Tha leasachadh banachdach airson fìor dhroch syndrome analach coronavirus 2 (SARS-CoV-2) air fòcas a chuir air a ’phròtain spìc trimeric a dh’ adhbhraicheas gabhaltachd. Tha 22 làrach glycosylation aig gach protomer anns an spìc trimeric. Dh’ fhaodadh mar a tha na làraich sin air an glycosylated buaidh a thoirt air na ceallan air a bheil am bhìoras a ’toirt buaidh agus dh’ fhaodadh e cuid de epitopes a dhìon bho neodachadh antibody. Bha Watanabe a' feitheamh. Chaidh an trimer spike ath-leasaichte glycosylated a chuir an cèill agus a ghlanadh, a proteolyzed gus glycopeptides anns a bheil glycans singilte a thoirt a-mach, agus chaidh co-dhèanamh làraich glycan a dhearbhadh le mòr-speactrometry. Tha am mion-sgrùdadh seo a’ toirt seachad slat-tomhais a dh’fhaodar a chleachdadh gus càileachd antigen a thomhas nuair a thathar a’ leasachadh banachdachan agus deuchainnean antibody.
Tha β-coronavirus, nochdadh fìor dhroch syndrome analach coronavirus 2 (SARS-CoV-2) na àidseant adhbharach den ghalar coronavirus 2019 (COVID-19), na chunnart mòr do shlàinte dhaoine air feadh an t-saoghail. Tha leasachadh banachdach air fòcas a chuir air a’ phrìomh thargaid den fhreagairt dìonach humoral, an glycoprotein synaptic (S), a bhios a’ toirt a-steach inntrigeadh cealla agus fusion membran. Bidh gach gine SARS-CoV-2 S a’ còdachadh 22 sreath glycosyl ceangailte ri N, a dh’ fhaodadh pàirt a ghabhail ann am pasgadh pròtain agus teicheadh dìonach. An seo, a’ cleachdadh mòr-speactrometry làrach-lìn, nochd sinn an structar glycan air an immunogen ath-leasaichte SARS-CoV-2 S. Faodaidh an anailis seo suidheachadh giollachd glycan a mhapadh thairis air stùc bhìoras trimeric. Bidh sinn a ’sealltainn an eadar-dhealachadh eadar glycan SARS-CoV-2 S agus giullachd glycan aoigheachd àbhaisteach, a dh’ fhaodadh buaidh a thoirt air pathology bhìoras agus dealbhadh banachdach.
Is e fìor dhroch syndrome analach Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) am pathogen adhbharach (1, 2) de Coronavirus 2019 (COVID-19), a dh’ fhaodadh fiabhras, fìor ghalaran analach agus neumonia adhbhrachadh. Bidh SARS-CoV-2 a’ cleachdadh pròtain spìc làn glycosylated (S) a tha a’ sruthadh a-mach à uachdar a ’bhìoras gus ceangal ri angiotensin a’ tionndadh enzyme 2 (ACE2) gus inntrigeadh cealla aoigheachd a mheadhanachadh (3). Tha pròtain S na phròtain fusion clas I trimeric, air a dhèanamh suas de dhà fho-aonad gnìomh, le uallach airson ceangal gabhadan (subunit S1) agus fusion membran (subunit S2) (4, 5). Tha uachdar na h-ìnean còmhdaichte gu ìre mhòr fo smachd glycans a thig bho aoigheachd, agus tha gach trimer a’ taisbeanadh 66 làrach glycosylation ceangailte ri N. Tha pròtain S na phrìomh amas ann an obair dealbhaidh banachdach (6). Faodaidh tuigse air glycosylation de spìcean bhìoras ath-chuingealaichte feartan bunaiteach bith-eòlas bhìoras a nochdadh agus ro-innleachdan dealbhaidh banachdach a stiùireadh (7, 8).
Tha raon farsaing de dhleastanasan aig glycosylation viral ann am pathobiology viral, a’ toirt a-steach a bhith a ’meadhanachadh pasgadh pròtain agus seasmhachd agus a’ cumadh tropism viral (9). Tha làraich glycosylation fo chuideam roghnach leis gu bheil iad a’ brosnachadh teicheadh dìonach le bhith a’ dìon epitopes sònraichte bho neodachadh antibody. Ach, tha sinn air mothachadh gu bheil an ìre mùthaidh de SARS-CoV-2 gu math ìosal, agus gu ruige seo, cha deach mùthadh làrach glycosylation ceangailte ri N fhaicinn (10). Faodaidh uachdar le dùmhlachd anabarrach àrd de glycans aithne dìon a choileanadh (9, 11, 12). Airson coronaviruses eile, chaidh sgrùdadh a dhèanamh air àite glycosylation ann a bhith a’ breugnachadh epitopes pròtain immunogenic (10, 13, 14). Bidh coronaviruses a’ fàs a-steach don chuas endoplasmic reticulum-Golgi gus virions a chruthachadh (15, 16). Ach, nuair a chaidh seòrsaichean iom-fhillte de glycans fhaicinn air stuthan a thàinig bho bhìoras, chaidh a lorg gun tug na h-enzyman giullachd a bha a’ fuireach ann an Golgi buaidh air glycoprotein viral (13, 17).
Tha dùmhlachd glycan viral àrd agus structar pròtain ionadail gu mòr a’ toirt buaidh air slighe aibidh glycan. Faodaidh an aibidh glycan lag a tha a’ leantainn gu làthaireachd glycans seòrsa oligomannose a bhith na neach-aithris mothachail air structar pròtain nàdarra (8), agus faodar mion-sgrùdadh glycan a tha sònraichte don làrach a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar diofar immunogens agus sùil a chumail air pròiseasan toraidh (18). A bharrachd air an sin, faodaidh glycosylation buaidh a thoirt air còmhdhail immunogen ath-chuimseach chun ionad germinal (19).
Gus fuasgladh fhaighinn air glycosylation sònraichte don làrach de phròtain SARS-CoV-2 S agus sealladh a dhèanamh air cuairteachadh glycoproteins air uachdar a ’phròtain gu lèir, chuir sinn an cèill agus ghlan sinn na trì taobhan bith-eòlasach de stuthan solubhail ath-chuingealaichte san aon dòigh a chleachdar gus pròtanan fhaighinn. . mac-samhail. Structar microscopaidh cryo-electron àrd-rùn (cryo-EM), a dh’ aindeoin dìth buaidh bacadh giollachd glycan aig kifennonine (4). Anns an tionndadh seo de phròtain S tha na 22 glycan gu lèir air a’ phròtain SARS-CoV-2 S (Figear 1A). Le bhith a’ cleachdadh mùthaidhean seasmhach 2P de dh’ fuigheall 986 agus 987 (20), ionadachadh GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) (fuigheall 682 gu 685) agus C aig làrach sgoltadh furin, tha structar ro-fusion trimer air a thoirt gu buil A thaobh seasmhachd. - Motif trimerization crìochnachaidh. Bidh seo a’ cuideachadh le bhith a’ cumail suas an structar ceàrnach rè giollachd glycan. Mus deach mion-sgrùdadh a dhèanamh, chaidh an supernatant anns an robh SARS-CoV-2 S ath-leasaichte a ghlanadh le cromatagrafaidheachd às-dùnadh meud gus dèanamh cinnteach nach deach ach pròtanan trimeric coltach ri nàdarra a sgrùdadh (Figear 1B agus Figear S1). Chaidh co-chòrdadh trimer an stuth fìor-ghlan a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh staining àicheil EM (Figear 1C).
(A) Diagram sgeamach de SARS-CoV-2 S glycoprotein. Tha suidheachadh an t-sreath glycosylation ceangailte ri N (NXS / T, far a bheil X≠P) air a shealltainn mar mheur (N, Asn; X, fuigheall sam bith; S, Ser; T, Thr; P, Pro). A’ toirt cunntas air raointean pròtain: àrainn N-terminal (NTD), àrainn ceangail gabhadair (RBD), fusion peptide (FP), ath-aithris heptapeptide 1 (HR1), helix sa mheadhan (CH), fearann ceanglaiche (CD) ) Agus àrainn transmembrane (TM) ). (B) Mion-sgrùdadh electrophoresis gel SDS-polyacrylamide de phròtain SARS-CoV-2 S (air a chomharrachadh le saighead) air a chuir an cèill ann an dubhaig embryoneach daonna (HEK) ceallan 293F. Caol-shràid 1: Supernatant air a shìoladh bho cheallan tar-chuir; Caol-shràid 2: sruthadh troimhe bho roisinn StrepTactin; Caol-shràid 3: A 'nighe le roisinn StrepTactin; Caolshràid 4: Elution bho roisinn StrepTactin. (C) Luach cuibheasach EM 2D àicheil de phròtain SARS-CoV-2 S. Tha luach cuibheasach 2D de phròtain SARS-CoV-2 S air a shealltainn, a’ dearbhadh gu bheil am pròtain a’ gabhail ri trimer pre-fusion conformation, a tha a rèir an stuth a thathar a’ cleachdadh gus an structar a dhearbhadh (4).
Gus faighinn a-mach dè an glycosylation sònraichte don làrach de SARS-CoV-2 S, chleachd sinn trypsin, chymotrypsin agus protease α-lytic gus trì sampallan glycopeptide a ghineadh. Tha na proteases sin air an taghadh gus glycopeptides a dhèanamh anns a bheil aon sreath glycan ceangailte ri N. Chaidh na glycopeptides a sgrùdadh le cromatagrafaidheachd liùlach-mass spectrometry, agus chaidh co-dhèanamh glycan de gach làrach glycan ceangailte 22 N a dhearbhadh (Figear 2). Gus prìomh fheartan giollachd gach làrach a chuir an cèill, a rèir branching agus fucosylation, tha pailteas gach glycan air a sheòrsachadh a-steach do roinnean oligomanose, hybrid agus iom-fhillte glycosylation. Tha Clàr S1 agus Figear 6 a’ toirt seachad seallaidhean leudaichte mionaideach a’ sealltainn diofar sgrìobhadh glycan. S2.
Tha an diagram a’ sealltainn nan còdan dath airson na prìomh sheòrsan glycans a dh’fhaodas nochdadh air an t-slighe aibidh bho oligomannose gu seòrsaichean glycans tar-chinealach. Tha na h-àireamhan sin a’ toirt geàrr-chunntas air mion-sgrùdadh cainneachdail mòr-speactrometry air an t-sluagh glycan a tha an làthair aig aon làrach glycosylation ceangailte ri N, air a lughdachadh gu roinn glycan. Tha an t-sreath glycan seòrsa oligomannose (M9 gu M5; Man9GlcNAc2 gu Man5GlcNAc2) nan glycans tar-chinealach uaine, neo-glycosylated agus fucosylated (hybrid agus F hybrid), tha an loidhne dotagach pinc, a rèir an àireamh de antennae. A1 gu FA4) pinc an làthair suidheachaidhean. Tha dreuchdan bàna ann an làraich glycan ceangailte ri N air an sealltainn ann an liath. Tha an clàr-cearcaill a’ toirt geàrr-chunntas air tomhas nan glycan sin. Tha làraich Glycan air an dath a rèir susbaint glycans seòrsa oligomanose, agus tha na làraich glycan air an comharrachadh mar uaine (80% gu 100%), orains (30% gu 79%) agus pinc (0% gu 29%). Gheibhear dreach leudaichte den mhion-sgrùdadh a tha sònraichte don làrach a’ sealltainn an ioma-ghnèitheachd taobh a-staigh gach roinn ann an Clàr S1 agus Figear 6. S2. Tha an graf bàr a’ riochdachadh cuibheasachd trì mac-samhail bith-eòlasach, agus tha na bàraichean mearachd a’ riochdachadh mearachd àbhaisteach na cuibheasachd.
Tha an dà làrach air SARS-CoV-2 S sa mhòr-chuid oligomanose: N234 agus N709. Ach a-mhàin N234, is e am prìomh structar glycan oligomanose a chaidh fhaicinn anns a’ phròtain gu lèir Man5GlcNAc2 (Man, mannose; GlcNAc, N-acetylglucosamine), a tha a’ nochdadh gum faod na làraich sin a bhith gu ìre mhòr ruigsinneachd α-1,2-mannosidase, ach fo-fhilleadh GlcNAcT Tha -1 lag, is e GlcNAcT-1 am prìomh einnsean ann a bhith a’ cruthachadh glycan heterozygous agus iom-fhillte anns an inneal Golgi. Tha an ìre a tha a ‘cur bacadh air giollachd na fheart co-cheangailte ri dùmhlachd agus taisbeanadh glycans air na spìcean viral. Mar eisimpleir, tha na stùcan àrd glycosylation de bhìoras HIV-1 Env agus Lassa (LASV) GPC a’ nochdadh mòran làraich le smachd Man9GlcNAc2 (21-24).
Gheibhear measgachadh de oligomanose agus glycans iom-fhillte aig làraich N61, N122, N603, N717, N801 agus N1074 (Figear 2). De na 22 làrach anns a ’phròtain S, tha àireamh mhòr de glycans seòrsa oligomanose ann an 8, a tha a’ nochdadh an eadar-dhealachadh eadar giollachd glycans SARS-CoV-2 S agus an glycoprotein aoigheachd (25). Tha na 14 làraich a tha air fhàgail fo smachd seòrsaichean iom-fhillte de glycans.
Ged a chaidh làraich glycosylation falamh a lorg air SARS-CoV-2 S, chaidh an lorg mar phàirt glè bheag den leabharlann peptide iomlan aig àm tomhas (Clàr S2). Ann an sgrùdaidhean immunogen HIV-1, thathas air sealltainn gu bheil na beàrnan a chaidh a chruthachadh le làraich glycan falamh a bhith immunogenic agus faodaidh iad epitopes a tharraing air falbh (26). Tha an ìre còmhnaidh àrd den t-sreath glycan ceangailte le N de SARS-CoV-2 S a’ nochdadh nach fheum an immunogen ath-chuingealaichte tuilleadh optimization gus còmhnaidh làraich àrdachadh.
A’ cleachdadh structar reòta EM de phròtain trimeric SARS-CoV-2 S [Stòr-dàta Protein (PDB) ID 6VSB] (4), chaidh staid glycosylation an ìomhaigh spike coronavirus a mhapadh chun Structar trì-thaobhach (3D) a chaidh a dhearbhadh gu deuchainneach ( Figear 3). Sheall an cothlamadh de mhòr-speactrometry agus mion-sgrùdadh EM aig teòthachd ìosal mar a bhios glycans ceangailte ri N a’ glacadh diofar raointean air uachdar iomlan spìc SARS-CoV-2.
Glican riochdachail modail air structar ro-fusion glycoprotein trimeric SARS-CoV-2 S (PDB ID 6VSB) (4), far a bheil aon RBD anns a’ cho-chòrdadh “suas”, agus an dà RBD eile san “stiùireadh”. Sìos" co-chòrdadh. Tha na glycans air an dath a rèir an t-susbaint oligomanose a tha air a mhìneachadh leis a’ cheangal. Tha làrach ceangail gabhadair ACE2 air a chomharrachadh ann an gorm aotrom. Tha na fo-aonadan S1 agus S2 air an riochdachadh le uachdar leth-fhollaiseach, fa leth, air an tarraing ann an liath aotrom agus dorcha. Tha na lùban sùbailte far a bheil làraich glycan N74 agus N149 suidhichte air an riochdachadh le loidhnichean briste glas, agus tha na làraich glycan air na lùban air am mapadh anns na sgìrean tuairmseach aca.
Faodar faicinn gu bheil an làrach ceangail gabhadan air spìc SARS-CoV-2 air a dhìon leis na làraich glycosylation proximal (N165, N234, N343), gu sònraichte nuair a tha an raon ceangail gabhadan anns a ’cho-chòrdadh“ sìos ”. Mar a chaidh fhaicinn ann an SARS-CoV-1 S (10, 13), HIV-1 Env (27), hemagglutinin influenza (28, 29) agus LASV GPC, dìon làraich ceangail gabhadan le glycans Tha e na fheart cumanta de glycoproteins viral . (fichead 's a ceithir). A’ beachdachadh air crìochan gnìomh làrach ceangail an luchd-gabhail agus ìre mùthaidh ìosal nan fuigheall sin, dh’ fhaodadh gum bi cuideam roghnach ann glycans ceangailte ri N a chleachdadh gus breug-riochd a dhèanamh air aon de na roinnean as glèidhte agus as so-leònte de na glycoproteins aca fhèin (30, 31).
Mhothaich sinn gu robh glycans seòrsa oligomanose air an sgapadh air na fo-aonadan S1 agus S2. Tha seo an taca ri glycoproteins viral eile. Mar eisimpleir, faodaidh cruinneachaidhean tiugh de glycan ann an grunn shreathan de HIV-1 Env glycans coltach ri oligomanose aithneachadh le antibodies (32, 33). Ann an SARS-CoV-2 S, tha coltas ann gu bheil structar oligomannose air a dhìon le co-phàirtean pròtain, leithid glycans N234 (gu ìre air an ceangal eadar an N-terminus agus an raon ceangail gabhadan) (Figear 3).
Chomharraich sinn na glycans ceangailte le N air na structaran lùb sùbailte leudaichte (N74 agus N149) agus C-terminus faisg air làimh den membran (N1158, N1173, N1194), agus cha deach na moileciuilean sin fhuasgladh anns na h-ìomhaighean cryoEM (4). Chaidh iad sin a chomharrachadh mar glycans iom-fhillte, co-chòrdail ri ruigsinneachd spàsail nan fuigheall sin.
Ged a tha susbaint glycans oligomanose (28%) (Clàr S2) nas àirde na an ìre air glycoproteins aoigheachd àbhaisteach, tha e nas ìsle na glycoproteins viral eile. Mar eisimpleir, is e HIV-1 Env aon de na pròtanan spìc viral as dùmhail glycosylated, a tha a’ taisbeanadh ~60% glycans seòrsa oligomanose (21, 34). Tha seo a’ nochdadh, an taca ri glycoproteins viral eile (a ’toirt a-steach HIV-1 Env agus LASV GPC), gu bheil glycosylation pròtain SARS-CoV-2 S nas laige, agus gu bheil cruthachadh glycans nas lugha de sgiath, a dh’ fhaodadh a bhith feumail airson antibodies neodachadh a bhrosnachadh. .
A bharrachd air an sin, tha làimhseachadh glycan iom-fhillte na bheachdachadh cudromach ann an innleadaireachd immunogen, gu sònraichte leis gum faodadh glycans fucosylated aig N343 (35) a bhith ann an epitope an antibody neutralizing an aghaidh SARS-CoV-2 S. Am measg nan làraich glycosylation ceangailte ri 22 N, bha co-dhiù aon fuigheall searbhag sialic ann an 52% de na fucosylation agus 15% de na glycans (Clàr S2 agus Figear S3). Sheall ar mion-sgrùdadh gu bheil N343 gu math fucosylated le 98% de na glycans deuchainn le fuigheall fucose. Bheir an siostam faireachdainn cealla a thathar a’ cleachdadh buaidh mhòr air atharrachadh glycans. Tha sinn air dearbhadh roimhe seo airson glycosylation Env HIV-1 gu bheil giollachd glycans iom-fhillte air a stiùireadh le ceallan cinneasachaidh, ach tha an ìre de glycans oligomanose gu ìre mhòr neo-eisimeileach bhon t-siostam faireachdainn agus tha e co-cheangailte ri structar pròtain. Co-cheangailte gu dlùth ri dùmhlachd glycan (36).
Mar a chaidh fhaicinn air LASV GPC agus HIV-1 Env, tha cruinneachaidhean mannose (22, 24) ris an canar an sgiath glycan àrd-dùmhlachd air uachdar pròtain (Figear 4). Ged a chaidh cruinneachaidhean beaga seòrsa mannose a lorg air fo-aonad S1 de Syndrome analach an Ear Mheadhanach (MERS) -CoV S (10), cha deach an iongantas seo fhaicinn le pròtanan SARS-CoV-1 no SARS-CoV-2 S. Tha an sgrùdadh glycosylation sònraichte don làrach a chaidh aithris an seo a’ sealltainn gu bheil sgiath glycan SARS-CoV-2 S co-chòrdail ri coronaviruses eile, agus tha an sgiath glycan gu lèir cuideachd a’ nochdadh mòran so-leòntachd (10). Mu dheireadh, lorg sinn meudan lorg de glycosylation ceangailte ri O aig Thr323 / Ser325 (T323 / S325), far an robh còrr air 99% de na làraich gun atharrachadh (Figear S4), a tha a’ nochdadh nuair a tha an structar coltach ri dùthchasach.
Bho chlì gu deas tha MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) agus HIV-1 Env (8, 21). Tha an àireamhachadh glycan oligomannose ceangailte ri làrach sònraichte air a dhath a rèir prìomh fhaclan. Ach a-mhàin LASV GPC, tha a h-uile glycoproteins air an cur an cèill mar trimers solubhail ann an ceallan HEK 293F, fhad ‘s a tha LASV GPC a’ tighinn bho ghràinean coltach ri bhìoras de cheallan dubhaig Madin-Darby canine II.
Tha ar mion-sgrùdadh glycosylation de SARS-CoV-2 a’ toirt seachad slat-tomhais mionaideach airson na feartan glycan a tha sònraichte don làrach a tha sònraichte do spìcean trimer fillte gu nàdarra. Le leasachadh barrachd is barrachd banachdachan tagraiche stèidhichte air glycoproteins, tha mion-sgrùdadh glycan mionaideach a ‘toirt seachad dòigh air coimeas a dhèanamh eadar ionracas immunogens, agus mar a bhios lannan toraidh a’ leudachadh gu cleachdadh clionaigeach, bidh sgrùdadh glè chudromach cuideachd. Mar sin, ann a bhith a’ dèanamh innealan deuchainn seròlach, bidh mion-sgrùdadh ìomhaigh glycan cuideachd na chomharradh cudromach air càileachd antigen. Mu dheireadh, le teachd banachdachan stèidhichte air nucleotide, tha e cudromach tuigsinn mar a bheir na dòighean lìbhrigidh sin buaidh air giullachd agus taisbeanadh immunogens.
Is e artaigil ruigsinneachd fosgailte a tha seo air a sgaoileadh fo chumhachan an Creative Commons Attribution License. Tha an artaigil a’ ceadachadh cleachdadh, cuairteachadh agus ath-riochdachadh gun bhacadh ann am meadhan sam bith fon chumha gu bheil an obair thùsail air a ghairm ceart.
Nota: Chan iarr sinn ort ach do sheòladh puist-d a thoirt seachad gus am bi fios aig an neach a mholas tu don duilleag gu bheil thu airson gum faic iad am post-d agus nach e spam a th’ ann. Cha ghlac sinn seòlaidhean puist-d sam bith.
Tha a’ cheist seo air a cleachdadh gus dearbhadh a bheil thu nad neach-tadhail agus gus casg a chuir air spam fèin-ghluasadach.
Nochd mion-sgrùdadh speactrometry mòr co-dhèanamh glycan de gach làrach glycosylation air pròtain spike SARS-CoV-2.
Nochd mion-sgrùdadh speactrometry mòr co-dhèanamh glycan de gach làrach glycosylation air pròtain spike SARS-CoV-2.
©2021 Comann Ameireagaidh airson Adhartachadh Saidheans. Còraichean uile glèidhte. Tha AAAS na chom-pàirtiche aig HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Ùine puist: Faoilleach-21-2021
