], 2-guanidinobenzothiazool[2], (4-methyl-1,3-thiazool-2-yl)guanidine [5], (5-broom-4-methyl-1,3 -thiazool-2-yl)guanidine) [6], ethyl-2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazool-4-carboxylaat [8], ethyl-2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazool- 5-carboxylaat [9] en (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazool-5-yl)ethylacetaat [10] waren van Sigma-Aldrich.Famotidine [7] was van MP Biomedicals.1-[4 -(4-Chloorfenyl)-1,3-thiazool-2-yl]guanidine[11] en 1-[4-(3,4-dimethoxyfenyl)-1,3-thiazool-2-yl]guanidine [12] werden van Matrix Scientific. Deze verbindingen zijn van de hoogste zuiverheid die in de handel verkrijgbaar is. Ze werden opgelost in droog DMSO om een voorraadoplossing van 100 mM te genereren, die vervolgens in de opnameoplossing werd verdund tot de gewenste eindconcentratie. Verbindingen 3 en 4 werden hieronder gesynthetiseerd met minimaal 99% zuiverheid.
Aan een suspensie van 2-amino-4-(trifluormethyl)benzeenthiolhydrochloride (1,02 g, 4,5 mmol) in 25 ml waterig zoutzuur (2,5 N) werd vast dicyaandiamide (380 mg, 4,5 mmol) toegevoegd, en het resulterende heterogene mengsel werd gedurende 4 uur onder krachtig roeren gerefluxt. Het reactiemengsel werd afgekoeld tot kamertemperatuur en geneutraliseerd door geleidelijke toevoeging van 10 N kaliumhydroxide. Het gevormde witte neerslag werd gefiltreerd, gewassen met koud water (3 x 50 ml), gedroogd in een oven ( 65 °C) gedurende enkele uren, en vervolgens herkristalliseerd uit ethylacetaat/petroleumether, wat een witte vaste stof (500 mg, 48%) opleverde; smp. 221–222 °C (licht 225–226 °C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (zeer brede s, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 H), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114,2 (d, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Hz), 126,1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.HRMS (ESI): m/z berekende waarde. Voor C9H8F3N4S (M + H)+: 261,0416, gevonden : 261.0419.
Nafto[1,2-d]thiazool-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), gesynthetiseerd zoals eerder beschreven, werd in een oliebad in een kleine reageerbuis tot 200 °C verwarmd. 300 mg (grote overmaat) cyanamide en 1,0 ml geconcentreerd aan de hete verbinding werd snel zoutzuur toegevoegd en het mengsel werd ongeveer 2 minuten in het oliebad gehouden, gedurende welke tijd het grootste deel van het water verdampte. Het reactiemengsel werd vervolgens afgekoeld tot kamertemperatuur en het resulterende materiaal werd vast. werd in kleine stukjes gebroken en gewassen met water, wat een lichtgele amorfe vaste stof opleverde (38 mg, 10%), smeltpunt 246-250 °C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 H, J = 8,3 Hz). 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.HRMS (ESI): berekende waarde in m/z. Voor C12H11N4S (M + H)+: 243,0699 , gevonden: 243.0704.
Protonstromen werden gemeten in interne en externe plekken van eicellen die verschillende constructen tot expressie brengen met behulp van een Axopatch 200B-versterker bestuurd door een Axon Digidata 1440A (Molecular Devices) met pClamp10-software. Intracellulaire en extracellulaire oplossingen hebben dezelfde samenstelling: 100 mM 2- (N-morfolino )ethaansulfonzuur (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylaat, 5 mM TEA chloride, 5 mM ethyleenglycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetra-azijnzuur (EGTA), aangepast aan pH 6,0 met TEA-hydroxide. Alle metingen werden uitgevoerd bij 22 ± 2 °C. De pipet heeft een toegangsweerstand van 1,5–4 MΩ. De huidige sporen werden gefilterd op 1 kHz, bemonsterd op 5 kHz en geanalyseerd met Clampfit10.2 (Molecular Devices ) en Origin8.1 (OriginLab).
Oplossingen die verschillende concentraties Hv1-remmer en in sommige gevallen 10 mM βME bevatten, werden door de zwaartekracht in het bad geïntroduceerd via een verdeelstuk dat was aangesloten op een VC-6 perfusieklepsysteem (Warner Instr.), dat door de pClamp-software TTL (Transistor- Transistor Logic) signalen. Snelle perfusie-experimenten werden uitgevoerd met behulp van een perfusiepotlood met meerdere buisjes (AutoMate Sci.) met een aflevertip met een diameter van 360 μm, gemonteerd voor een patchpipet. Kanaalremming werd bepaald door isochronale amperometrische metingen aan het einde van de +120 mV depolariserende puls. GV-metingen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven. Staartstromen werden geregistreerd bij -40 mV na depolarisatiestappen bij verschillende spanningen van -20 mV tot +120 mV, tenzij anders vermeld. De referentiepuls voorafgaand aan de testpuls is gebruikt om te corrigeren voor stroomverval 18. De GV-grafiek past bij de Boltzmann-vergelijking:
De schijnbare dissociatieconstanten (Kd) voor verschillende combinaties van kanalen en remmers (aanvullende tabel 1) werden bepaald door de concentratie-afhankelijkheid van remming (gemiddelde% inhibib-waarden) aan te passen met de Hill-vergelijking:
waarbij [I] de concentratie van remmer I is en h de Hill-coëfficiënt is. Om de Hill-coëfficiënt te berekenen, wordt vergelijking (2) opnieuw gerangschikt als:
Posttijd: 07-jun-2022
