Анализа гликана специфичне за локацију САРС-ЦоВ-2 врха

Развој вакцине за тешки акутни респираторни синдром коронавирус 2 (САРС-ЦоВ-2) фокусиран је на тримерни спике протеин који изазива инфекцију. Сваки протомер у тримерном врху има 22 места гликозилације. Начин на који су ова места гликозилована може утицати на ћелије које вирус инфицира и може заштитити одређене епитопе од неутрализације антитела. Ватанабе је чекао. Рекомбинантни гликозиловани шиљасти тример је експримиран и пречишћен, протеолизован да би се произвели гликопептиди који садрже појединачне гликане, а састав гликанских места је одређен масеном спектрометријом. Ова анализа пружа референтну вредност која се може користити за мерење квалитета антигена приликом развоја вакцина и тестова на антитела.
β-коронавирус, појава тешког акутног респираторног синдрома, коронавирус 2 (САРС-ЦоВ-2) је узрочник болести корона вируса 2019 (ЦОВИД-19), која представља огромну претњу по људско здравље широм света. Развој вакцине се фокусирао на главну мету хуморалног имуног одговора, синаптички (С) гликопротеин, који посредује у уласку ћелије и фузији мембране. Сваки САРС-ЦоВ-2 С ген кодира 22 Н-везане гликозилне секвенце, које могу играти улогу у савијању протеина и бекству имунитета. Овде смо, коришћењем масене спектрометрије специфичне за локацију, открили структуру гликана на рекомбинантном САРС-ЦоВ-2 С имуногену. Ова анализа може мапирати стање обраде гликана преко врха тримерног вируса. Показујемо разлику између САРС-ЦоВ-2 С гликана и типичне обраде гликаном домаћина, што може имати утицај на патологију вируса и дизајн вакцине.
Тешки акутни респираторни синдром Коронавирус 2 (САРС-ЦоВ-2) је узрочник (1, 2) Цоронавируса 2019 (ЦОВИД-19), који може изазвати грозницу, тешке респираторне болести и упалу плућа. САРС-ЦоВ-2 користи широко гликозиловани шиљасти (С) протеин који вири са површине вируса да се веже за ензим који конвертује ангиотензин 2 (АЦЕ2) да посредује у уласку у ћелију домаћина (3). С протеин је тримерни фузиони протеин класе И, састављен од две функционалне подјединице, одговорне за везивање рецептора (С1 подјединица) и фузију мембране (С2 подјединица) (4, 5). Површина обложеног нокта је углавном контролисана гликанима добијеним из домаћина, а сваки тример приказује 66 Н-повезаних места гликозилације. С протеин је кључни циљ у раду на дизајну вакцине (6). Разумевање гликозилације рекомбинантних вирусних шиљака може открити основне карактеристике биологије вируса и водити стратегије дизајна вакцине (7, 8).
Вирусна гликозилација има широк спектар улога у вирусној патобиологији, укључујући посредовање у савијању протеина и стабилности и обликовању вирусног тропизма (9). Места гликозилације су под селективним притиском јер промовишу имунолошки бекство штитећи специфичне епитопе од неутрализације антитела. Међутим, приметили смо да је стопа мутације САРС-ЦоВ-2 веома ниска и до сада није примећена мутација на месту гликозилације везаног за Н (10). Површине са абнормално високом густином гликана такође могу постићи имунолошко препознавање (9, 11, 12). За друге коронавирусе, проучавана је улога гликозилације у камуфлирању имуногених протеинских епитопа (10, 13, 14). Коронавируси клијају у ендоплазматски ретикулум-Голгијеву шупљину и формирају вирионе (15, 16). Међутим, када су сложени типови гликана уочени на материјалима добијеним од вируса, откривено је да су на вирусни гликопротеин утицали ензими за обраду који су се налазили у Голгију (13, 17).
Висока густина вирусног гликана и локална структура протеина просторно нарушавају пут сазревања гликана. Оштећено сазревање гликана које доводи до присуства гликана типа олигоманозе може бити осетљив репортер природне протеинске структуре (8), а анализа гликана специфична за место може се користити за упоређивање различитих имуногена и праћење производних процеса (18). Поред тога, гликозилација може утицати на транспорт рекомбинантног имуногена до герминалног центра (19).
Да бисмо решили гликозилацију специфичне за локацију САРС-ЦоВ-2 С протеина и визуелизовали дистрибуцију гликопротеина на целој површини протеина, експримирали смо и пречистили три биолошка аспекта рекомбинантних растворљивих материјала на исти начин као што се користи за добијање протеина. . реплика. Структура крио-електронске микроскопије високе резолуције (крио-ЕМ), упркос недостатку блокирајућег ефекта кифенонина на процесирање гликана (4). Ова варијанта С протеина садржи сва 22 гликана на САРС-ЦоВ-2 С протеину (слика 1А). Коришћењем 2П стабилних мутација остатака 986 и 987 (20), ГСАС (Гли-Сер-Ала-Сер) супституције (остаци 682 до 685) и Ц на месту цепања фурина, структура пре фузије тримера се остварује стабилности. -Мотив завршне тримеризације. Ово помаже у одржавању квартарне структуре током обраде гликана. Пре анализе, супернатант који садржи рекомбинантни САРС-ЦоВ-2 С је пречишћен хроматографијом искључивања величине како би се осигурало да су анализирани само природни тримерни протеини (Слика 1Б и Слика С1). Конформација тримера пречишћеног материјала је верификована коришћењем негативног бојења ЕМ (Слика 1Ц).
(А) Шематски дијаграм САРС-ЦоВ-2 С гликопротеина. Положај Н-везане гликозилационе секвенце (НКСС/Т, где је Кс=П) приказан је као грана (Н, Асн; Кс, било који остатак; С, Сер; Т, Тхр; П, Про). Описује домене протеина: Н-терминални домен (НТД), домен везивања рецептора (РБД), фузиони пептид (ФП), хептапептидни понављање 1 (ХР1), централни хеликс (ЦХ), домен конектора (ЦД) и трансмембрански домен (ТМ) ). (Б) Анализа електрофорезе у СДС-полиакриламидном гелу САРС-ЦоВ-2 С протеина (означеног стрелицом) израженог у ћелијама 293Ф људског ембрионалног бубрега (ХЕК). Трака 1: Супернатант филтриран из трансфектованих ћелија; Трака 2: Проток од СтрепТацтин смоле; Трака 3: Прање са СтрепТацтин смолом; Трака 4: Елуција из СтрепТацтин смоле. (Ц) Средња вредност ЕМ 2Д негатива САРС-ЦоВ-2 С протеина. Приказана је 2Д просечна вредност САРС-ЦоВ-2 С протеина, што потврђује да протеин усваја конформацију тримера пре фузије, која одговара материјалу који се користи за одређивање структуре (4).
Да бисмо одредили гликозилацију САРС-ЦоВ-2 С, специфичну за место, користили смо трипсин, химотрипсин и α-литичку протеазу да бисмо генерисали три узорка гликопептида. Ове протеазе су одабране да производе гликопептиде који садрже једну Н-везану гликанску секвенцу. Гликопептиди су анализирани течном хроматографијом-масеном спектрометријом и одређен је састав гликана свих 22 Н-везана гликанска места (слика 2). Да би се пренеле главне карактеристике обраде сваке локације, према гранању и фукозилацији, обиље сваког гликана је класификовано у категорије олигоманозе, хибрида и комплексне гликозилације. Табела С1 и Слика 6 дају детаљне проширене приказе који показују различите саставе гликана. С2.
Дијаграм илуструје кодове боја за главне типове гликана који се могу појавити дуж пута сазревања од олигоманозе до хибридних типова гликана. Ове бројке сумирају квантитативну анализу масене спектрометрије популације гликана присутне на једном Н-везаном месту гликозилације, сведене на категорију гликана. Серија гликана олигоманозног типа (М9 до М5; Ман9ГлцНАц2 до Ман5ГлцНАц2) су зелени, негликозиловани и фукозиловани хибридни гликани (хибрид и Ф хибрид), испрекидана линија је ружичаста, према броју антена. А1 до ФА4) је ружичаста у присуству услова. Слободна радна места на Н-везаним гликанским местима су приказана сивом бојом. Кружни графикон резимира квантификацију ових гликана. Гликанска места су обојена према садржају гликана типа олигоманозе, а места гликана су означена као зелена (80% до 100%), наранџаста (30% до 79%) и розе (0% до 29%). Проширена верзија анализе специфичне за локацију која показује хетерогеност унутар сваке категорије може се наћи у табели С1 и на слици 6. С2. Ступасти графикон представља просек од три биолошка понављања, а траке грешке представљају стандардну грешку просека.
Две локације на САРС-ЦоВ-2 С су углавном олигоманозе: Н234 и Н709. Осим Н234, главна олигоманозна гликанска структура уочена у целом протеину је Ман5ГлцНАц2 (Ман, маноза; ГлцНАц, Н-ацетилглукозамин), што указује да ова места могу бити у великој мери приступа α-1,2-манозидази, али супстрат ГлцНАцТ -1 је слаб, ГлцНАцТ-1 је кључни ензим у формирању хетерозиготних и комплексних гликана у Голгијевом апарату. Фаза која омета обраду је карактеристика која се односи на густину и презентацију гликана на вирусним шиљцима. На пример, високи врхови гликозилације ГПЦ вируса ХИВ-1 Енв и Ласса (ЛАСВ) показују многа места на којима доминира Ман9ГлцНАц2 (21-24).
Мешавина олигоманозе и комплексних гликана може се наћи на местима Н61, Н122, Н603, Н717, Н801 и Н1074 (слика 2). Од 22 места у С протеину, 8 садржи велики број гликана типа олигоманозе, што наглашава разлику између обраде САРС-ЦоВ-2 С гликана и гликопротеина домаћина (25). На преосталих 14 места доминирају обрађени комплексни типови гликана.
Иако су незаузета места гликозилације откривена на САРС-ЦоВ-2 С, утврђено је да представљају веома мали део укупне библиотеке пептида током квантификације (Табела С2). У студијама ХИВ-1 имуногена, показало се да су празнине које стварају незаузета места гликана имуногене и могу да изазову епитопе који ометају (26). Висока стопа попуњености Н-везане гликанске секвенце САРС-ЦоВ-2 С указује на то да рекомбинантни имуноген неће захтевати даљу оптимизацију да би се повећала заузетост места.
Користећи замрзнуту ЕМ структуру тримерног САРС-ЦоВ-2 С протеина [Протеин Датабасе (ПДБ) ИД 6ВСБ] (4), стање гликозилације имитације корона вируса је мапирано у експериментално утврђену тродимензионалну (3Д) структуру ( Слика 3). Комбинација масене спектрометрије и нискотемпературне ЕМ анализе открила је како Н-повезани гликани заробљавају различите области на целој површини шиљка САРС-ЦоВ-2.
Модел репрезентативних гликана на структури пре фузије тримерног САРС-ЦоВ-2 С гликопротеина (ПДБ ИД 6ВСБ) (4), где је један РБД у конформацији „горе“, а друга два РБД у „смеру“. Доле” конформација. Гликани су обојени у складу са садржајем олигоманозе дефинисаним везом. Место везивања АЦЕ2 рецептора је истакнуто светло плавом бојом. С1 и С2 подјединице су представљене полупрозирним површинама, респективно, нацртаним светло и тамно сивом бојом. Флексибилне петље у којима се налазе гликанска места Н74 и Н149 су представљене сивим испрекиданим линијама, а места гликана на петљама су мапирана у њиховим приближним регионима.
Може се приметити да је место везивања рецептора на САРС-ЦоВ-2 шиљку заштићено проксималним местима гликозилације (Н165, Н234, Н343), посебно када је домен везивања рецептора у конформацији „доле“. Као што је примећено код САРС-ЦоВ-1 С (10, 13), ХИВ-1 Енв (27), хемаглутинина грипа (28, 29) и ЛАСВ ГПЦ, заштита места везивања рецептора помоћу гликана То је уобичајена карактеристика вирусних гликопротеина . (двадесет четири). Узимајући у обзир функционална ограничења места везивања рецептора и ниску стопу мутације ових остатака, може постојати селективни притисак да се користе Н-повезани гликани да би се камуфлирао један од најсачуванијих и потенцијално рањивих региона њихових одговарајућих гликопротеина (30, 31).
Приметили смо дисперзију гликана типа олигоманозе на С1 и С2 подјединицама. Ово је у супротности са другим вирусним гликопротеинима. На пример, густи кластери гликана у неколико сојева ХИВ-1 Енв могу индуковати гликане типа олигоманозе које препознају антитела (32, 33). Код САРС-ЦоВ-2 С, структура олигоманозе ће вероватно бити заштићена протеинским компонентама, као што су Н234 гликани (делимично у сендвичу између Н-терминуса и домена за везивање рецептора) (Слика 3).
Карактерисали смо Н-повезане гликане на проширеним структурама флексибилне петље (Н74 и Н149) и проксималном Ц-терминусу мембране (Н1158, Н1173, Н1194), а ови молекули су били нераздвојени на цриоЕМ сликама (4). Они су идентификовани као сложени гликани, у складу са просторном доступношћу ових остатака.
Иако је садржај олигоманозних гликана (28%) (Табела С2) већи од оног на типичним гликопротеинима домаћина, он је нижи од осталих вирусних гликопротеина. На пример, један од најгушће гликозилованих вирусних шиљастих протеина је ХИВ-1 Енв, који показује ~60% гликана типа олигоманозе (21, 34). Ово указује да је у поређењу са другим вирусним гликопротеинима (укључујући ХИВ-1 Енв и ЛАСВ ГПЦ), гликозилација САРС-ЦоВ-2 С протеина слабија, а формирање гликана је мање заштићено, што може бити корисно за покретање неутрализујућих антитела. .
Поред тога, обрада комплексних гликана је важно разматрање у имуногеном инжењерингу, посебно имајући у виду да епитоп неутрализирајућег антитела против САРС-ЦоВ-2 С може да садржи фукозиловане гликане на Н343 (35). Међу 22 Н-везана места гликозилације, 52% фукозилације и 15% гликана садржало је најмање један остатак сијалинске киселине (Табела С2 и Слика С3). Наша анализа је показала да је Н343 високо фукозилиран са 98% тест гликана са остацима фукозе. Коришћени систем ћелијске експресије ће бити озбиљно погођен модификацијом гликана. Раније смо показали за ХИВ-1 Енв гликозилацију да обраду комплексних гликана покрећу производне ћелије, али ниво олигоманозних гликана је у великој мери независан од система експресије и повезан је са структуром протеина. Уско повезано са густином гликана (36).
Као што је примећено на ЛАСВ ГПЦ и ХИВ-1 Енв, гликански штит високе густине има такозване кластере манозе (22, 24) на површини протеина (Слика 4). Иако су мали кластери типа манозе пронађени на подјединици С1 блискоисточног респираторног синдрома (МЕРС)-ЦоВ С (10), овај феномен није примећен код САРС-ЦоВ-1 или САРС-ЦоВ-2 С протеина. Анализа гликозилације специфичне за локацију која је овде објављена показује да је гликански штит САРС-ЦоВ-2 С у складу са другим коронавирусима, а цео гликански штит такође показује многе рањивости (10) . Коначно, открили смо количине у траговима О-везане гликозилације на Тхр323/Сер325 (Т323/С325), где је више од 99% места било неизмењено (слика С4), што указује на то када је структура слична природној.
С лева на десно су МЕРС-ЦоВ С (10), САРС-ЦоВ-1 С (10), САРС-ЦоВ-2 С, ЛАСВ ГПЦ (24) и ХИВ-1 Енв (8, 21). Квантификација Н-везане гликан олигоманозе специфичне за локацију је обојена према кључним речима. Осим ЛАСВ ГПЦ, сви гликопротеини се експримирају као растворљиви тримери у ћелијама ХЕК 293Ф, док је ЛАСВ ГПЦ изведен из вируса сличних честица Мадин-Дарби псећих ћелија ИИ бубрега.
Наша анализа гликозилације САРС-ЦоВ-2 пружа детаљна мерила за карактеристике гликана специфичне за локацију карактеристичне за природно савијене тример шиљке. Са развојем све више и више кандидатских вакцина заснованих на гликопротеинима, детаљна анализа гликана пружа начин да се упореди интегритет имуногена, а како се производне скале шире на клиничку употребу, праћење ће такође бити веома важно. Стога ће у производњи серолошких тестова анализа профила гликана такође бити важан показатељ квалитета антигена. Коначно, са појавом вакцина заснованих на нуклеотидима, важно је разумети како ови механизми испоруке утичу на обраду и презентацију имуногена.
Ово је чланак отвореног приступа који се дистрибуира под условима лиценце Цреативе Цоммонс Аттрибутион. Чланак дозвољава неограничену употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медију под условом да је оригинално дело правилно цитирано.
Напомена: Од вас тражимо само да наведете своју адресу е-поште како би особа коју препоручите на страници знала да желите да види е-пошту и да није нежељена пошта. Нећемо ухватити ниједну адресу е-поште.
Ово питање се користи за тестирање да ли сте посетилац и спречавање аутоматског слања нежељене поште.
Анализа масене спектрометрије открила је састав гликана свих места гликозилације на протеину САРС-ЦоВ-2.
Анализа масене спектрометрије открила је састав гликана свих места гликозилације на протеину САРС-ЦоВ-2.
©2021 Америчко удружење за унапређење науке. Сва права задржана. АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР.Сциенце ИССН 1095-9203.