Vakcina disvolviĝo por severa akra spira sindromo koronavirus 2 (SARS-CoV-2) koncentriĝis pri la trimera pikproteino, kiu kaŭzas infekton. Ĉiu protomero en la trimera pikilo havas 22 glikoziligejojn. Kiel ĉi tiuj ejoj estas glikozilataj povas influi kiujn ĉelojn la viruso infektas kaj povas protekti certajn epitopojn de antikorpa neŭtraligo. Watanabe atendis. La rekombina glikozilata piktrimero estis esprimita kaj purigita, proteolizita por produkti glikopeptidojn enhavantajn ununurajn glikanojn, kaj la konsisto de glikanejoj estis determinita per mas-spektrometrio. Ĉi tiu analizo disponigas komparnormon, kiu povas esti uzata por mezuri antigenan kvaliton dum evoluigado de vakcinoj kaj antikorptestoj.
β-koronavirus, la apero de severa akra spira sindromo koronavirus 2 (SARS-CoV-2) estas la kaŭza agento de la koronavirus-malsano de 2019 (COVID-19), prezentante grandegan minacon al homa sano tutmonde. Vakcinevoluo temigis la ĉefcelon de la humura imunreago, la sinapta (S) glikoproteino, kiu mediacias ĉelan eniron kaj membranfuzion. Ĉiu SARS-CoV-2 S-geno ĉifras 22 N-ligitajn glikozilsekvencojn, kiuj povas ludi rolon en proteinfaldado kaj imuna fuĝo. Ĉi tie, uzante ejon-specifan mas-spektrometrion, ni rivelis la glikanan strukturon sur la rekombina SARS-CoV-2 S imunogeno. Ĉi tiu analizo povas mapi la glican-pretigan staton trans la trimera viruspinto. Ni montras la diferencon inter SARS-CoV-2 S-glicano kaj tipa mastro-glikana pretigo, kiu povas influi virusan patologion kaj vakcinan dezajnon.
Severa Akuta Spira Sindromo Koronavirus 2 (SARS-CoV-2) estas la kaŭza patogeno (1, 2) de Koronavirus 2019 (COVID-19), kiu povas kaŭzi febron, severajn spirajn malsanojn kaj pulminflamon. SARS-CoV-2 uzas vaste glikozilatitan pikilan (S) proteinon elstarantan de la surfaco de la viruso por ligi al angiotensina konvertanta enzimo 2 (ACE2) por peri eniron de la gastiga ĉelo (3). S-proteino estas trimera klaso I fuzioproteino, kunmetita de du funkciaj subunuoj, respondecaj por receptorligado (S1-subunuo) kaj membranfuzio (S2-subunuo) (4, 5). La surfaco de la kovrita najlo estas plejparte kontrolita de gastigant-derivitaj glikanoj, kaj ĉiu trimer montras 66 N-ligitajn glikosilatiĝojn. S-proteino estas ŝlosila celo en vakcindezajna laboro (6). Kompreni la glikosiladon de rekombinaj virusaj pikiloj povas riveli la bazajn trajtojn de virusa biologio kaj gvidi vakcinajn dezajnajn strategiojn (7, 8).
Vira glikosilado havas ampleksan gamon de roloj en virusa patobiologio, inkluzive de mediacio de proteino faldado kaj stabileco kaj formado de virusa tropismo (9). Glikoziligejoj estas sub selektema premo ĉar ili antaŭenigas imunfuĝon protektante specifajn epitopojn de antikorpneŭtraligo. Tamen, ni rimarkis, ke la mutacio-indico de SARS-CoV-2 estas tre malalta, kaj ĝis nun, neniu mutacio de N-ligita glikozila ejo estis observita (10). Surfacoj kun nenormale alta denseco de glikanoj ankaŭ povas atingi imunan rekonon (9, 11, 12). Por aliaj koronavirusoj, la rolo de glikozilado en kamuflado de imunogenaj proteinepitopoj estis studita (10, 13, 14). Koronavirusoj ĝermas en la endoplasman retikul-Golgi-kavon por formi virionojn (15, 16). Tamen, kiam kompleksaj specoj de glikanoj estis observitaj sur virus-derivitaj materialoj, oni trovis, ke la virusa glikoproteino estis tuŝita de la prilaboraj enzimoj, kiuj loĝis en Golgi (13, 17).
Alta virusa glikandenseco kaj loka proteinstrukturo space difektas la glican-maturigan vojon. La difektita glikanmaturiĝo, kiu kondukas al la ĉeesto de oligomanose-tipaj glikanoj, povas esti sentema raportisto de natura proteina strukturo (8), kaj ejo-specifa glikananalizo povas esti uzata por kompari malsamajn imunogenojn kaj monitori produktadajn procezojn (18). Krome, glikosilado povas influi la transporton de rekombina imunogeno al la ĝerma centro (19).
Por solvi la ejon-specifan glikosiladon de SARS-CoV-2 S-proteino kaj bildigi la distribuadon de glikoproteinoj sur la tuta proteinsurfaco, ni esprimis kaj purigis la tri biologiajn aspektojn de rekombinaj solveblaj materialoj en la sama maniero kiel uzata por akiri proteinojn. . kopio. Alt-rezolucia krio-elektrona mikroskopio (krio-EM) strukturo, malgraŭ la manko de glikana pretigo blokanta efiko de kifennonino (4). Ĉi tiu varianto de la S-proteino enhavas ĉiujn 22 glikanojn sur la SARS-CoV-2 S-proteino (Figuro 1A). Uzante 2P stabilajn mutaciojn de restaĵoj 986 kaj 987 (20), GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) anstataŭigo (restaĵoj 682 ĝis 685) kaj C ĉe la furina fendloko, la trimer antaŭ-fuzia strukturo estas realigita De stabileco. -Termina trimeriga motivo. Ĉi tio helpas konservi la kvaternaran strukturon dum glikan-pretigo. Antaŭ analizo, la supernatant enhavanta rekombinan SARS-CoV-2 S estis purigita per grandekskluda kromatografio por certigi, ke nur natursimilaj trimeraj proteinoj estis analizitaj (Figuro 1B kaj Figuro S1). La trimerformo de la purigita materialo estis kontrolita uzante negativan makuladon EM (Figuro 1C).
(A) Skema diagramo de SARS-CoV-2 S glikoproteino. La pozicio de la N-ligita glikosilatsekvenco (NXS/T, kie X≠P) estas montrita kiel branĉo (N, Asn; X, ajna restaĵo; S, Ser; T, Thr; P, Pro). Priskribas proteinajn domajnojn: N-fina domajno (NTD), receptor-liga domajno (RBD), fuziopeptido (FP), heptapeptida ripeto 1 (HR1), centra helico (CH), konektildomajno (KD) ) Kaj transmembrana domajno (TM) ). (B) SDS-poliakrilamida ĝela elektroforeza analizo de SARS-CoV-2 S-proteino (indikita per sago) esprimita en ĉeloj 293F de homaj embriaj renoj (HEK). Leno 1: Supernatant filtrita de transfektitaj ĉeloj; Leno 2: Trafluo de StrepTactin-rezino; Leno 3: Lavado kun StrepTactin-rezino; Leno 4: Eluo de StrepTactin-rezino. (C) Mezvaloro de EM 2D negativa de SARS-CoV-2 S-proteino. La 2D averaĝa valoro de SARS-CoV-2 S-proteino estas montrita, konfirmante, ke la proteino adoptas trimeran antaŭ-fuzian konformiĝon, kiu kongruas kun la materialo uzata por determini la strukturon (4).
Por determini la ejon-specifan glikosiladon de SARS-CoV-2 S, ni uzis tripsinon, kimotripsinon kaj α-litan proteazon por generi tri glikopeptidajn specimenojn. Tiuj proteazoj estas elektitaj por produkti glikopeptidojn enhavantajn ununuran N-ligitan glikansekvencon. La glikopeptidoj estis analizitaj per likva kromatografio-masa spektrometrio, kaj la glikan-konsisto de ĉiuj 22 N-ligitaj glikanejoj estis determinita (Figuro 2). Por transdoni la ĉefajn pretigajn trajtojn de ĉiu ejo, laŭ la disbranĉigo kaj fukozilado, la abundo de ĉiu glicano estas klasifikita en oligomanozo, hibrida kaj kompleksa glikosilado kategorioj. Tabelo S1 kaj Figuro 6 donas detalajn vastigitajn vidojn montrantajn diversajn glikanajn kunmetaĵojn. S2.
La diagramo ilustras la kolorkodojn por la ĉeftipoj de glikanoj kiuj povas aperi laŭ la maturiĝopado de oligomanozo ĝis hibridaj specoj de glikanoj. Ĉi tiuj figuroj resumas la kvantan mas-spektrometrian analizon de la glikan-populacio ĉeestanta ĉe ununura N-ligita glikosilatejo, reduktita al la glikankategorio. La oligomanose-tipaj glikanaj serioj (M9 ĝis M5; Man9GlcNAc2 ĝis Man5GlcNAc2) estas verdaj, ne-glikozilataj kaj fukozilitaj hibridaj glikanoj (hibrido kaj F-hibrido), la punktlinio estas rozkolora, laŭ la nombro da antenoj La kompleksa glikan-grupiĝanta kernfukosilado ( A1 al FA4) estas rozkolora en ĉeesto de kondiĉoj. Vakantaĵoj en N-ligitaj glikanejoj estas montritaj en grizo. La tortdiagramo resumas la kvantigon de ĉi tiuj glikanoj. Glikanaj ejoj estas kolorigitaj laŭ la enhavo de oligomanose-specaj glikanoj, kaj la glikanaj ejoj estas markitaj kiel verdaj (80% ĝis 100%), oranĝaj (30% ĝis 79%) kaj rozkoloraj (0% ĝis 29%). Vastigita versio de la retejo-specifa analizo montranta la heterogenecon ene de ĉiu kategorio troveblas en Tabelo S1 kaj Figuro 6. S2. La strekgrafiko reprezentas la mezumon de tri biologiaj kopioj, kaj la erarstangoj reprezentas la norman eraron de la mezumo.
La du ejoj sur SARS-CoV-2 S estas ĉefe oligomanozaj: N234 kaj N709. Krom N234, la ĉefa oligomanoza glikanstrukturo observita en la tuta proteino estas Man5GlcNAc2 (Viro, manozo; GlcNAc, N-acetilglukozamino), kiu indikas ke tiuj ejoj povas esti plejparte α-1,2-mannosidase aliro, sed la substrato de GlcNAcT. -1 estas malforta, GlcNAcT-1 estas la ŝlosila enzimo en la formado de heterozigotaj kaj kompleksaj glikanoj en la Golgi-aparato. La stadio kiu malhelpas pretigon estas trajto rilata al la denseco kaj prezento de glikanoj sur la viruspikoj. Ekzemple, la altaj glikozilaj pintoj de HIV-1 Env kaj Lassa viruso (LASV) GPC montras multajn ejojn dominitajn de Man9GlcNAc2 (21-24).
Miksaĵo de oligomanozo kaj kompleksaj glikanoj troveblas ĉe lokoj N61, N122, N603, N717, N801 kaj N1074 (Figuro 2). El la 22 ejoj en la S-proteino, 8 enhavas grandan nombron da oligomanose-tipaj glikanoj, kio reliefigas la diferencon inter la prilaborado de SARS-CoV-2 S-glikanoj kaj la gastiganta glikoproteino (25). La ceteraj 14 ejoj estas dominitaj de prilaboritaj kompleksaj specoj de glikanoj.
Kvankam neokupitaj glikozilaj ejoj estis detektitaj sur SARS-CoV-2 S, ili estis trovitaj konsistigi tre malgrandan parton de la totala peptidbiblioteko dum kvantigado (Tablo S2). En HIV-1 imunogenaj studoj, la malplenoj kreitaj de neokupitaj glikanejoj pruviĝis esti imunogenaj kaj povas kaŭzi distrajn epitopojn (26). La alta okupado de la N-ligita glikansekvenco de SARS-CoV-2 S indikas, ke la rekombina imunogeno ne postulos plian optimumigon por plibonigi ejan okupadon.
Uzante la frostan EM-strukturon de la trimera SARS-CoV-2 S-proteino [Proteina Datumaro (PDB) ID 6VSB] (4), la glikozila stato de la koronavirus-spik-imitisto estis mapita al la eksperimente determinita tridimensia (3D) Strukturo ( Figuro 3). La kombinaĵo de mas-spektrometrio kaj malalt-temperatura EM-analizo malkaŝis kiel N-ligitaj glikanoj kaptas malsamajn areojn sur la tuta surfaco de la pikilo SARS-CoV-2.
Modelaj reprezentaj glikanoj sur la antaŭ-fuzia strukturo de trimera SARS-CoV-2 S glikoproteino (PDB ID 6VSB) (4), kie unu RBD estas en la "supren" formo, kaj la aliaj du RBD estas en la "direkto". Malsupren” konformiĝo. La glikanoj estas kolorigitaj laŭ la enhavo de oligomanozo difinita de la ligo. La ACE2-receptora ligloko estas elstarigita en helbluo. La S1 kaj S2-subunuoj estas reprezentitaj per duontravideblaj surfacoj, respektive, desegnitaj en helgriza kaj malhela grizo. La flekseblaj bukloj kie la N74 kaj N149 glikanejoj situas estas reprezentitaj per grizaj strekitaj linioj, kaj la glikanejoj sur la bukloj estas mapitaj en siaj proksimumaj regionoj.
Oni povas observi, ke la ricevilo-ligejo sur la SARS-CoV-2-spiko estas ŝirmita de la proksimaj glikosilaj ejoj (N165, N234, N343), precipe kiam la ricevilo-liga domajno estas en la "malsupra" formo. Kiel observite en SARS-CoV-1 S (10, 13), HIV-1 Env (27), gripa hemaglutinino (28, 29) kaj LASV GPC, la ŝirmado de receptoraj ligaj lokoj per glikanoj Ĝi estas komuna trajto de virusglikoproteinoj. . (dudek kvar). Konsiderante la funkciajn limigojn de la receptora limigo kaj la malaltan mutacian indicon de ĉi tiuj restaĵoj, povas ekzisti selektema premo uzi N-ligitajn glikanojn por kamufli unu el la plej konservitaj kaj eble vundeblaj regionoj de iliaj respektivaj glikoproteinoj (30, 31).
Ni rimarkis la disvastigon de oligomanose-tipaj glikanoj sur la subunuoj S1 kaj S2. Tio estas kontraste al aliaj virusglikoproteinoj. Ekzemple, densaj glikangrupoj en pluraj HIV-1 Env-trostreĉoj povas indukti oligomanose-specajn glikanojn rekonitajn de antikorpoj (32, 33). En SARS-CoV-2 S, la oligomanoza strukturo verŝajne estos protektita per proteinaj komponantoj, kiel N234-glikanoj (parte krampita inter la N-finaĵo kaj la receptora liganta domajno) (Figuro 3).
Ni karakterizis la N-ligitajn glikanojn sur la plilongigitaj flekseblaj buklostrukturoj (N74 kaj N149) kaj la proksima C-finaĵo de la membrano (N1158, N1173, N1194), kaj ĉi tiuj molekuloj estis nesolvitaj en la krioEM-bildoj (4). Tiuj estis identigitaj kiel kompleksaj glikanoj, kongruaj kun la spaca alirebleco de tiuj restaĵoj.
Kvankam la enhavo de oligomanozglikanoj (28%) (Tabelo S2) estas pli alta ol tiu sur tipaj gastigaj glikoproteinoj, ĝi estas pli malalta ol aliaj virusglikoproteinoj. Ekzemple, unu el la plej dense glikozilataj viruspikproteinoj estas HIV-1 Env, kiu elmontras ~60% oligomanose-specajn glikanojn (21, 34). Ĉi tio indikas, ke kompare kun aliaj virusglikoproteinoj (inkluzive de HIV-1 Env kaj LASV GPC), la glikosiligo de SARS-CoV-2 S-proteino estas pli malforta, kaj la formado de glikanoj estas malpli ŝirmita, kio povas esti utila por ekigi neŭtraligajn antikorpojn Utila. .
Krome, la prilaborado de kompleksaj glikanoj estas grava konsidero en imunogena inĝenierado, precipe konsiderante, ke la epitopo de la neŭtraliga antikorpo kontraŭ SARS-CoV-2 S povas enhavi fukosilatetajn glikanojn ĉe N343 (35). Inter la 22 N-ligitaj glikosilaj ejoj, 52% de la fukosilado kaj 15% de la glikanoj enhavis almenaŭ unu sialacidan restaĵon (Tabelo S2 kaj Figuro S3). Nia analizo montris, ke N343 estas tre fukozilata de 98% de la testaj glikanoj kun fukozaj restaĵoj. La modifo de glikanoj estos grave tuŝita de la ĉela esprimo sistemo uzata. Ni antaŭe pruvis por HIV-1 Env-glikosilado, ke la prilaborado de kompleksaj glikanoj estas pelita de produktadĉeloj, sed la nivelo de oligomanose-glikanoj estas plejparte sendependa de la esprima sistemo kaj rilatas al proteina strukturo. Proksime rilata al glikana denseco (36).
Kiel observite sur LASV GPC kaj HIV-1 Env, la alt-denseca glikana ŝildo havas tielnomitajn manozgrupojn (22, 24) sur la proteinsurfaco (Figuro 4). Kvankam malgrandaj manozo-specaj aretoj estis trovitaj sur la S1-subunuo de Mezorienta Respira Sindromo (MERS) -CoV S (10), ĉi tiu fenomeno ne estis observita kun SARS-CoV-1 aŭ SARS-CoV-2 S proteinoj. La analizo de glikozilado de specifa retejo raportita ĉi tie montras, ke la glikanŝildo SARS-CoV-2 S kongruas kun aliaj koronavirusoj, kaj la tuta glikanŝildo ankaŭ montras multajn vundeblecojn (10). Fine, ni detektis spurajn kvantojn de O-ligita glikosilado ĉe Thr323/Ser325 (T323/S325), kie pli ol 99% de la ejoj estis nemodifitaj (Figuro S4), kio indikas, ke kiam la strukturo estas denaska.
De maldekstre dekstren estas MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) kaj HIV-1 Env (8, 21). La ejospecifa N-ligita glikanoligomanoza kvantigo estas kolorigita laŭ ŝlosilvortoj. Krom LASV GPC, ĉiuj glikoproteinoj estas esprimitaj kiel solveblaj trimeroj en HEK 293F-ĉeloj, dum LASV GPC estas derivita de virus-similaj partikloj de Madin-Darby hundrenaj II-ĉeloj.
Nia glikozila analizo de SARS-CoV-2 disponigas detalan komparnormon por la ejo-specifaj glikanaj trajtoj karakterizaj de nature falditaj trimerpikiloj. Kun la evoluo de pli kaj pli da kandidataj vakcinoj bazitaj sur glikoproteinoj, detala glikananalizo disponigas manieron kompari la integrecon de imunogenoj, kaj ĉar produktadskaloj ekspansiiĝas al klinika uzo, monitorado ankaŭ estos tre grava. Tial, en la fabrikado de serologiaj testaj ilaroj, glikana profilanalizo ankaŭ estos grava indikilo de antigena kvalito. Fine, kun la apero de nukleotid-bazitaj vakcinoj, estas grave kompreni kiel ĉi tiuj liveraj mekanismoj influas la prilaboradon kaj prezenton de imunogenoj.
Ĉi tio estas libera alira artikolo distribuita laŭ la kondiĉoj de la Krea Komunaĵo Atribuite. La artikolo permesas senrestriktan uzon, distribuon kaj reproduktadon en iu ajn medio sub la kondiĉo ke la origina verko estas konvene citita.
Noto: Ni nur petas vin provizi vian retadreson por ke la persono, kiun vi rekomendas al la paĝo, sciu, ke vi volas, ke ili vidu la retpoŝton kaj ke ĝi ne estas spamo. Ni ne kaptos retpoŝtadresojn.
Ĉi tiu demando estas uzata por provi ĉu vi estas vizitanto kaj malhelpi aŭtomatan sendadon de spamado.
Mas-spektrometria analizo rivelis la glikanan konsiston de ĉiuj glikosilaj ejoj sur la pikproteino SARS-CoV-2.
Mas-spektrometria analizo rivelis la glikanan konsiston de ĉiuj glikosilaj ejoj sur la pikproteino SARS-CoV-2.
©2021 Amerika Asocio por la Akcelo de Scienco. ĉiuj rajtoj rezervitaj. AAAS estas partnero de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kaj COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Afiŝtempo: Jan-21-2021
