Devlopman vaksen pou sendwòm respiratwa egi grav kowonaviris 2 (SARS-CoV-2) konsantre sou pwoteyin Spike trimerik ki lakòz enfeksyon an. Chak protomer nan Spike trimerik la gen 22 sit glikozilasyon. Ki jan sit sa yo glikozile ka afekte ki selil viris la enfekte epi li ka pwoteje sèten epitop kont netralizasyon antikò. Watanabe tann. Trimer spike glycosylated recombinant te eksprime ak pirifye, proteolyzed pou pwodwi glycopeptides ki gen sèl glycans, ak konpozisyon sit glycan yo te detèmine pa espektrometri mas. Analiz sa a bay yon referans ki ka itilize pou mezire kalite antijèn lè w ap devlope vaksen ak tès antikò.
β-kowonaviris, aparisyon sendwòm respiratwa egi grav kowonaviris 2 (SARS-CoV-2) se ajan ki lakòz maladi kowonaviris 2019 la (COVID-19), ki reprezante yon gwo menas pou sante moun atravè lemond. Devlopman vaksen an konsantre sou sib prensipal repons iminitè umoral la, glikoprotein sinaptik (S), ki medyatè antre selilè ak fizyon manbràn. Chak jèn SARS-CoV-2 S kode 22 sekans glikozil ki lye N, ki ka jwe yon wòl nan plisman pwoteyin ak chape iminitè. Isit la, lè l sèvi avèk espektrometri mas espesifik sit, nou revele estrikti glikan sou iminojèn recombinant SARS-CoV-2 S la. Analiz sa a ka kat eta pwosesis glikan atravè pik viris trimerik la. Nou montre diferans ki genyen ant SARS-CoV-2 S glycan ak pwosesis tipik lame glycan, ki ka gen yon enpak sou patoloji viris ak konsepsyon vaksen an.
Sendwòm Respiratwa Aigu Grav Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) se patojèn ki lakòz (1, 2) Coronavirus 2019 (COVID-19), ki ka lakòz lafyèv, maladi respiratwa grav ak nemoni. SARS-CoV-2 sèvi ak yon pwoteyin pi gwo glikozile (S) ki soti nan sifas viris la pou l mare nan anzim konvèti anjyotansin 2 (ACE2) pou medyatè antre selil lame (3). Pwoteyin S se yon pwoteyin fizyon klas I trimerik, ki konpoze de de inite fonksyonèl, ki responsab pou lyezon reseptè (sousinite S1) ak fizyon manbràn (sousinite S2) (4, 5). Se sifas la nan klou a kouvwi sitou kontwole pa glycans lame-sòti, ak chak trimer montre 66 sit glycosylation N-lye. S pwoteyin se yon objektif kle nan travay konsepsyon vaksen (6). Konprann glycosylation nan Spikes viris recombinant ka revele karakteristik debaz yo nan byoloji viris ak gid estrateji konsepsyon vaksen (7, 8).
Glikozilasyon viral gen yon pakèt wòl nan patobioloji viral, ki gen ladan medyatè plisman pwoteyin ak estabilite ak mete twopim viral (9). Sit glikozilasyon yo anba presyon selektif paske yo ankouraje chape iminitè lè yo pwoteje epitop espesifik kont netralizasyon antikò. Sepandan, nou remake ke pousantaj mitasyon SARS-CoV-2 trè ba, e jiskaprezan, pa gen okenn mitasyon sit glikozilasyon ki lye N yo te obsève (10). Sifas ki gen dansite glikan anòmalman ka reyalize tou rekonesans iminitè (9, 11, 12). Pou lòt kowonaviris, yo te etidye wòl glikozilasyon nan kamouflaj epitop pwoteyin imunojèn (10, 13, 14). Coronavirus yo jèmen nan kavite retikul endoplasmik-Golgi pou fòme viriyon (15, 16). Sepandan, lè yo te obsève kalite konplèks nan glikan sou materyèl ki sòti nan viris, li te jwenn ke glikoprotein viral la te afekte pa anzim yo pwosesis ki abite nan Golgi (13, 17).
Gwo dansite glycan viral ak estrikti pwoteyin lokal yo afekte chemen spirasyon glikan an nan espasyal. Matirite nan glikan ki gen pwoblèm ki mennen nan prezans nan glycans oligomannose-kalite ka yon repòtè sansib nan estrikti pwoteyin natirèl (8), epi yo ka itilize analiz glikan espesifik nan sit yo konpare diferan iminojèn ak kontwole pwosesis pwodiksyon (18). Anplis de sa, glycosylation ka afekte transpò a nan imunojèn recombinant nan sant jèminal la (19).
Yo nan lòd yo rezoud glycosylation sit-espesifik nan pwoteyin SARS-CoV-2 S ak vizyalize distribisyon an nan glikoprotein sou sifas pwoteyin tout antye, nou eksprime ak pirifye twa aspè yo byolojik nan materyèl recombinant idrosolubl nan menm fason an jan yo itilize yo jwenn pwoteyin. . kopi. Estrikti mikwoskospi kriyo-elektron wo rezolisyon (kryo-EM), malgre mank de efè bloke pwosesis glycan nan kifennonine (4). Variant sa a nan pwoteyin S la gen tout 22 glikan sou pwoteyin SARS-CoV-2 S la (Figi 1A). Lè w itilize 2P mitasyon ki estab nan résidus 986 ak 987 (20), GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) sibstitisyon (résid 682 a 685) ak C nan sit la klivaj furin, se estrikti nan trimer pre-fusion reyalize nan estabilite. -Tèminal trimerization motif. Sa a ede kenbe estrikti kwatènè a pandan pwosesis glikan. Anvan analiz, yo te pirifye sipènatant ki gen SARS-CoV-2 S recombinant pa kwomatografi esklizyon gwosè pou asire ke se sèlman pwoteyin trimerik ki sanble ak natirèl yo te analize (Figi 1B ak Figi S1). Konfòmasyon trimer materyèl pirifye a te verifye lè l sèvi avèk tach negatif EM (Figi 1C).
(A) Dyagram chematik nan glikoprotein SARS-CoV-2 S. Pozisyon sekans glikozilasyon N-lye (NXS/T, kote X≠P) montre kòm yon branch (N, Asn; X, nenpòt rezidi; S, Ser; T, Thr; P, Pro). Dekri domèn pwoteyin: domèn N-tèminal (NTD), domèn obligatwa reseptè (RBD), peptide fizyon (FP), repete heptapeptide 1 (HR1), helix santral (CH), domèn konektè (CD) ) ak domèn transmembrane (TM) ). (B) SDS-poliakrilamid jèl elèktroforèz analiz nan SARS-CoV-2 S pwoteyin (ki endike pa flèch) eksprime nan selil 293F nan ren anbriyon imen (HEK). Liy 1: Supernatant filtre soti nan selil transfekte; Liy 2: Flow-through soti nan StrepTactin résine; Liy 3: Lave ak résine StrepTactin; Liy 4: Elisyon soti nan résine StrepTactin. (C) Valè mwayèn nan EM 2D negatif nan SARS-CoV-2 S pwoteyin. Yo montre valè mwayèn 2D nan pwoteyin SARS-CoV-2 S, ki konfime ke pwoteyin nan adopte yon konfòmasyon pre-fizyon trimer, ki matche ak materyèl yo itilize pou detèmine estrikti a (4).
Pou detèmine glycosylation sit espesifik SARS-CoV-2 S, nou te itilize tripsin, chimotripsin ak α-lytic proteaz pou jenere twa echantiyon glikopeptid. Yo chwazi proteaz sa yo pou pwodui glikopeptid ki gen yon sèl sekans glikan N-lye. Glycopeptides yo te analize pa likid chromatografi-spèktrometri mas, ak konpozisyon glikan nan tout 22 sit glycan ki lye N yo te detèmine (Figi 2). Yo nan lòd yo transmèt karakteristik pwosesis prensipal yo nan chak sit, dapre branch ak fucosylation, abondans la nan chak glycan klase nan kategori oligomannose, ibrid ak konplèks glycosylation. Tablo S1 ak Figi 6 bay opinyon detaye elaji ki montre divès konpozisyon glikan. S2.
Dyagram nan montre kòd koulè pou prensipal kalite glikan ki ka parèt sou wout spirasyon ki soti nan oligomannoz rive nan kalite ibrid glikan yo. Figi sa yo rezime analiz quantitative mas spectrométrie popilasyon glycan prezan nan yon sèl sit glycosylation N-lye, redwi a kategori glycan. Seri glycan kalite oligomannose (M9 rive M5; Man9GlcNAc2 rive Man5GlcNAc2) se vèt, ki pa glikozile ak fukozile glikan ibrid (ibrid ak ibrid F), liy pwentiye a woz, dapre kantite antèn Gwoupman konplèks glycan nwayo fucosylation ( A1 rive FA4) se woz nan prezans kondisyon yo. Pòs ki vid nan sit glikan ki lye ak N yo montre an gri. Tablo a rezime kantite glikan sa yo. Sit Glycan yo gen koulè selon kontni an nan glycans oligomannose-kalite, ak sit yo glycan yo make kòm vèt (80% a 100%), zoranj (30% a 79%) ak woz (0% a 29%). Ou ka jwenn yon vèsyon elaji analiz espesifik sit la ki montre eterojenite nan chak kategori nan Tablo S1 ak Figi 6. S2. Grafik ba a reprezante mwayèn twa replike byolojik, epi ba erè yo reprezante erè estanda mwayèn.
De sit yo sou SARS-CoV-2 S yo se sitou oligomannoz: N234 ak N709. Eksepte pou N234, estrikti prensipal oligomannoz glycan yo obsève nan pwoteyin antye a se Man5GlcNAc2 (Man, mannoz; GlcNAc, N-acetylglucosamine), ki endike ke sit sa yo ka lajman aksè α-1,2-mannosidase, men substra GlcNAcT. -1 se fèb, GlcNAcT-1 se anzim kle nan fòmasyon glikan eterozigòt ak konplèks nan aparèy Golgi a. Etap ki anpeche pwosesis la se yon karakteristik ki gen rapò ak dansite ak prezantasyon glikan sou Spikes viral yo. Pou egzanp, gwo glycosylation pik yo nan VIH-1 Env ak viris Lassa (LASV) GPC montre anpil sit domine pa Man9GlcNAc2 (21-24).
Ou ka jwenn yon melanj oligomannoz ak glikan konplèks nan sit N61, N122, N603, N717, N801 ak N1074 (Figi 2). Nan 22 sit yo nan pwoteyin S la, 8 genyen yon gwo kantite glycans oligomannose, ki mete aksan sou diferans ki genyen ant pwosesis SARS-CoV-2 S glycans ak glikoprotein lame a (25). Ki rete 14 sit yo domine pa kalite konplèks trete nan glikan.
Malgre ke sit glikozilasyon ki pa okipe yo te detekte sou SARS-CoV-2 S, yo te jwenn yo kont pou yon ti pati nan bibliyotèk total peptides la pandan quantifikasyon (Tablo S2). Nan etid iminojèn VIH-1, yo te montre vid yo ki te kreye pa sit glikan ki pa okipe yo dwe iminojenik epi yo ka lakòz epitop ki distrè (26). To lokatè segondè nan sekans glikan ki lye N nan SARS-CoV-2 S endike ke iminogen recombinant la pa pral bezwen plis optimize pou amelyore lokatè sit la.
Sèvi ak estrikti EM nan frizè nan pwoteyin trimerik SARS-CoV-2 S [Baz Pwoteyin (PDB) ID 6VSB] (4), yo te trase eta glikozilasyon nan imite spike coronavirus la nan estrikti tridimansyon (3D) ki te detèmine eksperimantal la ( Figi 3). Konbinezon an nan espektrometri mas ak analiz EM ba-tanperati te revele ki jan glikan ki gen N-lye pyèj diferan zòn sou tout sifas Spike SARS-CoV-2 la.
Modèl glycans reprezantan sou estrikti pre-fizyon trimeric SARS-CoV-2 S glikoprotein (PDB ID 6VSB) (4), kote yon RBD se nan konfòmasyon "moute", ak de lòt RBD yo nan "direksyon". Desann” konfòmasyon. Glycans yo gen koulè selon kontni oligomann yo defini nan kosyon an. Sit la obligatwa reseptè ACE2 make an ble limyè. Sou-inite S1 ak S2 yo reprezante pa sifas semi-transparan, respektivman, trase nan gri limyè ak nwa. Bouk fleksib kote sit glikan N74 ak N149 yo ye reprezante pa liy gri tirè yo, epi sit glikan sou bouk yo trase nan rejyon apwoksimatif yo.
Li ka obsève ke sit obligatwa reseptè a sou Spike SARS-CoV-2 pwoteje pa sit glikozilasyon proximal yo (N165, N234, N343), espesyalman lè domèn obligatwa reseptè a nan konformasyon "desann". Jan yo obsève nan SARS-CoV-1 S (10, 13), VIH-1 Env (27), grip hemagglutinin (28, 29) ak LASV GPC, pwoteksyon nan sit obligatwa reseptè pa glikan Li se yon karakteristik komen nan glikoprotein viral. . (vennkat). Lè ou konsidere limit fonksyonèl nan sit obligatwa reseptè a ak pousantaj mitasyon ki ba nan résidus sa yo, ka gen presyon selektif pou itilize glikan N-lye pou kamouflaj youn nan rejyon ki pi konsève ak potansyèlman vilnerab nan glikoprotein respektif yo (30, 31).
Nou remake dispèsyon nan glikan kalite oligomannoz sou subinite S1 ak S2 yo. Sa a se kontrèman ak lòt glikoprotein viral. Pou egzanp, grap glikan dans nan plizyè tansyon VIH-1 Env ka pwovoke glycans oligomannose ki rekonèt pa antikò (32, 33). Nan SARS-CoV-2 S, estrikti oligomannèz la gen anpil chans pou pwoteje pa eleman pwoteyin, tankou N234 glycans (pasyèlman sandwich ant N-tèminal la ak domèn obligatwa reseptè a) (Figi 3).
Nou karakterize glycans yo N-lye sou estrikti yo pwolonje bouk fleksib (N74 ak N149) ak proximal C-tèminal la nan manbràn nan (N1158, N1173, N1194), ak molekil sa yo pa te rezoud nan imaj yo cryoEM (4). Sa yo te idantifye kòm glikan konplèks, ki konsistan avèk aksè nan espasyal nan résidus sa yo.
Malgre ke kontni an nan glycans oligomannoz (28%) (Tablo S2) pi wo pase sa ki sou glikoprotein lame tipik, li pi ba pase lòt glikoprotein viral. Pou egzanp, youn nan pwoteyin Spike viral ki pi peple glikozile se HIV-1 Env, ki montre ~ 60% glikan ki kalite oligomannoz (21, 34). Sa a endike ke konpare ak lòt glikoprotein viral (ki gen ladan HIV-1 Env ak LASV GPC), glikozilasyon nan pwoteyin SARS-CoV-2 S pi fèb, ak fòmasyon nan glikan se mwens pwoteje, ki ka itil pou deklanche antikò netralize Itil. .
Anplis de sa, pwosesis la nan glikan konplèks se yon konsiderasyon enpòtan nan jeni iminojèn, espesyalman konsidere ke epitop la nan antikò netralize kont SARS-CoV-2 S ka gen ladan glikan fucosylated nan N343 (35). Pami 22 sit glycosylation N-lye yo, 52% nan fucosylation a ak 15% nan glikan yo te genyen omwen yon rezidi asid sialik (Tablo S2 ak Figi S3). Analiz nou an te montre ke N343 trè fucosylated pa 98% nan glycans tès yo ak résidus fucose. Modifikasyon nan glikan yo pral grav afekte pa sistèm ekspresyon selil yo itilize a. Nou te deja demontre pou glikozilasyon HIV-1 Env ke pwosesis la nan glikan konplèks kondwi pa selil pwodiksyon, men nivo a nan glikan oligomann se lajman endepandan de sistèm nan ekspresyon epi li gen rapò ak estrikti pwoteyin. Trè ki gen rapò ak dansite glikan (36).
Jan yo obsève sou LASV GPC ak HIV-1 Env, gwo dansite pwotèj glikan an gen sa yo rele grap mannoz (22, 24) sou sifas pwoteyin lan (Figi 4). Malgre ke ti gwoup mannoz yo te jwenn sou subunite S1 nan Sendwòm Respiratwa Mwayen Oryan (MERS)-CoV S (10), fenomèn sa a pa te obsève ak SARS-CoV-1 oswa SARS-CoV-2 S pwoteyin. Analiz glikozilasyon espesifik nan sit ki rapòte isit la montre ke plak pwotèj glikan SARS-CoV-2 S ki konsistan avèk lòt kowonaviris, e tout plak pwotèj glikan an montre tou anpil frajilite (10). Finalman, nou te detekte kantite tras nan O-lye glycosylation nan Thr323/Ser325 (T323/S325), kote plis pase 99% nan sit yo pa te modifye (Figi S4), ki endike ke lè estrikti a se natif natal-tankou.
De goch a dwat se MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) ak VIH-1 Env (8, 21). Kantifikasyon glycan oligomannose N ki lye nan sit espesifik la gen koulè dapre mo kle yo. Eksepte LASV GPC, tout glikoprotein yo eksprime kòm trimè idrosolubl nan selil HEK 293F, pandan y ap LASV GPC sòti nan patikil ki sanble ak viris nan selil Madin-Darby canine kidney II.
Analiz glikozilasyon nou an nan SARS-CoV-2 bay yon referans detaye pou karakteristik glycan espesifik nan sit la ki karakteristik Spikes trimer ki pliye natirèlman. Ak devlopman nan pi plis ak plis vaksen kandida ki baze sou glikoprotein, analiz detaye glikan bay yon fason yo konpare entegrite nan iminojèn, epi kòm echèl pwodiksyon elaji nan itilizasyon klinik, siveyans pral tou trè enpòtan. Se poutèt sa, nan fabrike nan twous tès serolojik, analiz pwofil glikan yo pral tou yon endikatè enpòtan nan bon jan kalite antijèn. Finalman, ak avenman vaksen ki baze sou nukleotid, li enpòtan pou konprann kijan mekanis livrezon sa yo afekte pwosesis ak prezantasyon iminojèn yo.
Sa a se yon atik aksè ouvè ki distribye dapre kondisyon Creative Commons Attribution License. Atik la pèmèt itilizasyon, distribisyon ak repwodiksyon san restriksyon nan nenpòt mwayen anba kondisyon ke travay orijinal la byen site.
Remak: Nou sèlman mande w bay adrès imel ou a pou moun ou rekòmande pou paj la konnen ke ou vle yo wè imel la e ke li pa spam. Nou p ap pran okenn adrès imel.
Kesyon sa a itilize pou teste si ou se yon vizitè epi anpeche otomatik soumèt spam.
Analiz espektometri mas revele konpozisyon glikan tout sit glikozilasyon sou pwoteyin Spike SARS-CoV-2 la.
Analiz espektometri mas revele konpozisyon glikan tout sit glikozilasyon sou pwoteyin Spike SARS-CoV-2 la.
©2021 Asosyasyon Ameriken pou Avansman Syans. tout dwa rezève. AAAS se yon patnè HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ak COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Tan poste: Jan-21-2021
