Şiddətli kəskin respirator sindromlu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) üçün peyvəndin inkişafı infeksiyaya səbəb olan trimerik sünbül zülalına fokuslanıb. Trimerik sünbüldəki hər bir protomerdə 22 qlikozilləşmə sahəsi var. Bu saytların necə qlikozilləşdiyi virusun hansı hüceyrələrə yoluxmasına təsir edə bilər və müəyyən epitopları antikorların neytrallaşdırılmasından qoruya bilər. Vatanabe gözlədi. Rekombinant qlikosilləşdirilmiş sünbül trimeri ekspressiya edilmiş və təmizlənmiş, tək qlikanlar olan qlikopeptidlər istehsal etmək üçün proteolizə edilmiş və qlikan sahələrinin tərkibi kütləvi spektrometriya ilə müəyyən edilmişdir. Bu analiz vaksinlər və antikor testləri hazırlayarkən antigen keyfiyyətini ölçmək üçün istifadə edilə bilən bir meyar təqdim edir.
β-koronavirus, kəskin kəskin respirator sindromun ortaya çıxması coronavirus 2 (SARS-CoV-2) 2019-cu il koronavirus xəstəliyinin (COVID-19) törədicisi olmaqla bütün dünyada insan sağlamlığı üçün böyük təhlükə yaradır. Peyvəndin inkişafı humoral immun cavabın əsas hədəfinə, hüceyrə girişinə və membranın birləşməsinə vasitəçilik edən sinaptik (S) qlikoproteinə yönəlmişdir. Hər bir SARS-CoV-2 S geni zülalın qatlanmasında və immunitetdən qaçmada rol oynaya bilən 22 N ilə əlaqəli qlikosil ardıcıllığını kodlayır. Burada, sahəyə məxsus kütləvi spektrometriyadan istifadə edərək, rekombinant SARS-CoV-2 S immunogenində qlikan strukturunu aşkar etdik. Bu analiz trimerik virus zirvəsi boyunca qlikan emal vəziyyətini xəritələyə bilər. Biz SARS-CoV-2 S qlikanı ilə virus patologiyasına və peyvəndin dizaynına təsir göstərə bilən tipik ev sahibi qlikan emalı arasındakı fərqi göstəririk.
Ağır Kəskin Tənəffüs Sindromu Koronavirus 2 (SARS-CoV-2) hərarət, ağır tənəffüs yolu xəstəlikləri və pnevmoniyaya səbəb ola bilən Koronavirus 2019-un (COVID-19) törədici patogenidir (1, 2). SARS-CoV-2 virusun səthindən çıxan geniş qlikosilləşdirilmiş sünbül (S) proteinindən istifadə edərək, angiotenzin çevirən ferment 2 (ACE2) ilə birləşərək ana hüceyrənin daxil olmasına vasitəçilik edir (3). S zülalı, reseptorların bağlanması (S1 alt bölməsi) və membran birləşməsindən (S2 alt vahidi) məsul olan iki funksional alt bölmədən ibarət olan trimerik sinif I füzyon proteinidir (4, 5). Kaplanmış dırnağın səthi əsasən ana mənşəli qlikanlar tərəfindən idarə olunur və hər trimer 66 N ilə əlaqəli qlikozilləşmə yerini göstərir. S proteini peyvəndin dizayn işində əsas məqsəddir (6). Rekombinant virus sünbüllərinin qlikozilləşməsinin başa düşülməsi virus biologiyasının əsas xüsusiyyətlərini aşkar edə və peyvənd dizayn strategiyalarına rəhbərlik edə bilər (7, 8).
Viral qlikozilləşmə, zülal qatlanması və sabitliyinə vasitəçilik etmək və viral tropizmi formalaşdırmaq daxil olmaqla, viral patobiologiyada geniş rol oynayır (9). Qlikozilləşmə sahələri selektiv təzyiq altındadır, çünki onlar xüsusi epitopları antikorların neytrallaşdırılmasından qoruyaraq immunitetdən qaçmağa kömək edirlər. Bununla belə, SARS-CoV-2-nin mutasiya nisbətinin çox aşağı olduğunu və indiyə qədər heç bir N-əlaqəli qlikozilləşmə sahəsinin mutasiyası müşahidə olunmadığını müşahidə etdik (10). Qlikanların qeyri-adi dərəcədə yüksək sıxlığı olan səthlər də immunitetin tanınmasına nail ola bilər (9, 11, 12). Digər koronaviruslar üçün immunogen zülal epitoplarının kamuflyaj edilməsində qlikozilləşmənin rolu öyrənilmişdir (10, 13, 14). Koronaviruslar endoplazmatik retikulum-Golgi boşluğuna cücərərək virionlar əmələ gətirir (15, 16). Bununla belə, virus mənşəli materiallarda qlikanların mürəkkəb növləri müşahidə edildikdə, virusun qlikoproteininin Golgidə yerləşən emal fermentlərinin təsirinə məruz qaldığı aşkar edilmişdir (13, 17).
Yüksək viral qlikan sıxlığı və yerli zülal strukturu qlikanın yetişmə yolunu məkan olaraq pozur. Oliqomannoz tipli qlikanların mövcudluğuna səbəb olan pozulmuş qlikan yetişməsi təbii zülal strukturunun həssas müxbiri ola bilər (8) və fərqli immunogenləri müqayisə etmək və istehsal proseslərinə nəzarət etmək üçün sahəyə xüsusi qlikan analizindən istifadə edilə bilər (18). Bundan əlavə, qlikozilləşmə rekombinant immunogenin germinal mərkəzə daşınmasına təsir göstərə bilər (19).
SARS-CoV-2 S zülalının sahəyə xas qlikosilasiyasını həll etmək və qlikoproteinlərin bütün zülal səthində paylanmasını vizuallaşdırmaq üçün biz rekombinant həll olunan materialların üç bioloji aspektini zülal əldə etmək üçün istifadə edilən üsulla ifadə etdik və təmizlədik. . replika. Kifennoninin qlikan emalını bloklayan təsirinin olmamasına baxmayaraq yüksək rezolyusiyaya malik krio-elektron mikroskopiya (kriyo-EM) quruluşu (4). S zülalının bu variantında SARS-CoV-2 S zülalındakı bütün 22 qlikan var (Şəkil 1A). Furin parçalanma yerində 986 və 987 (20) qalıqlarının 2P stabil mutasiyalarından, GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) əvəzlənməsi (qalıqlar 682-685) və C-dən istifadə etməklə, trimerin birləşmədən əvvəlki strukturu Stabillik əldə edilir. -Terminal trimerizasiya motivi. Bu, qlikan emalı zamanı dördüncü quruluşu saxlamağa kömək edir. Təhlildən əvvəl rekombinant SARS-CoV-2 S ehtiva edən supernatant yalnız təbii kimi trimerik zülalların təhlil edildiyinə əmin olmaq üçün ölçü istisna xromatoqrafiyası ilə təmizləndi (Şəkil 1B və Şəkil S1). Təmizlənmiş materialın trimer uyğunluğu mənfi boyanma EM istifadə edərək yoxlanıldı (Şəkil 1C).
(A) SARS-CoV-2 S qlikoproteinin sxematik diaqramı. N ilə əlaqəli qlikozilləşmə ardıcıllığının mövqeyi (NXS/T, burada X≠P) budaq kimi göstərilir (N, Asn; X, hər hansı qalıq; S, Ser; T, Thr; P, Pro). Zülal domenlərini təsvir edir: N-terminal domen (NTD), reseptor bağlayan sahə (RBD), birləşmə peptidi (FP), heptapeptid təkrarı 1 (HR1), mərkəzi spiral (CH), birləşdirici domen (CD) ) və transmembran domen (TM) ). (B) İnsan embrion böyrəyinin (HEK) 293F hüceyrələrində ifadə olunan SARS-CoV-2 S zülalının (oxla işarələnmiş) SDS-poliakrilamid gel elektroforez təhlili. Zolaq 1: Transfeksiya edilmiş hüceyrələrdən süzülmüş supernatant; Zolaq 2: StrepTactin qatranından axın; Zolaq 3: StrepTactin qatranı ilə yuyulma; Zolaq 4: StrepTactin qatranından elüsyon. (C) SARS-CoV-2 S zülalının EM 2D mənfi orta dəyəri. SARS-CoV-2 S zülalının 2D orta dəyəri göstərilir ki, bu da zülalın strukturu müəyyən etmək üçün istifadə olunan materiala uyğun gələn trimerin birləşmədən əvvəl uyğunlaşmasını qəbul etdiyini təsdiqləyir (4).
SARS-CoV-2 S-nin sahəyə məxsus qlikosilasiyasını müəyyən etmək üçün üç qlikopeptid nümunəsi yaratmaq üçün tripsin, kimotripsin və α-litik proteazdan istifadə etdik. Bu proteazlar tək N ilə əlaqəli qlikan ardıcıllığını ehtiva edən qlikopeptidlər istehsal etmək üçün seçilir. Qlikopeptidlər maye xromatoqrafiya-kütləvi spektrometriya ilə təhlil edildi və bütün 22 N ilə əlaqəli qlikan sahəsinin qlikan tərkibi müəyyən edildi (Şəkil 2). Hər bir sahənin əsas emal xüsusiyyətlərini çatdırmaq üçün budaqlanma və fukosilasiyaya görə, hər bir qlikanın bolluğu oliqomannoz, hibrid və mürəkkəb qlikozilləşmə kateqoriyalarına təsnif edilir. Cədvəl S1 və Şəkil 6 müxtəlif qlikan kompozisiyalarını göstərən ətraflı genişləndirilmiş görünüşləri verir. S2.
Diaqram oliqomannozdan hibrid qlikan növlərinə qədər yetişmə yolu boyunca görünə bilən qlikanların əsas növləri üçün rəng kodlarını təsvir edir. Bu rəqəmlər qlikan kateqoriyasına endirilmiş bir N-əlaqəli qlikozilləşmə yerində mövcud olan qlikan populyasiyasının kəmiyyət kütlə spektrometriya analizini ümumiləşdirir. Oliqomannoz tipli qlikan seriyası (M9-dan M5-ə qədər; Man9GlcNAc2-dən Man5GlcNAc2-ə qədər) yaşıl, qeyri-qlikosilləşmiş və fukosilləşdirilmiş hibrid qlikanlardır (hibrid və F hibrid), nöqtəli xətt antenaların sayına görə çəhrayı rəngdədir. A1-dən FA4) şərtlər olduqda çəhrayı olur. N-əlaqəli qlikan yerlərindəki vakansiyalar boz rəngdə göstərilir. Pasta diaqramı bu qlikanların miqdarını ümumiləşdirir. Qlikan yerləri oliqomannoz tipli qlikanların tərkibinə görə rənglənir və qlikan yerləri yaşıl (80% - 100%), narıncı (30% - 79%) və çəhrayı (0% - 29%) kimi qeyd olunur. Hər bir kateqoriya daxilində heterojenliyi göstərən sahə üçün xüsusi analizin genişləndirilmiş versiyası Cədvəl S1 və Şəkil 6-da tapıla bilər. S2. Ştrix qrafiki üç bioloji təkrarın ortasını, səhv çubuqları isə ortalamanın standart xətasını təmsil edir.
SARS-CoV-2 S-də iki sahə əsasən oliqomannozdur: N234 və N709. N234 istisna olmaqla, bütün zülalda müşahidə edilən əsas oliqomannoz qlikan strukturu Man5GlcNAc2-dir (Man, mannose; GlcNAc, N-asetilqlükozamin), bu saytların əsasən α-1,2-mannosidaza girişi ola biləcəyini, lakin GlcNAcT-nin substratı olduğunu göstərir. -1 zəifdir, GlcNAcT-1 Qolji aparatında heterozigot və mürəkkəb qlikanların əmələ gəlməsində əsas fermentdir. Emal prosesini maneə törədən mərhələ, viral sünbüllərdə qlikanların sıxlığı və təqdimatı ilə əlaqəli bir xüsusiyyətdir. Məsələn, HIV-1 Env və Lassa virusunun (LASV) GPC-nin yüksək qlikozilləşmə zirvələri Man9GlcNAc2 (21-24) tərəfindən üstünlük təşkil edən bir çox saytları göstərir.
Oliqomannoz və mürəkkəb qlikanların qarışığı N61, N122, N603, N717, N801 və N1074 sahələrində tapıla bilər (Şəkil 2). S zülalının 22 yerindən 8-də çoxlu sayda oliqomannoz tipli qlikanlar var ki, bu da SARS-CoV-2 S qlikanlarının işlənməsi ilə ev sahibi qlikoprotein arasındakı fərqi vurğulayır (25). Qalan 14 sahədə işlənmiş mürəkkəb qlikan növləri üstünlük təşkil edir.
SARS-CoV-2 S-də boş qlikozilləşmə sahələri aşkar edilsə də, kəmiyyətin təyini zamanı onların ümumi peptid kitabxanasının çox kiçik bir hissəsini təşkil etdiyi aşkar edilmişdir (Cədvəl S2). HİV-1 immunogen tədqiqatlarında, boş qlikan sahələrinin yaratdığı boşluqların immunogen olduğu və diqqəti yayındıran epitoplara səbəb ola biləcəyi göstərilmişdir (26). SARS-CoV-2 S-nin N-əlaqəli qlikan ardıcıllığının yüksək doluluq dərəcəsi onu göstərir ki, rekombinant immunogen saytın doluluğunu artırmaq üçün əlavə optimallaşdırma tələb etməyəcək.
Trimerik SARS-CoV-2 S zülalının [Protein Database (PDB) ID 6VSB] (4) dondurulmuş EM strukturundan istifadə edərək, koronavirus sünbül təqlidinin qlikosilasiya vəziyyəti eksperimental olaraq müəyyən edilmiş üçölçülü (3D) Struktura ( Şəkil 3). Kütləvi spektrometriya və aşağı temperaturlu EM analizinin birləşməsi N-ə bağlı qlikanların SARS-CoV-2 sünbülünün bütün səthində müxtəlif sahələri necə tutduğunu ortaya qoydu.
Trimerik SARS-CoV-2 S qlikoproteinin (PDB ID 6VSB) (4) bir RBD-nin “yuxarı” uyğunlaşmasında, digər iki RBD-nin isə “istiqamətdə” olduğu prefusion strukturunda model təmsil edən qlikanlar. Aşağı” uyğunluğu. Qlikanlar, əlaqə ilə müəyyən edilmiş oliqomannoz tərkibinə görə rənglənir. ACE2 reseptorunun bağlanma yeri açıq mavi rənglə vurğulanır. S1 və S2 alt bölmələri müvafiq olaraq açıq və tünd boz rənglərlə çəkilmiş yarı şəffaf səthlərlə təmsil olunur. N74 və N149 qlikan yerlərinin yerləşdiyi çevik döngələr boz kəsik-kəsik xətlərlə təmsil olunur və ilgəklərdəki qlikan sahələri onların təxmini bölgələrində xəritələnir.
Müşahidə edilə bilər ki, SARS-CoV-2 sünbülündəki reseptorun bağlanma sahəsi, xüsusən də reseptor bağlayan sahə “aşağı” uyğunlaşmada olduqda, proksimal qlikozilləşmə yerləri (N165, N234, N343) tərəfindən qorunur. SARS-CoV-1 S (10, 13), HIV-1 Env (27), qrip hemaqlütinin (28, 29) və LASV GPC-də müşahidə edildiyi kimi, reseptorların bağlanma yerlərinin qlikanlar tərəfindən mühafizəsi Bu, viral qlikoproteinlərin ümumi xüsusiyyətidir. . (iyirmi dörd). Reseptorların bağlanma yerinin funksional məhdudiyyətlərini və bu qalıqların aşağı mutasiya sürətini nəzərə alaraq, onların müvafiq qlikoproteinlərinin ən qorunan və potensial olaraq həssas bölgələrindən birini kamuflyaj etmək üçün N-əlaqəli qlikanlardan istifadə etmək üçün seçici təzyiq ola bilər (30, 31).
S1 və S2 subunitlərində oliqomannoz tipli qlikanların dispersiyasını müşahidə etdik. Bu, digər viral qlikoproteinlərdən fərqlidir. Məsələn, bir neçə HİV-1 Env ştamında sıx qlikan klasterləri antikorlar tərəfindən tanınan oliqomannoz tipli qlikanları induksiya edə bilər (32, 33). SARS-CoV-2 S-də oliqomannoz strukturunun N234 qlikanlar kimi zülal komponentləri (qismən N-terminus və reseptor bağlayan sahə arasında sıxışdırılmış) tərəfindən qorunacağı ehtimal edilir (Şəkil 3).
Uzatılmış çevik döngə strukturlarında (N74 və N149) və membranın proksimal C-terminusunda (N1158, N1173, N1194) N ilə əlaqəli qlikanları xarakterizə etdik və bu molekullar cryoEM şəkillərində həll edilmədi (4). Bunlar, bu qalıqların məkan əlçatanlığına uyğun olaraq mürəkkəb qlikanlar kimi müəyyən edilmişdir.
Oliqomannoz qlikanların tərkibi (28%) (Cədvəl S2) tipik ev sahibi qlikoproteinlərdən yüksək olsa da, digər viral qlikoproteinlərdən aşağıdır. Məsələn, ən sıx qlikosillənmiş viral sünbül zülallarından biri ~60% oliqomannoz tipli qlikanlar nümayiş etdirən HIV-1 Env-dir (21, 34). Bu onu göstərir ki, digər viral qlikoproteinlərlə (o cümlədən HIV-1 Env və LASV GPC) SARS-CoV-2 S zülalının qlikosilasiyası daha zəifdir və qlikanların əmələ gəlməsi daha az qorunur, bu da neytrallaşdırıcı anticisimləri işə salmaq üçün faydalı ola bilər. .
Bundan əlavə, kompleks qlikanların emalı immunogen mühəndisliyində vacib bir məsələdir, xüsusən də SARS-CoV-2 S-ə qarşı neytrallaşdırıcı antikorun epitopunda N343-də fukosilləşdirilmiş qlikanlar ola biləcəyini nəzərə alsaq (35 ). 22 N ilə əlaqəli qlikozilləşmə sahəsi arasında fukosilasiyanın 52%-i və qlikanların 15%-i ən azı bir sial turşusu qalığını ehtiva edir (Cədvəl S2 və Şəkil S3). Təhlillərimiz göstərdi ki, N343 fukoza qalıqları olan test qlikanlarının 98%-i tərəfindən yüksək dərəcədə fukosilləşmişdir. Glikanların modifikasiyası istifadə olunan hüceyrə ifadə sistemindən ciddi şəkildə təsirlənəcəkdir. Biz əvvəllər HİV-1 Env qlikosilasiyası üçün nümayiş etdirmişik ki, mürəkkəb qlikanların emalı istehsal hüceyrələri tərəfindən idarə olunur, lakin oliqomannoz qlikanların səviyyəsi ifadə sistemindən böyük ölçüdə müstəqildir və zülal strukturu ilə bağlıdır. Glikan sıxlığı ilə sıx bağlıdır (36).
LASV GPC və HIV-1 Env-də müşahidə edildiyi kimi, yüksək sıxlıqlı qlikan qalxanının zülal səthində mannoz klasterləri (22, 24) var (Şəkil 4). Yaxın Şərq Tənəffüs Sindromu (MERS)-CoV S (10)-un S1 alt bölməsində kiçik mannoz tipli klasterlər aşkar edilsə də, SARS-CoV-1 və ya SARS-CoV-2 S zülallarında bu fenomen müşahidə edilməmişdir. Burada bildirilən sahəyə məxsus qlikozilləşmə təhlili göstərir ki, SARS-CoV-2 S qlikan qalxanı digər koronaviruslarla uyğundur və bütün qlikan qalxanı da bir çox zəiflik nümayiş etdirir (10). Nəhayət, Thr323/Ser325-də (T323/S325) iz miqdarda O ilə əlaqəli qlikozilləşmə aşkar etdik, burada saytların 99%-dən çoxu dəyişdirilməyib (Şəkil S4), bu da strukturun yerli kimi olduğunu göstərir.
Soldan sağa MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) və HIV-1 Env (8, 21). Sayta xas N-əlaqəli qlikan oliqomannoz kəmiyyəti açar sözlərə görə rənglənir. LASV GPC istisna olmaqla, bütün qlikoproteinlər HEK 293F hüceyrələrində həll olunan trimerlər kimi ifadə edilir, LASV GPC isə Madin-Darby köpək böyrək II hüceyrələrinin virusa bənzər hissəciklərindən əldə edilir.
SARS-CoV-2-nin qlikozilləşmə analizimiz təbii şəkildə bükülmüş trimer sünbülləri üçün xarakterik olan sahəyə xas qlikan xüsusiyyətləri üçün ətraflı etalon təqdim edir. Glikoproteinlərə əsaslanan getdikcə daha çox namizəd peyvəndin inkişafı ilə ətraflı qlikan analizi immunogenlərin bütövlüyünü müqayisə etmək üçün bir yol təqdim edir və istehsal miqyası klinik istifadəyə qədər genişləndikcə monitorinq də çox vacib olacaqdır. Buna görə də, seroloji test dəstlərinin istehsalında qlikan profilinin təhlili də antigen keyfiyyətinin mühüm göstəricisi olacaqdır. Nəhayət, nukleotid əsaslı vaksinlərin meydana çıxması ilə bu çatdırılma mexanizmlərinin immunogenlərin işlənməsi və təqdim edilməsinə necə təsir etdiyini başa düşmək vacibdir.
Bu, Creative Commons Attribution License şərtləri əsasında paylanmış açıq giriş məqaləsidir. Məqalə orijinal əsərə düzgün istinad etmək şərti ilə istənilən mühitdə məhdudiyyətsiz istifadəyə, yayılmasına və təkrar istehsalına icazə verir.
Qeyd: Sizdən yalnız e-poçt ünvanınızı təqdim etməyinizi xahiş edirik ki, səhifəyə tövsiyə etdiyiniz şəxs e-poçtu görməsini istədiyinizi və bunun spam olmadığını bilsin. Biz heç bir e-poçt ünvanını tutmayacağıq.
Bu sual sizin ziyarətçi olub-olmadığınızı yoxlamaq və avtomatik spam göndərilməsinin qarşısını almaq üçün istifadə olunur.
Kütləvi spektrometriya analizi SARS-CoV-2 sünbül zülalında bütün qlikozilləşmə yerlərinin qlikan tərkibini aşkar etdi.
Kütləvi spektrometriya analizi SARS-CoV-2 sünbül zülalında bütün qlikozilləşmə yerlərinin qlikan tərkibini aşkar etdi.
©2021 Amerika Elmin İnkişafı Assosiasiyası. bütün hüquqlar qorunur. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef və COUNTER.Science ISSN 1095-9203-ün tərəfdaşıdır.
Göndərmə vaxtı: 21 yanvar 2021-ci il
