Impfung Entwécklung fir schwéier akut respiratoresch Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) huet sech op den trimeresche Spikeprotein konzentréiert deen d'Infektioun verursaacht. All Protomer an der trimerescher Spike huet 22 Glykosyléierungsplazen. Wéi dës Siten glycosyléiert sinn, kënne beaflossen wéi eng Zellen de Virus infizéiert a verschidde Epitope géint Antikörperneutraliséierung schützen. Watanabe gewaart. De rekombinant glycosyléierte Spike Trimer gouf ausgedréckt a gereinegt, proteolyséiert fir Glycopeptiden ze produzéieren déi eenzel Glykanen enthalen, an d'Zesummesetzung vu Glykansiten gouf duerch Massespektrometrie bestëmmt. Dës Analyse liwwert e Benchmark dee ka benotzt ginn fir d'Antigenqualitéit ze moossen wann Dir Impfungen an Antikörpertester entwéckelt.
β-Coronavirus, d'Entstoe vu schwéieren akuten respiratoresche Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ass den causative Agent vun der 2019 Coronavirus Krankheet (COVID-19), déi eng grouss Bedrohung fir d'mënschlech Gesondheet weltwäit ausstellt. Impfungentwécklung huet sech op d'Haaptziel vun der humoraler Immunantwort konzentréiert, de synaptesche (S) Glykoprotein, deen Zellentrée a Membranfusioun vermëttelt. All SARS-CoV-2 S Gen codéiert 22 N-verbonne Glycosyl Sequenzen, déi eng Roll bei Proteinfolding an Immun Flucht kënne spillen. Hei, mat Site-spezifescher Massespektrometrie, hu mir d'Glykanstruktur um rekombinante SARS-CoV-2 S Immunogen opgedeckt. Dës Analyse kann de Glykanveraarbechtungszoustand iwwer den trimeresche Viruspeak kartéieren. Mir weisen den Ënnerscheed tëscht SARS-CoV-2 S Glykan an typesch Host Glykan Veraarbechtung, wat en Impakt op Viruspathologie an Impfungdesign kann hunn.
Sever Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ass den causative Pathogen (1, 2) vum Coronavirus 2019 (COVID-19), wat Féiwer, schwéier Atmungskrankheeten a Longenentzündung verursaache kann. SARS-CoV-2 benotzt e wäit glycosyléierten Spike (S) Protein deen aus der Uewerfläch vum Virus erausstécht fir un Angiotensin konvertéierend Enzym 2 (ACE2) ze binden fir Hostzellentrée ze vermëttelen (3). S Protein ass en trimeresche Klass I Fusiounsprotein, besteet aus zwee funktionnelle Ënnerunitéiten, verantwortlech fir Rezeptorbindung (S1 Ënnerunitéit) a Membranfusioun (S2 Ënnerunitéit) (4, 5). D'Uewerfläch vum Beschichtete Nagel gëtt haaptsächlech vun Host-ofgeleet Glykanen kontrolléiert, an all Trimer weist 66 N-verbonne Glykosyléierungsplazen. S Protein ass e Schlësselziel bei der Impfungsdesignaarbecht (6). D'Glykosylatioun vu rekombinante Virusspikes ze verstoen kann d'Basiseigenschaften vun der Virusbiologie opdecken an Impfstoffdesignstrategien guidéieren (7, 8).
Viral Glykosylatioun huet eng breet Palette vu Rollen an der viraler Pathobiologie, dorënner d'Mediatioun vu Proteinfolden a Stabilitéit a Form vum virale Tropismus (9). Glykosylatiounsplaze sinn ënner selektiven Drock well se d'Immunflücht förderen andeems se spezifesch Epitope vun Antikörperneutraliséierung schützen. Wéi och ëmmer, mir hu gemierkt datt d'Mutatiounsquote vu SARS-CoV-2 ganz niddereg ass, a bis elo gouf keng N-verbonne Glykosylatiounsplaz Mutatioun observéiert (10). Surfaces mat anormal héich Dicht vu Glykanen kënnen och Immunerkennung erreechen (9, 11, 12). Fir aner Coronavirussen ass d'Roll vun der Glykosylatioun bei der Tarnung vun immunogene Proteinepitopen studéiert (10, 13, 14). Coronaviruses germinéieren an den endoplasmatesche Retikulum-Golgi Huelraim fir Virionen ze bilden (15, 16). Wéi och ëmmer, wann komplex Aarte vu Glykanen op Virus-ofgeleet Materialien observéiert goufen, gouf festgestallt datt de virale Glykoprotein vun de Veraarbechtungsenzyme beaflosst gouf, déi zu Golgi wunnen (13, 17).
Héich viral Glykan Dicht a lokal Proteinstruktur behënneren raimlech de Glykan Reifungswee. Déi behënnert Glykan Reifung, déi zu der Präsenz vun Oligomannose-Typ Glykanen féiert, kann e sensiblen Reporter vun der natierlecher Proteinstruktur sinn (8), a Sitespezifesch Glykananalyse kann benotzt ginn fir verschidde Immunogenen ze vergläichen an d'Produktiounsprozesser ze iwwerwaachen (18). Zousätzlech kann d'Glykosyléierung den Transport vu rekombinanten Immunogen an de Keimzentrum beaflossen (19).
Fir déi Site-spezifesch Glykosyléierung vum SARS-CoV-2 S Protein ze léisen an d'Verdeelung vu Glykoproteine op der ganzer Proteinoberfläche ze visualiséieren, hu mir déi dräi biologesch Aspekter vu rekombinant soluble Materialien ausgedréckt a gereinegt op déiselwecht Manéier wéi benotzt fir Proteinen ze kréien . replica. Héichopléisende Kryo-Elektronmikroskopie (Cryo-EM) Struktur, trotz dem Mangel u Glykanveraarbechtung blockéierend Effekt vu Kifennonin (4). Dës Variant vum S Protein enthält all 22 Glykanen um SARS-CoV-2 S Protein (Figur 1A). Andeems Dir 2P stabile Mutatiounen vu Reschter 986 an 987 (20), GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) Substitutioun (Reste 682 bis 685) a C op der Furin Spaltplaz benotzt, gëtt d'Trimer Pre-Fusiounsstruktur vun Stabilitéit realiséiert. -Terminal trimerization Motiv. Dëst hëlleft der quaternärer Struktur während der Glykanveraarbechtung z'erhalen. Virun der Analyse gouf de Supernatant mat rekombinant SARS-CoV-2 S duerch Gréisst Ausgrenzungschromatographie gereinegt fir sécherzestellen datt nëmmen natierlech-ähnlech trimeresch Proteine analyséiert goufen (Dorënner 1B a Figur S1). D'trimer conformation vun der gereinegt Material war vun benotzt negativ staining EM verifizéiert (Dorënner 1C).
(A) Schematesch Diagramm vum SARS-CoV-2 S Glycoprotein. D'Positioun vun der N-verbonne Glykosyléierungssequenz (NXS/T, wou X≠P) gëtt als Branche gewisen (N, Asn; X, all Rescht; S, Ser; T, Thr; P, Pro). Beschreift Protein Domainen: N-terminal Domain (NTD), receptor binding domain (RBD), Fusion peptide (FP), heptapeptide repeat 1 (HR1), central helix (CH), connector domain (CD) ) and transmembrane domain (TM) ). (B) SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese Analyse vum SARS-CoV-2 S Protein (mat Pfeil uginn) ausgedréckt a mënschlech embryonal Nier (HEK) 293F Zellen. Lane 1: Supernatant aus transfektéierten Zellen gefiltert; Lane 2: Flow-through aus StrepTactin resin; Lane 3: Wäschen mat StrepTactin resin; Lane 4: Elutioun aus StrepTactin resin. (C) Mëttelwäert vun EM 2D negativ vum SARS-CoV-2 S Protein. Den 2D Duerchschnëttswäert vum SARS-CoV-2 S Protein gëtt gewisen, wat bestätegt datt de Protein eng Trimer Pre-Fusioun Konformatioun adoptéiert, déi mam Material entsprécht fir d'Struktur ze bestëmmen (4).
Fir déi sitespezifesch Glykosylatioun vu SARS-CoV-2 S ze bestëmmen, hu mir Trypsin, Chymotrypsin an α-lytesch Protease benotzt fir dräi Glycopeptid Proben ze generéieren. Dës Proteasen ginn ausgewielt fir Glycopeptide ze produzéieren déi eng eenzeg N-verbonne Glykan Sequenz enthalen. D'glycopeptides sech duerch flësseg chromatography-Mass spectrometry analyséiert, an der glycan Zesummesetzung vun all 22 N-verbonne glycan Siten war bestëmmt (Dorënner 2). Fir d'Haaptveraarbechtungseigenschaften vun all Site ze vermëttelen, no der Verzweigung an der Fucosylatioun, gëtt d'Heefegkeet vun all Glykan an Oligomannose, Hybrid a komplex Glykosyléierungskategorien klasséiert. Table S1 an Figur 6 ginn detailléiert erweidert Meenung déi verschidde glycan Kompositioune weisen. S2.
D'Diagramm illustréiert d'Faarfcodes fir d'Haaptaarte vu Glykanen, déi laanscht de Reifungswee vun Oligomannose bis Hybridaarte vu Glykanen optrieden kënnen. Dës Zuele resüméieren d'quantitativ Massespektrometrieanalyse vun der Glykan Bevëlkerung präsent op enger eenzeger N-verbonne Glykosylatiounsplaz, reduzéiert op d'Glykankategorie. D'Oligomannose-Typ Glykan-Serie (M9 bis M5; Man9GlcNAc2 bis Man5GlcNAc2) si gréng, net-glycosyléiert a fucosyléiert Hybridglycanen (Hybrid a F Hybrid), déi gestippte Linn ass rosa, no der Unzuel vun den Antennen. A1 bis FA4) ass rosa a Präsenz vu Konditiounen. Vakanzen op N-verbonne Glykan Siten ginn a gro gewisen. D'Paartdiagramm resüméiert d'Quantifikatioun vun dëse Glykanen. Glycan Siten si faarweg no dem Inhalt vun den Oligomannose-Typ Glykanen, an d'Glykanplaze si gréng (80% bis 100%), orange (30% bis 79%) a rosa (0% bis 29%). Eng erweidert Versioun vun der Site-spezifesch Analyse weist der heterogeneity bannent all Kategorie kann an Table S1 an Dorënner fonnt ginn 6. S2. D'Bar Grafik representéiert den Duerchschnëtt vun dräi biologesche Replikate, an d'Fehlerbars representéieren de Standardfehler vum Duerchschnëtt.
Déi zwee Siten op SARS-CoV-2 S sinn haaptsächlech Oligomannose: N234 an N709. Ausser N234 ass d'Haapt Oligomannose Glykan Struktur, déi am ganze Protein observéiert gëtt, Man5GlcNAc2 (Mann, Mannose; GlcNAc, N-Acetylglucosamin), wat beweist datt dës Site gréisstendeels α-1,2-mannosidase Zougang kënne sinn, awer de Substrat vu GlcNAcT -1 ass schwaach, GlcNAcT-1 ass de Schlësselenzym bei der Bildung vun heterozygoten a komplexe Glykanen am Golgi Apparat. D'Bühn déi d'Veraarbechtung behënnert ass eng Charakteristik am Zesummenhang mat der Dicht an der Presentatioun vu Glykanen op de virale Spikes. Zum Beispill weisen déi héich Glykosyléierungspeaks vum HIV-1 Env a Lassa Virus (LASV) GPC vill Siten dominéiert vum Man9GlcNAc2 (21-24).
Eng Mëschung aus oligomannose a komplex glycans kann op Siten fonnt ginn N61, N122, N603, N717, N801 an N1074 (Dorënner 2). Vun den 22 Siten am S Protein enthalen 8 eng grouss Zuel vun Oligomannose-Typ Glykanen, wat den Ënnerscheed tëscht der Veraarbechtung vu SARS-CoV-2 S Glykanen an dem Host Glykoprotein beliicht (25). Déi reschtlech 14 Site si vu veraarbechte komplexe Typen vu Glykanen dominéiert.
Och wa onbesat Glykosyléierungsplazen op SARS-CoV-2 S festgestallt goufen, goufe fonnt datt se e ganz klengen Deel vun der Gesamt Peptidbibliothéik wärend der Quantifikatioun ausmaachen (Table S2). An HIV-1 Immunogenstudien sinn d'Voiden, déi duerch onbesat Glykanplazen erstallt goufen, als immunogen gewise ginn a kënnen distractéierend Epitope verursaachen (26). Déi héich Besetzungsquote vun der N-verbonne Glykan Sequenz vu SARS-CoV-2 S weist datt de rekombinante Immunogen keng weider Optimisatioun erfuerdert fir d'Besetzung vum Site ze verbesseren.
Mat der gefruerter EM Struktur vum trimeresche SARS-CoV-2 S Protein [Protein Database (PDB) ID 6VSB] (4), gouf de Glykosylatiounszoustand vun der Coronavirus Spike Mimik op déi experimentell bestëmmten dreidimensional (3D) Struktur (3D) gekaart. Bild 3). D'Kombinatioun vu Massespektrometrie a Low-Temperatur EM Analyse huet opgedeckt wéi N-verbonne Glykane verschidde Gebidder op der ganzer Uewerfläch vun der SARS-CoV-2 Spike falen.
Modell representativ Glykanen op der Pre-Fusiounsstruktur vum trimeresche SARS-CoV-2 S Glykoprotein (PDB ID 6VSB) (4), wou een RBD an der "up" Konformatioun ass, an déi aner zwee RBDs sinn an der "Richtung". Down" Konformatioun. D'Glykane si faarweg no dem Oligomannosegehalt definéiert vun der Bindung. Den ACE2 Rezeptor Bindungsplaz ass hellblo markéiert. D'S1 a S2 Ënnerunitéiten ginn duerch semi-transparent Flächen duergestallt, respektiv, an hell an donkelgrau gezeechent. Déi flexibel Schleifen, wou d'N74- an N149-Glykan-Site lokaliséiert sinn, ginn duerch gro gestreckte Linnen duergestallt, an d'Glykanplazen op de Schleifen sinn an hire geschätzte Regiounen kartéiert.
Et kann beobachtet ginn datt de Rezeptor Bindungsplaz op der SARS-CoV-2 Spike geschützt ass vun de proximale Glykosyléierungsplazen (N165, N234, N343), besonnesch wann de Rezeptor bindend Domain an der "down" Konformatioun ass. Wéi observéiert an SARS-CoV-1 S (10, 13), HIV-1 Env (27), Influenza Hämagglutinin (28, 29) an LASV GPC, d'Schirmung vun Rezeptor Bindungsplaze vu Glykanen Et ass eng gemeinsam Feature vu virale Glykoproteine . (véieranzwanzeg). Bedenkt déi funktionell Aschränkungen vun der Rezeptor Bindungsplaz an der niddereger Mutatiounsquote vun dëse Reschter, et kann e selektiven Drock ginn fir N-verbonne Glykanen ze benotzen fir eng vun de meescht konservéiert a potenziell vulnérabel Regiounen vun hire jeweilege Glycoproteine ze camoufléiren (30, 31).
Mir gemierkt d'Dispersioun vun oligomannose-Typ glycans op der S1 an S2 subunits. Dëst ass am Géigesaz zu anere virale Glykoproteine. Zum Beispill, dichte Glykancluster a verschiddenen HIV-1 Env Stämme kënnen Oligomannose-Typ Glykanen induzéieren, déi duerch Antikörper unerkannt ginn (32, 33). Am SARS-CoV-2 S ass d'Oligomannosestruktur méiglecherweis duerch Proteinkomponenten geschützt, sou wéi N234 Glykanen (deelweis sandwichéiert tëscht dem N-Terminus an dem Rezeptor bindend Domain) (Figur 3).
Mir charakteriséiert d'N-verbonne Glykanen op de verlängerten flexibelen Schleifstrukturen (N74 an N149) an de proximalen C-Enn vun der Membran (N1158, N1173, N1194), an dës Moleküle goufen an de CryoEM Biller (4) ongeléist. Dës goufen als komplex Glykanen identifizéiert, konsequent mat der raimlecher Accessibilitéit vun dëse Reschter.
Och wann den Inhalt vun Oligomannose-Glykanen (28%) (Tabelle S2) méi héich ass wéi deen op typesch Host-Glykoproteine, ass et manner wéi aner viral Glykoproteine. Zum Beispill, ee vun den dichtst glycosyléierte virale Spikeproteine ass HIV-1 Env, déi ~ 60% Oligomannose-Typ Glykanen weist (21, 34). Dëst weist datt am Verglach mat anere virale Glykoproteine (inklusiv HIV-1 Env an LASV GPC), d'Glykosyléierung vum SARS-CoV-2 S Protein méi schwaach ass, an d'Bildung vu Glykanen ass manner geschützt, wat nëtzlech ka sinn fir neutraliséierend Antikörper auszeléisen. .
Zousätzlech ass d'Veraarbechtung vu komplexe Glykanen eng wichteg Iwwerleeung an der Immunogentechnik, besonnesch bedenkt datt d'Epitop vum neutraliséierende Antikörper géint SARS-CoV-2 S fucosyléiert Glykane bei N343 enthalen kann (35). Ënnert den 22 N-verbonne Glykosyléierungsplazen, 52% vun der Fucosylatioun an 15% vun de Glykanen enthalen op d'mannst ee Sialinsäurereschter (Table S2 an Figur S3). Eis Analyse huet gewisen datt N343 héich fucosyléiert ass vun 98% vun den Testglycanen mat Fucose Reschter. D'Modifikatioun vu Glykanen gëtt staark vum benotzte Zellausdrocksystem beaflosst. Mir hu virdru fir HIV-1 Env Glycosylatioun bewisen datt d'Veraarbechtung vu komplexe Glykanen duerch Produktiounszellen gedriwwe gëtt, awer den Niveau vun Oligomannose Glykanen ass gréisstendeels onofhängeg vum Ausdrocksystem an ass mat der Proteinstruktur verbonnen. Eng Zesummenhang mat Glykan Dicht (36).
Wéi op LASV GPC an HIV-1 Env observéiert, huet d'High-Dicht Glycan Schëld sougenannte Mannosecluster (22, 24) op der Protein Uewerfläch (Dorënner 4). Och wa kleng Mannose-Typ Stärekéip op der S1 Ënnerunitéit vum Mëttleren Osten Atmungssyndrom (MERS)-CoV S (10) fonnt goufen, gouf dëst Phänomen net mat SARS-CoV-1 oder SARS-CoV-2 S Proteinen observéiert. Déi Site-spezifesch Glykosyléierungsanalyse, déi hei gemellt gëtt, weist datt de SARS-CoV-2 S Glykan Schëld konsequent mat anere Coronavirussen ass, an de ganze Glykan Schëld weist och vill Schwachstelle (10). Endlech hu mir Spuermengen vun O-verbonne Glycosylatioun bei Thr323 /Ser325 (T323 /S325) festgestallt, wou méi wéi 99% vun de Site onverännert waren (Dorënner S4), wat beweist datt wann d'Struktur gebierteg-ähnlech ass.
Vu lénks no riets si MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) an HIV-1 Env (8, 21). Déi Site-spezifesch N-verbonne Glykan Oligomannose Quantifikatioun ass faarweg no Schlësselwieder. Ausser LASV GPC, ginn all Glykoproteine als soluble Trimer an HEK 293F Zellen ausgedréckt, während LASV GPC aus virusähnleche Partikele vu Madin-Darby Hënn Nier II Zellen ofgeleet ass.
Eis Glykosylatiounsanalyse vu SARS-CoV-2 liwwert en detailléierte Benchmark fir déi Sitespezifesch Glykan Charakteristiken charakteristesch fir natierlech geklappt Trimer Spikes. Mat der Entwécklung vu méi a méi Kandidat Impfungen baséiert op Glykoproteine, bitt detailléiert Glykan Analyse e Wee fir d'Integritéit vun Immunogenen ze vergläichen, a wéi d'Produktiounsskala op klinesch Notzung erweidert, wäert d'Iwwerwaachung och ganz wichteg sinn. Dofir, bei der Fabrikatioun vu serologeschen Testkits, wäert d'Glykanprofilanalyse och e wichtege Indikator vun der Antigenqualitéit sinn. Schlussendlech, mam Advent vun Nukleotid-baséiert Impfungen, ass et wichteg ze verstoen wéi dës Liwwerungsmechanismen d'Veraarbechtung an d'Presentatioun vun Immunogenen beaflossen.
Dëst ass en Open Access Artikel verdeelt ënner de Bedéngungen vun der Creative Commons Attribution License. Den Artikel erlaabt onbeschränkt Notzung, Verdeelung a Reproduktioun an all Medium ënner der Bedingung datt d'Original Wierk richteg zitéiert ass.
Bemierkung: Mir froen Iech nëmmen Är E-Mailadress unzeginn, sou datt déi Persoun déi Dir op d'Säit recommandéiert weess datt Dir wëllt datt se d'E-Mail gesinn an datt et kee Spam ass. Mir wäerten keng E-Mail Adressen erfaassen.
Dës Fro gëtt benotzt fir ze testen ob Dir e Besucher sidd an automatesch Spam Soumissioun ze verhënneren.
Massespektrometrieanalyse huet d'Glykan Zesummesetzung vun alle Glykosyléierungsplazen um SARS-CoV-2 Spikeprotein opgedeckt.
Massespektrometrieanalyse huet d'Glykan Zesummesetzung vun alle Glykosyléierungsplazen um SARS-CoV-2 Spikeprotein opgedeckt.
©2021 American Association for the Advancement of Science. all Rechter reservéiert. AAAS ass e Partner vun HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Post Zäit: Jan-21-2021
