Razvoj cjepiva za teški akutni respiratorni sindrom koronavirus 2 (SARS-CoV-2) fokusiran je na trimerni spike protein koji uzrokuje infekciju. Svaki protomer u trimernom šiku ima 22 glikozilacijska mjesta. Način na koji su ova mjesta glikozilirana može utjecati na ćelije koje virus inficira i može zaštititi određene epitope od neutralizacije antitijela. Watanabe je čekao. Rekombinantni glikozilirani spike trimer je eksprimiran i pročišćen, proteoliziran da bi se proizveli glikopeptidi koji sadrže pojedinačne glikane, a sastav glikanskih mjesta je određen masenom spektrometrijom. Ova analiza pruža referentnu vrijednost koja se može koristiti za mjerenje kvaliteta antigena prilikom razvoja vakcina i testova na antitela.
β-korona virus, pojava teškog akutnog respiratornog sindroma korona virus 2 (SARS-CoV-2) uzročnik je bolesti korona virusa iz 2019. (COVID-19), koja predstavlja ogromnu prijetnju ljudskom zdravlju širom svijeta. Razvoj vakcine fokusirao se na glavnu metu humoralnog imunog odgovora, sinaptički (S) glikoprotein, koji posreduje u ulasku ćelije i fuziji membrane. Svaki SARS-CoV-2 S gen kodira 22 N-vezane glikozilne sekvence, koje mogu igrati ulogu u savijanju proteina i imunološkom bijegu. Ovdje smo, korištenjem masene spektrometrije specifične za lokaciju, otkrili strukturu glikana na rekombinantnom SARS-CoV-2 S imunogenu. Ova analiza može mapirati stanje obrade glikana preko vrha trimernog virusa. Pokazujemo razliku između SARS-CoV-2 S glikana i tipične obrade glikanom domaćina, što može imati utjecaj na patologiju virusa i dizajn cjepiva.
Teški akutni respiratorni sindrom Koronavirus 2 (SARS-CoV-2) je uzročnik (1, 2) Coronavirusa 2019 (COVID-19), koji može uzrokovati groznicu, teške respiratorne bolesti i upalu pluća. SARS-CoV-2 koristi široko glikozilirani šiljasti (S) protein koji strši iz površine virusa da se veže za enzim koji konvertuje angiotenzin 2 (ACE2) da posreduje u ulasku u ćeliju domaćina (3). S protein je trimerni fuzioni protein klase I, sastavljen od dvije funkcionalne podjedinice, odgovorne za vezivanje receptora (S1 podjedinica) i fuziju membrane (S2 podjedinica) (4, 5). Površina obloženog nokta uglavnom je kontrolirana glikanima dobivenim iz domaćina, a svaki trimer prikazuje 66 N-vezanih glikozilacijskih mjesta. S protein je ključni cilj u radu na dizajnu vakcine (6). Razumijevanje glikozilacije rekombinantnih virusnih šiljaka može otkriti osnovne karakteristike biologije virusa i voditi strategije dizajna cjepiva (7, 8).
Virusna glikozilacija ima širok spektar uloga u virusnoj patobiologiji, uključujući posredovanje u savijanju proteina i stabilnosti i oblikovanju virusnog tropizma (9). Mjesta glikozilacije su pod selektivnim pritiskom jer potiču imunološki bijeg štiteći specifične epitope od neutralizacije antitijela. Međutim, primijetili smo da je stopa mutacije SARS-CoV-2 vrlo niska i do sada nije uočena mutacija na N-vezanom mjestu glikozilacije (10). Površine s abnormalno visokom gustinom glikana također mogu postići imunološko prepoznavanje (9, 11, 12). Za druge koronaviruse proučavana je uloga glikozilacije u kamufliranju imunogenih proteinskih epitopa (10, 13, 14). Koronavirusi klijaju u endoplazmatski retikulum-Golgijevu šupljinu i formiraju virione (15, 16). Međutim, kada su složeni tipovi glikana uočeni na materijalima izvedenim od virusa, otkriveno je da na virusni glikoprotein utiču enzimi koji se nalaze u Golgiju (13, 17).
Visoka gustoća virusnog glikana i lokalna struktura proteina prostorno narušavaju put sazrijevanja glikana. Oštećeno sazrijevanje glikana koje dovodi do prisustva glikana tipa oligomanoze može biti osjetljiv reporter prirodne proteinske strukture (8), a analiza glikana specifična za mjesto može se koristiti za poređenje različitih imunogena i praćenje proizvodnih procesa (18). Osim toga, glikozilacija može uticati na transport rekombinantnog imunogena do germinativnog centra (19).
Kako bismo riješili specifičnu glikozilaciju SARS-CoV-2 S proteina i vizualizirali distribuciju glikoproteina na cijeloj površini proteina, eksprimirali smo i pročistili tri biološka aspekta rekombinantnih topljivih materijala na isti način kao što se koristi za dobivanje proteina. . replika. Struktura krio-elektronske mikroskopije visoke rezolucije (cryo-EM), uprkos nedostatku blokirajućeg efekta kifenonina na obradu glikana (4). Ova varijanta S proteina sadrži sva 22 glikana na SARS-CoV-2 S proteinu (slika 1A). Korišćenjem 2P stabilnih mutacija ostataka 986 i 987 (20), GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) supstitucije (ostaci 682 do 685) i C na mestu cepanja furina, struktura pre fuzije trimera je ostvarena stabilnosti. -Motiv trimerizacije terminala. Ovo pomaže u održavanju kvartarne strukture tokom obrade glikana. Prije analize, supernatant koji sadrži rekombinantni SARS-CoV-2 S pročišćen je hromatografijom isključivanja veličine kako bi se osiguralo da su analizirani samo prirodni trimerni proteini (Slika 1B i Slika S1). Konformacija trimera pročišćenog materijala je verificirana korištenjem negativnog bojenja EM (slika 1C).
(A) Šematski dijagram SARS-CoV-2 S glikoproteina. Položaj N-vezane glikozilacione sekvence (NXS/T, gdje je X≠P) prikazan je kao grana (N, Asn; X, bilo koji ostatak; S, Ser; T, Thr; P, Pro). Opisuje domene proteina: N-terminalni domen (NTD), domen za vezivanje receptora (RBD), fuzioni peptid (FP), heptapeptidni ponavljanje 1 (HR1), centralni heliks (CH), konektorski domen (CD) i transmembranski domen (TM) ). (B) Analiza elektroforeze u SDS-poliakrilamidnom gelu SARS-CoV-2 S proteina (označenog strelicom) izraženog u 293F ćelijama ljudskog embrionalnog bubrega (HEK). Traka 1: Supernatant filtriran iz transficiranih ćelija; Traka 2: Protok od StrepTactin smole; Traka 3: Pranje sa StrepTactin smolom; Traka 4: Eluacija iz StrepTactin smole. (C) Srednja vrijednost EM 2D negativa SARS-CoV-2 S proteina. Prikazana je 2D prosječna vrijednost SARS-CoV-2 S proteina, što potvrđuje da protein usvaja konformaciju trimera prije fuzije, koja odgovara materijalu korištenom za određivanje strukture (4).
Da bismo odredili glikozilaciju SARS-CoV-2 S, specifičnu za mjesto, koristili smo tripsin, himotripsin i α-litičku proteazu za generiranje tri uzorka glikopeptida. Ove proteaze su odabrane da proizvode glikopeptide koji sadrže jednu N-vezanu glikansku sekvencu. Glikopeptidi su analizirani tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom i određen je glikanski sastav svih 22 N-vezana glikanska mjesta (slika 2). Kako bi se prenijele glavne karakteristike obrade svake lokacije, prema grananju i fukozilaciji, obilje svakog glikana je klasifikovano u kategorije oligomanoze, hibrida i kompleksne glikozilacije. Tabela S1 i Slika 6 daju detaljne proširene prikaze koji prikazuju različite sastave glikana. S2.
Dijagram ilustruje kodove boja za glavne tipove glikana koji se mogu pojaviti duž puta sazrijevanja od oligomanoze do hibridnih tipova glikana. Ove brojke sumiraju kvantitativnu analizu masene spektrometrije populacije glikana prisutne na jednom N-vezanom mjestu glikozilacije, svedenoj na kategoriju glikana. Serija glikana tipa oligomanoze (M9 do M5; Man9GlcNAc2 do Man5GlcNAc2) su zeleni, neglikozilirani i fukozilirani hibridni glikani (hibrid i F hibrid), isprekidana linija je ružičasta, prema broju antena. Složena glikanska grupacija jezgra A1 do FA4) je ružičasta u prisustvu uslova. Slobodna radna mjesta na N-vezanim glikanskim mjestima prikazana su sivom bojom. Kružni grafikon sažima kvantifikaciju ovih glikana. Glikanska mesta su obojena prema sadržaju glikana tipa oligomanoze, a mesta glikana su označena zelenom (80% do 100%), narandžastom (30% do 79%) i ružičastom (0% do 29%). Proširena verzija analize specifične za lokaciju koja pokazuje heterogenost unutar svake kategorije može se naći u tabeli S1 i slici 6. S2. Stupasti grafikon predstavlja prosjek od tri biološka ponavljanja, a trake greške predstavljaju standardnu grešku prosjeka.
Dvije lokacije na SARS-CoV-2 S su uglavnom oligomanoze: N234 i N709. Osim N234, glavna oligomanozna glikanska struktura uočena u cijelom proteinu je Man5GlcNAc2 (Man, manoza; GlcNAc, N-acetilglukozamin), što ukazuje da ova mjesta mogu biti u velikoj mjeri pristupa α-1,2-manozidazi, ali supstrat GlcNAcT -1 je slab, GlcNAcT-1 je ključni enzim u formiranju heterozigotnih i kompleksnih glikana u Golgijevom aparatu. Faza koja ometa procesiranje je karakteristika vezana za gustinu i prezentaciju glikana na virusnim šiljcima. Na primjer, visoki vrhovi glikozilacije HIV-1 Env i Lassa virusa (LASV) GPC pokazuju mnoga mjesta na kojima dominira Man9GlcNAc2 (21-24).
Mješavina oligomanoze i kompleksnih glikana može se naći na lokacijama N61, N122, N603, N717, N801 i N1074 (slika 2). Od 22 mjesta u S proteinu, 8 sadrži veliki broj glikana tipa oligomanoze, što naglašava razliku između obrade SARS-CoV-2 S glikana i glikoproteina domaćina (25). Na preostalih 14 lokacija dominiraju obrađeni kompleksni tipovi glikana.
Iako su na SARS-CoV-2 S otkrivena nezauzeta mjesta glikozilacije, utvrđeno je da predstavljaju vrlo mali dio ukupne biblioteke peptida tokom kvantifikacije (Tabela S2). U studijama HIV-1 imunogena, pokazalo se da su praznine koje stvaraju nezauzeta glikanska mjesta imunogene i mogu uzrokovati ometanje epitopa (26). Visoka stopa popunjenosti N-vezane glikanske sekvence SARS-CoV-2 S ukazuje na to da rekombinantni imunogen neće zahtijevati daljnju optimizaciju kako bi se povećala zauzetost mjesta.
Koristeći zamrznutu EM strukturu trimernog SARS-CoV-2 S proteina [Protein Database (PDB) ID 6VSB] (4), stanje glikozilacije imitacije korona virusa je mapirano u eksperimentalno utvrđenu trodimenzionalnu (3D) strukturu ( Slika 3). Kombinacija masene spektrometrije i niskotemperaturne EM analize otkrila je kako N-povezani glikani hvataju različita područja na cijeloj površini šiljka SARS-CoV-2.
Model reprezentativnih glikana na strukturi pre fuzije trimernog SARS-CoV-2 S glikoproteina (PDB ID 6VSB) (4), gdje je jedan RBD u konformaciji „gore“, a druga dva RBD u „smjeru“. Dole” konformacija. Glikani su obojeni u skladu sa sadržajem oligomanoze definisanim vezom. Vezivno mjesto za ACE2 receptor je istaknuto svijetloplavom bojom. Podjedinice S1 i S2 predstavljene su poluprozirnim površinama, respektivno, nacrtanim svijetlo i tamno sivom bojom. Fleksibilne petlje u kojima se nalaze glikanska mjesta N74 i N149 predstavljene su sivim isprekidanim linijama, a mjesta glikana na petljama su mapirana u njihovim približnim područjima.
Može se primijetiti da je mjesto vezivanja receptora na SARS-CoV-2 šiljku zaštićeno proksimalnim mjestima glikozilacije (N165, N234, N343), posebno kada je domen za vezivanje receptora u konformaciji „dolje“. Kao što je uočeno kod SARS-CoV-1 S (10, 13), HIV-1 Env (27), hemaglutinina gripe (28, 29) i LASV GPC, zaštita mjesta vezivanja receptora glikanima je uobičajena karakteristika virusnih glikoproteina . (dvadeset četiri). Uzimajući u obzir funkcionalna ograničenja mjesta vezanja receptora i nisku stopu mutacije ovih ostataka, može postojati selektivni pritisak da se koriste N-povezani glikani za kamufliranje jednog od najsačuvanijih i potencijalno ranjivih regija njihovih odgovarajućih glikoproteina (30, 31).
Primijetili smo disperziju glikana tipa oligomanoze na S1 i S2 podjedinicama. Ovo je u suprotnosti s drugim virusnim glikoproteinima. Na primjer, gusti glikanski klasteri u nekoliko HIV-1 Env sojeva mogu inducirati glikane tipa oligomanoze koje prepoznaju antitijela (32, 33). Kod SARS-CoV-2 S, struktura oligomanoze će vjerovatno biti zaštićena proteinskim komponentama, kao što su N234 glikani (djelimično u sendviču između N-terminusa i domene za vezivanje receptora) (slika 3).
N-vezane glikane smo okarakterizirali na proširenim strukturama fleksibilne petlje (N74 i N149) i proksimalnom C-terminusu membrane (N1158, N1173, N1194), a ovi molekuli su bili nerazdvojeni na cryoEM slikama (4). Oni su identifikovani kao složeni glikani, u skladu sa prostornom dostupnošću ovih ostataka.
Iako je sadržaj oligomanoznih glikana (28%) (Tabela S2) veći od onog na tipičnim glikoproteinima domaćina, on je niži od ostalih virusnih glikoproteina. Na primjer, jedan od najgušće glikozilovanih virusnih šiljastih proteina je HIV-1 Env, koji pokazuje ~60% glikana tipa oligomanoze (21, 34). Ovo ukazuje da je u poređenju s drugim virusnim glikoproteinima (uključujući HIV-1 Env i LASV GPC), glikozilacija SARS-CoV-2 S proteina slabija, a stvaranje glikana je manje zaštićeno, što može biti korisno za pokretanje neutralizirajućih antitijela. .
Osim toga, obrada kompleksnih glikana je važno razmatranje u imunogenom inženjeringu, posebno imajući u vidu da epitop neutralizirajućeg antitijela protiv SARS-CoV-2 S može sadržavati fukozilovane glikane na N343 (35). Među 22 N-vezana glikozilacijska mjesta, 52% fukozilacije i 15% glikana sadržavalo je najmanje jedan ostatak sijalinske kiseline (Tabela S2 i Slika S3). Naša analiza je pokazala da je N343 visoko fukoziliran od 98% testnih glikana sa ostacima fukoze. Korišteni sistem ćelijske ekspresije će biti ozbiljno pogođen modifikacijom glikana. Prethodno smo pokazali za HIV-1 Env glikozilaciju da procesiranje kompleksnih glikana pokreće proizvodne ćelije, ali nivo oligomanoznih glikana je u velikoj meri nezavisan od sistema ekspresije i povezan je sa strukturom proteina. Usko povezano sa gustinom glikana (36).
Kao što je uočeno na LASV GPC i HIV-1 Env, glikanski štit visoke gustine ima takozvane klastere manoze (22, 24) na površini proteina (Slika 4). Iako su mali klasteri tipa manoze pronađeni na S1 podjedinici bliskoistočnog respiratornog sindroma (MERS)-CoV S (10), ovaj fenomen nije uočen kod SARS-CoV-1 ili SARS-CoV-2 S proteina. Analiza glikozilacije specifične za lokaciju koja je ovdje objavljena pokazuje da je glikanski štit SARS-CoV-2 S u skladu s drugim koronavirusima, a cijeli glikanski štit također pokazuje mnoge ranjivosti (10) . Konačno, otkrili smo tragove O-vezane glikozilacije na Thr323/Ser325 (T323/S325), gdje je više od 99% mjesta bilo nemodificirano (Slika S4), što ukazuje na to kada je struktura slična prirodnoj.
S lijeva na desno su MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) i HIV-1 Env (8, 21). Kvantifikacija N-vezane glikan oligomanoze specifične za lokaciju obojena je prema ključnim riječima. Osim LASV GPC, svi glikoproteini se eksprimiraju kao rastvorljivi trimeri u ćelijama HEK 293F, dok je LASV GPC izveden iz virusnih čestica Madin-Darby psećih ćelija bubrega II.
Naša analiza glikozilacije SARS-CoV-2 pruža detaljnu referentnu vrijednost za karakteristike glikana specifične za mjesto karakteristične za prirodno savijene trimerske šiljke. Sa razvojem sve više i više kandidatskih vakcina zasnovanih na glikoproteinima, detaljna analiza glikana pruža način da se uporedi integritet imunogena, a kako se proizvodne skale šire na kliničku upotrebu, praćenje će takođe biti veoma važno. Stoga će u proizvodnji seroloških testova analiza profila glikana također biti važan pokazatelj kvalitete antigena. Konačno, s pojavom vakcina zasnovanih na nukleotidima, važno je razumjeti kako ovi mehanizmi isporuke utiču na obradu i prezentaciju imunogena.
Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod uslovima licence Creative Commons Attribution. Članak dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kom mediju pod uslovom da je originalno delo pravilno citirano.
Napomena: Od vas tražimo samo da navedete svoju adresu e-pošte kako bi osoba koju preporučite na stranici znala da želite da vidi e-poštu i da nije neželjena pošta. Nećemo uhvatiti nijednu adresu e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za testiranje da li ste posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Analiza masene spektrometrije otkrila je glikanski sastav svih mjesta glikozilacije na SARS-CoV-2 spike proteinu.
Analiza masene spektrometrije otkrila je glikanski sastav svih mjesta glikozilacije na SARS-CoV-2 spike proteinu.
©2021 Američko udruženje za unapređenje nauke. sva prava zadržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Vrijeme objave: Jan-21-2021
